俞晨秀,孫 莉,孫益民,秦亞東,高 煥
((1.安徽中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校藥學(xué)系,安徽 蕪湖 241000;2.蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)中心,安徽 蕪湖 241000;3.安徽師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)
近年來,茶黃素功效的報(bào)道日益增多,其研究也備受關(guān)注。茶黃素因其在乙酸乙酯中呈現(xiàn)黃色而得名[1],它是Roberts在1957年從紅茶中分離并鑒定獲得,是茶葉中多酚類物質(zhì)氧化聚合而成的一類多酚羥基具苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的物質(zhì)[2],是形成紅茶茶湯“黃金圈”的物質(zhì),對(duì)紅茶茶湯鮮爽度和強(qiáng)度等滋味起著重要作用[3]。茶黃素具有良好的抗氧化性[4]、抗炎癥[5-6]、抗尿酸[7]、抗病毒[8]、抗菌[9]、抗腫瘤等作用[10-12]。到目前為止,各類茶黃素有28種之多[13],其中最主要的單體有4種化合物,即茶黃素(Theaflavins,TF)、茶黃素-3-單沒食子酸酯(Theaflavin-3-gallate,TF-3-G)、茶黃素-3'-單沒食子酸酯(Theaflavin-3'-gallate,TF-3'-G)、茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯(Theaflavin-3,3-digallate,TFDG)。
茶黃素結(jié)構(gòu)式見圖1。
圖1 茶黃素結(jié)構(gòu)式
在這4種單體中及總的28種中,茶黃素是具有最基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的單體,其穩(wěn)定性與其他單體的穩(wěn)定性密切相關(guān)。因此,研究茶黃素的穩(wěn)定性能較好反映其他單體的穩(wěn)定性。在茶黃素中有多個(gè)酚羥基、多個(gè)環(huán)和大共軛體系,這種結(jié)構(gòu)有著怎樣的穩(wěn)定性無疑是茶黃素提取、分離和應(yīng)用中需要考慮的,而這方面系統(tǒng)的專題研究卻未見報(bào)道。研究了TF在多種環(huán)境下的穩(wěn)定性,以期為茶黃素的開發(fā)應(yīng)用和深入研究中提供一定的參考依據(jù)。
茶黃素(TF),純度99.636%,成都瑞芬思生物科技有限公司提供;乙酸、EDTA-2Na、抗壞血酸、三氯化鐵、硝酸銀、鹽酸均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;甲醇、乙腈均為色譜純,德國(guó)默克公司提供;水(娃哈哈純凈水)。
Agilent HPLC-1260型高效液相色譜儀、DAD檢測(cè)器,美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品;DV215CD型精密電子天平,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;RA24型電熱恒溫水浴鍋,北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品;FYL-YS-310L型冰箱,北京福意電器有限公司產(chǎn)品;PHS-25型pH計(jì),上海今邁儀器儀表有限公司產(chǎn)品;JK-250DB型數(shù)控超聲波清洗器,合肥金尼克機(jī)械制造有限公司產(chǎn)品;20 W家用日光燈,PAK/三雄極光產(chǎn)品。
1.3.1 茶黃素水溶液的配制
精密稱取一定量的茶黃素(TF)(萬分之一天平稱取),用40℃水溶解,配成約40μg/mL的溶液。
1.3.2 茶黃素不同pH值溶液的配制
pH值約為4的茶黃素溶液(茶黃素水溶液:pH值為3的鹽酸=9∶1),pH值約為5的茶黃素溶液(茶黃素水溶液:pH值為4的鹽酸=9∶1),pH值約為7的茶黃素溶液(1.3.1中所配茶黃素水溶液),pH值約為8的茶黃素溶液(茶黃素水溶液:pH值為9的氫氧化鈉=9∶1),pH值約為9的茶黃素溶液(茶黃素水溶液:pH值為10的氫氧化鈉=9∶1),溶液均過0.45μm膜。
1.3.3 不同濃度Fe3+的茶黃素溶液的配制
分別取1 mmol/L的三氯化鐵溶液0.1,0.2,0.3,0.4 mL于4支5 mL容量瓶中,用茶黃素水溶液(見1.3.1)稀釋至刻度,配成含不同濃度Fe3+的茶黃素溶液,搖勻后過0.45μm膜。
1.3.4 穩(wěn)定溶液的配制
依據(jù)GB/T 31740.3—2015[7]配制穩(wěn)定溶液,分別將EDTA-2Na溶液25 mL,抗壞血酸溶液25 mL,乙腈50 mL加入500 mL容量瓶中,用水定容至刻度,搖勻。
(1)EDTA-2Na溶液。10 mg/mL(現(xiàn)配)。精密稱取EDTA-2Na 1.0 g,用水稀釋至100 mL。
(2)抗壞血酸溶液。10 mg/mL(現(xiàn)配)。精密稱取抗壞血酸1.0 g,用水稀釋至100 mL。
1.3.5 茶黃素的穩(wěn)定液溶液
