菜心BrHsfA3 基因克隆及其對高溫脅迫的響應(yīng)

龐強強 孫曉東 周曼 蔡興來 張文 王亞強

（1. 海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，海口 571100；2. 海南省蔬菜生物學(xué)重點實驗室，?？?571100；3. 海南省蔬菜學(xué)院士團隊創(chuàng)新中心，海口 571100）

菜心（Brassica campestrisL. ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee），又名菜薹，是十字花科蕓薹屬白菜亞種的變種［1］。作為我國華南地區(qū)的特產(chǎn)蔬菜之一，其品質(zhì)柔嫩，營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛。菜心生長周期短，復(fù)種指數(shù)高，可周年生產(chǎn)供應(yīng)，在應(yīng)對蔬菜生產(chǎn)淡季上具有重要作用。菜心喜溫但不耐高溫，生長溫度超過30℃就會產(chǎn)生菜薹纖細(xì)、產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降等問題［2-3］。因此，培育耐高溫菜心品種是解決上述問題的根本措施。

熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat stress transcription factor,Hsf）是調(diào)節(jié)生物細(xì)胞內(nèi)熱激反應(yīng)的一類重要因子，在高溫脅迫下通過與熱激元件（Hse）結(jié)合而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄表達［4］。Hsf基因普遍存在于各種植物中，目前已發(fā)現(xiàn)甜瓜有22 個［5］、毛竹有41 個［6］、南瓜有36 個［7］、芥菜有60 個［8］、菜豆有30 個［9］Hsf基因。依據(jù)Hsf結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為A、B和C 三類家族，不同家族又分為多個亞族［10］。首個Hsf基因是從酵母中克隆得到［11］，后來研究者從番茄中獲得了第一個植物的Hsf基因［12］。HsfA3是熱激轉(zhuǎn)錄因子A 類家族的成員，在正常條件下，HsfA3 屬于組成型表達，分布在細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)受到非生物脅迫時，為誘導(dǎo)型表達，且作用在細(xì)胞核中［13-14］。HsfA3基因能夠直接或間接調(diào)控植物的生長發(fā)育和逆境反應(yīng)過程。唐銳敏等［15］研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯StHsfA3在耐熱過程中起到正調(diào)控作用，可能協(xié)同StHsp26-CP和StHsp70來增強過表達轉(zhuǎn)基因株系的耐熱性。擬南芥高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)顯示，HsfA3是唯一在各種高溫脅迫條件下和各個高溫脅迫時期都有穩(wěn)定表達的兩個熱激相關(guān)基因之一［16］，在擬南芥中過表達或異源過表達番茄的HsfA3都可提高其耐熱性［17-18］。除了調(diào)控植物高溫脅迫響應(yīng)過程外，HsfA3還可參與植物的干旱［19］、低溫［20］、鹽［21］、氧化［22］等其他非生物脅迫應(yīng)答。

