基于Tris輔助法制備豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條

文海燕，嚴(yán) 昊，潘 艷，馮建遠(yuǎn)，江明生*，陳海蘭*

(1.廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，廣西南寧 530007；3.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)金光有限公司，廣西南寧 530042)

豬輪狀病毒(Porcine rotavirus,PoRV)是含11個雙鏈RNA的雙股RNA病毒，基因組分11個基因節(jié)段，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7)和5或6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5和NSP6)，PoRV的11個基因之間均易發(fā)生重配事件。該病毒通過糞-口途徑傳播，仔豬易感，可引起仔豬精神煩躁、嘔吐、厭食以及嚴(yán)重腹瀉等，在引起仔豬生長緩慢的同時，導(dǎo)致高病死率[1]。育成豬和成年豬通常為隱性感染，引起急性胃腸炎，表現(xiàn)為食欲下降、冷漠和不同程度的腹瀉[2]。在腹瀉仔豬中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)病毒、細(xì)菌和寄生蟲混合豬輪狀病毒感染。PoRV感染仔豬呈世界性流行，各國豬場中陽性率為3.3%～67.3%，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。國內(nèi)的病原學(xué)檢測結(jié)果顯示，PoRV在我國規(guī)?；i場中普遍存在，仔豬腹瀉糞便中陽性率為7.69%～28.76%[3-4]。目前，尚無針對該病毒的有效治療藥物，雖然開發(fā)出了相應(yīng)的疫苗，國內(nèi)臨床應(yīng)用最廣泛的疫苗是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的胃-腹-輪腹瀉三聯(lián)弱毒苗，但由于PoRV區(qū)域流行不同和遺傳多樣性，導(dǎo)致該病毒不能完全被控制，因此，當(dāng)前疫苗的保護(hù)作用較有限[5]。輪狀病毒基因群、基因型多樣及該病毒與豬其他引起腸道癥狀病毒發(fā)病癥狀相似，在臨床上難以辨別，故對本病毒快速準(zhǔn)確檢測方法的建立顯得尤為重要。

目前，豬輪狀病毒的臨床檢測多是借助實驗室對病原檢測分析，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、實時熒光定量RT-PCR(RT-qPCR)和逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)、原位雜交技術(shù)、納米孔測序等[6]。ELISA靈敏度較高，但需時間長，操作較繁瑣[7-9]。后幾種檢測技術(shù)具備很高的靈敏度和特異性，但費用較高，且對操作人員技術(shù)和檢測環(huán)境要求較高[11]。上述技術(shù)對儀器設(shè)備的高要求，限制了其在現(xiàn)場或臨床診斷中的使用[9]。免疫層析技術(shù)始于20世紀(jì)后期，是一種將色譜層析和免疫技術(shù)相結(jié)合的快速檢測技術(shù)[10]。其中，最經(jīng)典的一種標(biāo)記檢測技術(shù)是膠體金免疫層析技術(shù)[11]。傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)，依靠大量金顆粒(AuNPs)聚集達(dá)到肉眼可見效果，但由于其檢測周期短、成本低、對儀器設(shè)備和人員沒有特殊要求，在即時快速檢測方面發(fā)揮著不可替代的作用，發(fā)展前景廣闊。膠體金免疫層析技術(shù)是否可以成功建立，膠體金的質(zhì)量是決定性因素之一，因為膠體金的質(zhì)量好壞會影響后期標(biāo)記的效果、顯色、靈敏度、特異性等。近幾年，路飛雪等學(xué)者證明在預(yù)熱的檸檬酸鈉溶液中加入三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(tris hydrochloride)，可以在水介質(zhì)中獲得高純度、單分散的球形金納米粒子(AuNPs)，且其粒徑均勻，穩(wěn)定性好[12]。本試驗通過改良標(biāo)記膠體金的制備方法，采用Tris輔助法制備優(yōu)質(zhì)膠體金，標(biāo)記輪狀病毒檢測抗體作為標(biāo)簽，研制一種用于糞便樣品中豬輪狀病毒檢測的膠體金免疫層析試紙條，并考察該試紙條的性能。該試紙條具備良好的靈敏性、特異性和穩(wěn)定性，可在10 min內(nèi)完成檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 臨床樣品和豬輪狀病毒陽性糞便，由南寧諸福萊動物健康管理有限公司收集和保存。特異性樣品、陰性樣品和陽性樣品，由廣西大學(xué)動物科技學(xué)院收集和保存。