稱取一定量的茶黃素(TF),用穩(wěn)定溶液稀釋至刻度,搖勻后過0.45μm膜。
1.3.6 茶黃素溶液的含量變化測(cè)試
茶黃素含量測(cè)定采用高效液相色譜法,依據(jù)GB/T 31740.3—2015[7]測(cè)定中的色譜條件和梯度條件,以常溫下同批次標(biāo)準(zhǔn)品水溶液的吸收峰面積為100%含量,比較不同環(huán)境下樣品的峰面積變化值,來確定含量的變化。
茶黃素(TF)標(biāo)準(zhǔn)品純度高,測(cè)試其HPLC色譜圖中峰數(shù)單一,峰形尖銳;基線平直,零點(diǎn)吻合,因此可以作為試驗(yàn)中參比的標(biāo)準(zhǔn)。
HPLC色譜圖見圖2。
圖2 HPLC色譜圖
試驗(yàn)結(jié)果顯示,茶黃素水溶液在40℃以下較穩(wěn)定,50℃以上加熱30 min分解明顯,吸收峰面積(響應(yīng)值)只有空白樣的49.76%,80℃以上加熱30 min吸收峰面積為0,表明此時(shí)已經(jīng)全部分解完全,可見溫度對(duì)茶黃素水溶液的穩(wěn)定性影響非常大,溫度越高影響越大。
溫度對(duì)茶黃素水溶液穩(wěn)定性的影響曲線見圖3。
圖3 溫度對(duì)茶黃素水溶性穩(wěn)定性的影響曲線
試驗(yàn)結(jié)果顯示,茶黃素水溶液在pH值為4~7,酸性和中性條件下比較穩(wěn)定,在pH值〉8的堿性條件下不穩(wěn)定,pH值=8時(shí)吸收峰面積(響應(yīng)值)只有空白樣的26.74%,這與酚類化合物自身是弱酸性物質(zhì),在酸性和中性條件下較穩(wěn)定的推測(cè)一致。
pH值對(duì)茶黃素水溶性穩(wěn)定性的影響曲線見圖4。
圖4 p H值對(duì)茶黃素水溶性穩(wěn)定性的影響曲線
試驗(yàn)結(jié)果顯示,F(xiàn)e3+極易與茶黃素反應(yīng),當(dāng)Fe3+的濃度為0.02 mmol/L的極低濃度時(shí),茶黃素仍然與Fe3+有明顯的反應(yīng)。
不同濃度Fe3+存在下的吸收峰面積見圖5。
圖5 不同濃度Fe3+存在下的吸收峰面積
試驗(yàn)結(jié)果顯示,茶黃素水溶液在冬天10~20℃下放置有緩慢的分解,8 d后茶黃素的吸收峰面積是空白樣的87.55%;在低功率照射下(20 W日光燈),茶黃素的吸收峰面積變化曲線與室溫下面積變化曲線基本一致,照射8 d后茶黃素的吸收峰面積是空白樣的89.91%,與87.55%接近,說明低功率照射對(duì)茶黃素水溶液的穩(wěn)定性基本無影響;穩(wěn)定液中的茶黃素在10~20℃下放置8 d幾乎不分解,8 d后吸收峰面積是空白樣的101.58%,沒有降低,說明有穩(wěn)定液存在對(duì)茶黃素的穩(wěn)定性起到了一定的保護(hù)作用。
3種條件下的吸收峰面積變化曲線見圖6。
圖6 3種條件下的吸收峰面積變化曲線
茶黃素(TF)由中間的苯與七員雙烯環(huán)酮并合結(jié)構(gòu),另2個(gè)苯與四氫吡喃并合結(jié)構(gòu)共3個(gè)部分構(gòu)成。中間的并合結(jié)構(gòu)是大共軛體系,七員雙烯環(huán)酮上有一個(gè)烯醇式結(jié)構(gòu);另2個(gè)并合結(jié)構(gòu)通過單鍵與中間并合結(jié)構(gòu)相連,在2個(gè)并合結(jié)構(gòu)與單鍵連接的兩旁都有氧吸電子基,這些因素使得單鍵上電子云向兩端轉(zhuǎn)移而容易斷裂,當(dāng)溫度升高有可能發(fā)生斷鍵的分解作用。從溫度增加吸收峰面積降低,HPLC法測(cè)定中的吸收峰數(shù)目增多,說明了分解反應(yīng)的發(fā)生。
在茶黃素中有多個(gè)酚羥基而顯示弱酸性[14],因此茶黃素在酸性和中性中穩(wěn)定,而在堿性中試驗(yàn)結(jié)果是吸收峰面積下降明顯,吸收峰數(shù)目明顯增多,可能是茶黃素發(fā)生了開環(huán)和斷鍵反應(yīng),具體原因還不清楚。
酚能與三氯化鐵發(fā)生顯色反應(yīng)[15],茶黃素中有多個(gè)酚羥基,所以茶黃素極易與Fe3+發(fā)生反應(yīng),反應(yīng)屬于配位反應(yīng)[16],從反應(yīng)的現(xiàn)象由淡黃色變?yōu)榈仙颊f明了該反應(yīng)的特點(diǎn)。
酚具有易氧化的性質(zhì)[15],烯醇式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,茶黃素的多酚結(jié)構(gòu)和烯醇式結(jié)構(gòu)使得茶黃素的水溶液容易被氧化,在實(shí)驗(yàn)室常溫密閉放置下也會(huì)緩慢被氧化;加入了由抗氧化劑(VC)和金屬離子配合物(EDTA)組成的穩(wěn)定液,因穩(wěn)定液能參與氧化,結(jié)合大部分金屬離子,因此它們能提高茶黃素的穩(wěn)定性;低功率照射則因照射能力低而幾乎沒有影響。
茶黃素(TF)是由3個(gè)并合結(jié)構(gòu)通過單鍵連接的多酚物質(zhì),易發(fā)生分解和氧化及與Fe3+的配位反應(yīng),在加熱、堿性和Fe3+存在下不穩(wěn)定,因此,茶黃素在使用時(shí)要盡量選擇低溫、酸性和無Fe3+影響的條件下,避免加熱、堿性和Fe3+的影響,普通日光燈照射基本不影響,穩(wěn)定液對(duì)茶黃素水溶液的穩(wěn)定性有一定的保護(hù)作用。