近年來，本團隊針對菜心耐熱性開展了一系列研究工作［23-25］，建立了菜心高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并從中獲得了1 個差異表達基因。在此基礎(chǔ)上，本研究采用全基因合成法（PCR-based accurate synthesis, PAS）克隆了該差異表達基因的序列，并對其蛋白理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化等進行生物信息學(xué)分析，同時利用RT-qPCR 技術(shù)分析該基因在高溫脅迫下的表達模式，以期為菜心耐高溫機理研究和耐熱育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021年12月-2022年3月在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所蔬菜生物學(xué)重點實驗室進行。供試材料為苗期高溫脅迫鑒定及田間自然高溫鑒定均表現(xiàn)為耐熱的自交系CX1-7 和熱敏的自交系CX7-3［23］。挑選飽滿、大小一致的菜心種子播種于營養(yǎng)缽中，待植株長至3-4 片真葉時進行間苗，每個營養(yǎng)缽中留一株幼苗，每個自交系種植60 株。采用常規(guī)栽培管理方式培養(yǎng)至抽薹開花時，移入25℃/18℃（晝/夜）、12 h/12 h（晝/夜）、光照80%、濕度70%的人工氣候箱中預(yù)培養(yǎng)3 d，之后將其中30 株移入另一人工氣候箱內(nèi)進行高溫脅迫處理，處理溫度為37℃/27℃（晝/夜），除溫度環(huán)境外，其他環(huán)境條件均與預(yù)培養(yǎng)時保持一致。分別取高溫處理0 h（CK）和6 h（T6）的菜心根、葉、薹和花，用液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，試驗均設(shè)3 次重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 合成 參考Trizol 試劑說明書（北京全式金生物技術(shù)有限公司）分別提取菜心根、葉、薹和花的總RNA。利用cDNA 合成試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）去除基因組DNA 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 基因克隆及生物信息學(xué)分析 從菜心高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲取基因片段后委托武漢天一輝遠生物科技有限公司進行全基因合成，得到基因全長序列。采用ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測氨基酸序列。采用Expasy 服務(wù)器中的Protparam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）和ProtScale 工具（https://web.expasy.org/ protscale/）預(yù)測蛋白的基本理化性質(zhì)。采用NetPhos 在線網(wǎng)站（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）分析蛋白的磷酸化位點；采用SignalP-5.0 在線網(wǎng)站（https://services.healthtech.dtu. dk/service.php?SignalP-5.0）預(yù)測蛋白的信號肽。采用NCBI-CDS 在線網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。使用Heatster 在線工具（https://applbio.biologie.uni-frankfurt.de/hsf/ heatster/hsf_visualization_tool.php）對保守結(jié)構(gòu)域進行注釋。采用SOPMA 在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma. html）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。采用Swiss-Model 在線網(wǎng)站（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。將克隆獲得的片段在NCBI 在線網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）用Blastp 進行同源序列搜索，選取和下載同源性高、可靠性強的蛋白序列，采用MEGA6.0 軟件中的鄰接法（neighbor- joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，重復(fù)計算次數(shù)設(shè)為1 000。

1.2.3 基因表達特性分析 分別將獲得的菜心根、葉、薹、花的cDNA 稀釋至100 ng/μL 作為RT-qPCR模板。以BrActin基因為內(nèi)參基因［25］，根據(jù)菜心BrHsfA3基因序列設(shè)計特異性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列信息見表1。參考北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransStart? TopGreen qPCR SuperMix 試劑盒說明書進行熒光定量分析，目的基因的表達量用2-△△Ct法來計算，每個基因的表達反應(yīng)重復(fù)3 次。

表1 基因克隆和表達分析引物Table 1 Primers used for gene cloning and expression analysis

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 采用SPSS22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，單因素分析采用Duncan 法，采用Excel2007 進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 菜心BrHsfA3基因克隆

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組獲得的菜心c27244.graph_c0 基因片段，通過全基因合成方法，獲得了ORF 序列長度為906 bp 的基因片段，編碼301 個氨基酸，含起始密碼子ATG 和終止密碼子TAA（圖1）。在擬南芥基因組網(wǎng)站進行BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥中AtHsfA3基因最為相似，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果，將其命名為BrHsfA3。

圖1 BrHsfA3 的ORF 序列及氨基酸序列Fig. 1 ORF sequences and amino acid sequences of BrHsfA3

2.2 BrHsfA3蛋白理化性質(zhì)分析

采用Proparam 在線網(wǎng)站分析了BrHsfA3基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，該蛋白分子式為C1488H2307N415O475S16，原子總數(shù)為4 701，相對分子量為34.12 kD，理論等電點為5.00，脂肪系數(shù)為55.42，平均疏水性為-0.827，不穩(wěn)定系數(shù)為56.06。ProtScale 分析結(jié)果表明，BrHsfA3 蛋白質(zhì)存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，其中在第5 位最高，為1.989；第44 位最低，為-3.022；表明BrHsfA3 蛋白為親水性蛋白（圖2）。NetPhos 磷酸化修飾預(yù)測分析表明，BrHsfA3 蛋白存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3 個磷酸化位點（圖3），其中絲氨酸磷酸化位點21 個，蘇氨酸磷酸化位點20 個，酪氨酸磷酸化位點3 個。利用SignalP-5.0 預(yù)測BrHsfA3 信號肽發(fā)現(xiàn)，該蛋白無信號肽（圖4），為非分泌蛋白。

圖2 BrHsfA3 蛋白疏水性/親水性預(yù)測Fig. 2 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of BrHsfA3 protein

圖3 BrHsfA3 蛋白氨基酸翻譯后磷酸化修飾預(yù)測Fig. 3 Prediction of phosphorylation site after amino acid translation of BrHsfA3 protein

圖4 BrHsfA3 蛋白信號肽預(yù)測Fig. 4 Prediction of the signal peptide prediction of BrHsfA3 protein

2.3 BrHsfA3蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

采用NCBI-CDS 在線網(wǎng)站分析BrHsfA3基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白有1 個特殊位點，屬于Hsf_DNA-bind 超級家族，具有1 個Hsf 保守結(jié)構(gòu)域（圖5-A）。在靠近N 端第11-51 位含有氨基酸殘基形成的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD），第69-137位氨基酸殘基形成的寡聚化結(jié)構(gòu)域（OD），第146-156 位氨基酸殘基形成的核定位信號（NLS），C 端第271-277 位氨基酸殘基形成的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AHA）（圖5-B）。對BrHsfA3 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，BrHsfA3 蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有豐富的α-螺旋和無規(guī)則卷曲，其中參與形成α-螺旋的氨基酸有138 個，占總氨基酸的45.85%；142 個氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲，占總氨基酸的47.18%；參與形成延伸鏈的氨基酸有12 個，占總氨基酸的3.99%；9個氨基酸參與形成β-轉(zhuǎn)角，占總氨基酸的2.99%（圖6）。利用Swiss-Model 工具得到了BrHsfA3 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符，含有大量α-螺旋和無規(guī)則卷曲（圖7）。

圖5 BrHsfA3 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及功能結(jié)構(gòu)域Fig. 5 Conservative domains and functional domain of BrHsfA3 protein

圖6 BrHsfA3 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 6 Prediction of BrHsfA3 protein secondary structure

圖7 BrHsfA3 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 7 Prediction of the three-dimensional structure of BrHsfA3 protein

2.4 BrHsfA3基因系統(tǒng)進化分析

Blastp 同源性檢索發(fā)現(xiàn)BrHsfA3 與22 種植物的HsfA3 蛋白相似性較高，這些植物為甘藍型油菜（Brassica napus, KAH0907994.1）、 蕪 菁（B. rapa，XP_009122679.1）、 花 椰 菜（B. oleraceavar.Oleracea, XP_013611350.1）、 蘿 卜（Raphanus sativus,XP_018445490.1）、琴葉鼠耳芥（Arabidopsis lyrata subsp.Lyrata, XP_002873110.1）、 擬 南 芥（A.thaliana, NP_001318473.1）、 薺 菜（Capsella rubella,XP_006287844.1）、 亞 麻 薺（Camelina sativa,XP_019089984.1）、 棉 花（Gossypium hirsutum, XP_016691460.2）、白櫟（Quercus lobata，XP_03092673 0.1）、三裂葉薯（Ipomoea triloba, XP_031131419.1）、木槿（Hibiscus syriacus，XP_039026314.1）、木薯（Manihot esculenta, XP_021619963.1）、花生（Arachis hypogaea, XP_025634986.1）、 蘋 果（Malus domestica,XP_017191546.1）、狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius, XP_019426589.1）、 梨（Pyrusx bretschneideri,XP_009365327.1）、 葡 萄（Vitis vinifera, RVW482 07.1）、煙草（Nicotiana attenuata, XP_019250820.1）、牽?；ǎ↖pomoea nil, XP_019179577.1）、豇豆（Vigna unguiculata, XP_027936489.1）、 胡 楊（Populus euphratica, XP_011016541.1）。系統(tǒng)進化分析結(jié)果（圖8）顯示，BrHsfA3和甘藍型油菜、蕪菁、花椰菜、蘿卜等十字花科作物處于同一分支，說明其親緣關(guān)系較近。此外，蘋果、梨、白櫟、葡萄等聚為一支，煙草、三裂葉薯和牽?；ň蹫橐恢?，棉花、木槿、木薯和胡楊聚為一支，花生、狹葉羽扇豆和豇豆聚為一支，亞麻薺、薺菜、擬南芥和琴葉鼠耳芥聚為一支，表明HsfA3基因具有較高的保守性，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與其進化情況基本一致。

圖8 菜心與其他科屬植物HsfA3 氨基酸序列的分子系統(tǒng)進化樹系統(tǒng)樹Fig. 8 Phylogenetic tree of HsfA3 amino acid sequence from flowering Chinese cabbage and other plants

2.5 BrHsfA3基因在高溫脅迫下的表達模式分析

從菜心高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中提取了BrHsfA3基因在高溫脅迫前后的FPKM 值，由圖9 可知，在正常溫度條件下，BrHsfA3在熱敏和耐熱自交系葉片中的表達量基本一致，高溫處理6 h 時，BrHsfA3基因在耐熱自交系CX1-7 葉片中的FPKM 值較對照明顯增加，熱敏自交系CX7-3 葉片中無顯著變化。為進一步驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的正確性，采用RT-qPCR 技術(shù)分析了BrHsfA3基因在高溫脅迫下的表達特性（圖10）。在正常溫度條件下，BrHsfA3基因在菜心的根、葉、薹和花中均有表達，其中BrHsfA3基因在熱敏自交系CX7-3 的根中相對表達量最高，其次是薹、葉，花中的相對表達量最低；BrHsfA3基因在耐熱自交系CX1-7 的不同組織中的相對表達量由高到低依次為薹>葉>根>花。高溫處理后，BrHsfA3基因在熱敏自交系CX7-3 的根中表達量顯著上調(diào)，在葉、薹和花中的表達量無顯著差異；在耐熱自交系CX1-7 葉和花中的BrHsfA3基因表達量受高溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)，根和薹中的表達量無顯著差異。單獨來看，BrHsfA3基因在熱敏自交系 CX7-3 和耐熱自交系CX1-7 高溫處理前后葉片中的RT-qPCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中的表達情況類似，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是真實可靠的。

圖9 BrHsfA3 基因在高溫脅迫處理下的FPKM 值Fig. 9 FPKM value of BrHsfA3 gene under heat stress

圖10 BrHsfA3 基因在高溫脅迫前后不同組織的相對表達量Fig. 10 Relative expressions of BrHsfA3 gene in different tissues under heat stress

3 討論

菜心作為喜溫蔬菜，在生長的各個階段都容易遭受高溫傷害，嚴(yán)重影響其生長發(fā)育，是造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要非生物脅迫之一［26］。因此，闡明菜心高溫脅迫響應(yīng)機制，挖掘耐熱基因，對于加速菜心耐熱育種具有重要意義。越來越多的證據(jù)表明，熱激轉(zhuǎn)錄因子在植物生長和非生物脅迫防御過程中具有重要作用［27-29］。

為了研究菜心耐高溫脅迫的分子機制，本研究克隆得到了BrHsfA3基因。序列分析顯示，BrHsfA3基因的ORF 長度為906 bp，編碼301 個氨基酸。理化性質(zhì)分析顯示，BrHsfA3 蛋白相對分子量為34.12 kD，理論等電點為5.00，具有明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，為無信號肽的親水性蛋白，存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3 個磷酸化位點。氨基酸序列分析表明，該蛋白序列具有典型的Hsf 家族保守結(jié)構(gòu)域，在N端含有高度保守的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和寡聚化結(jié)構(gòu)域，在氨基酸序列的中部含有核定位信號結(jié)構(gòu)域，C 端含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，缺少核輸出信號結(jié)構(gòu)域（NES），這種類似結(jié)構(gòu)在辣椒CaHsfA3 中也有發(fā)現(xiàn)［30］。Hsf 蛋白結(jié)構(gòu)的不同決定了各族轉(zhuǎn)錄因子行使的功能存在差異，A 類Hsfs主要負(fù)責(zé)熱激基因的表達調(diào)控，B 類和C 類Hsfs 缺少AHA 基元不具備激活功能［31］，因此推測BrHsfA3也可能具有轉(zhuǎn)錄活性和激活功能，這需要在后續(xù)研究中予以重點關(guān)注。BrHsfA3 蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，無規(guī)則卷曲和α-螺旋占比較高，這與前人在馬鈴薯［15］上的研究結(jié)果一致。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，BrHsfA3 氨基酸序列與甘藍型油菜的親緣關(guān)系最近，表明BrHsfA3可能與甘藍型油菜BnaHsfA3具有相似的功能和作用機制。

在正常生長環(huán)境中，Hsfs幾乎處于低活性或無活性狀態(tài)，但當(dāng)遭受不利于生長發(fā)育的情況時，Hsfs活性被迅速激發(fā)，特異性識別并與熱激元件結(jié)合，從而激活體內(nèi)的防御系統(tǒng)，以提高自身的抗性，減輕脅迫造成的傷害。由于每個植物熱激轉(zhuǎn)錄因子的種類和結(jié)構(gòu)不同，因此在脅迫響應(yīng)機制和生長發(fā)育調(diào)控中的功能具有多樣性［32-33］。HsfA3 是植物形成耐熱性的重要因子之一［13，34］。已有研究表明，HsfA3 位于信號傳遞鏈的末端，擬南芥AtHsfA3是Dreb2A和Dreb2C的下游基因，其表達受它們的直接調(diào)控，從而提高植株耐熱性［35］。為了預(yù)測BrHsfA3基因的生物功能，本研究結(jié)合菜心高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和RT-qPCR 技術(shù)，分析了BrHsfA3基因在高溫下的表達模式，結(jié)果顯示BrHsfA3基因的在菜心根、葉、薹和花中均有表達。在正常溫度條件下，熱敏自交系CX7-3 根中的表達量明顯高于葉、薹和花，耐熱自交系CX1-7 的薹和葉中表達量顯著高于根、花。多數(shù)研究證明，HsfA3基因的表達對番茄［18］、多年生黑麥草［36］和甘藍型油菜［37］的耐熱性起正向調(diào)控作用，本研究中高溫脅迫下耐熱自交系葉、花和熱敏自交系根中表達量均顯著上調(diào)也直接證明了這一觀點。另外，對比BrHsfA3在不同自交系間的表達量發(fā)現(xiàn)，除根中外，耐熱自交系CX1-7 的葉、薹和花中在高溫前后的表達量始終高于熱敏自交系CX7-3，這與茄子SmHsfA3基因在葉片中的研究結(jié)果類似［38］。根中表達量則在熱敏自交系中較高，推測產(chǎn)生的原因可能是由于Hsf基因介導(dǎo)的耐熱調(diào)控機制非常復(fù)雜，BrHsfA3基因在不同耐熱性植株的不同組織中對高溫脅迫響應(yīng)機制存在差異，耐熱性的形成是由不同的Hsf基因共同作用的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究成功克隆得到菜心BrHsfA3基因，該基因ORF 全長為906 bp，編碼301 個氨基酸。該蛋白相對分子量為34.12 kD，理論等電點為5.00，為無信號肽的親水性蛋白，存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3 個磷酸化位點，具有1 個Hsf 保守結(jié)構(gòu)域和典型的DBD、OD、NLS 和AHA 結(jié)構(gòu)域，含有豐富的α-螺旋和無規(guī)則卷曲。BrHsfA3與甘藍型油菜BnaHsfA3同源性最高。BrHsfA3基因在菜心不同耐熱性植株及其不同組織中均有表達，在正常溫度條件下，不同組織中耐熱自交系CX1-7 的表達量由大到小依次為薹>葉>根>花，熱敏自交系CX7-3 的表達量由大到小依次為根>葉>薹>花。高溫脅迫處理后，耐熱自交系CX1-7 的葉、花中和熱敏自交系CX7-3 的根中表達量均顯著上調(diào)，其余組織中該基因的表達不受高溫影響。