1.1.2 抗體 A群輪狀病毒單克隆抗體Ab1(3.18 mg/mL)、Ab2(4.9 mg/mL)，美國Meridian公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 羊抗鼠IgG(10 mg/mL)，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、檸檬酸鈉、四氯金酸，美國Sigma公司產(chǎn)品；碳酸鉀(K2CO3)、二甲基硅油、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(tris hydrochloride)，索萊寶科技(北京)有限公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)，德國Sartorius公司產(chǎn)品；樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙、聚氯乙烯底板(PolyVinyl Chloride，PVC)，上海金標(biāo)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；微電腦自動斬切機(jī)、數(shù)控裁條機(jī)、三維劃膜噴金儀，上海金標(biāo)生物科技有限公司產(chǎn)品；粒徑與電位測定儀，馬爾文帕納科有限公司產(chǎn)品；日立透射電子顯微鏡，日本日立公司產(chǎn)品；紫外可見光分光光度計，日本島津儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫磁力攪拌器，艾卡儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超純水儀，中國越純有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；通風(fēng)櫥，湖南朗圣實驗室技術(shù)發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 膠體金的制備 采用檸檬酸鈉還原法和Tris輔助法制備膠體金。

(1)檸檬酸鈉還原法制備膠體金：在250 mL三角燒瓶中，加入99 mL的超純水、1 mL 10 mg/mL的四氯金酸溶液和磁力攪拌子1個，在磁力攪拌器上加熱至沸騰，加入1 mL 10 mg/mL檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌15 min，繼續(xù)煮沸10 min出現(xiàn)透明的橙紅色，之后顏色不再變化，自然冷卻至室溫，用超純水定容至原液面高度處，常溫避光保存。

(2)Tris輔助法制備膠體金：取140 mL純凈水于三口燒瓶中，放入攪拌子，將三口燒瓶放置在油浴鍋中油浴(二甲基硅油)加熱，設(shè)定恒溫磁力攪拌器溫度為137 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為900 r/min，油浴溫度100 ℃，將10 mL 10 mg/mL檸檬酸鈉溶液加入三口燒瓶中，繼續(xù)加熱40 min，溫度穩(wěn)定于137 ℃左右，注入1 mL 10 mg/mL四氯金酸溶液，60 s后，再將5 mL 0.1 mol/L Tris溶液注入三口燒瓶的漩渦中心處，30 min后，溫度設(shè)置成100 ℃，開啟通風(fēng)櫥加速降溫，油浴溫度降至100 ℃，快速將1 mL 10 mg/mL四氯金酸注至三口燒瓶中的漩渦中心處，反應(yīng)30 min。重復(fù)上一步驟，反應(yīng)結(jié)束后停止加熱，在攪拌狀態(tài)下自然冷卻至室溫，避光保存。觀察上述兩種方法所制膠體金的顏色等外觀特征，利用紫外分光光度計掃描其紫外吸收圖譜，通過粒徑分析儀測定粒徑大小及分布情況，采用透射電鏡測定其均一性和顆粒大小。

1.2.2 膠體金最適標(biāo)記pH的確定 取1 mL膠體金溶液和5 μg Ab2抗體，于6只1.5 mL透明玻璃瓶，分別加入不同體積的K2CO3(0.1 mol/L)調(diào)整pH，確定最適標(biāo)記pH。

1.2.3 膠體金最適標(biāo)記蛋白濃度的確定 取1 mL膠體金溶液和2 μL K2CO3(0.1 mol/L)，于6只1.5 mL透明玻璃瓶，分別加入不同體積的Ab2抗體，確定最適標(biāo)記蛋白濃度。

1.2.4 靈敏度試驗 制備不同濃度的陽性樣品，稀釋度分別為1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶1 000,并以樣品稀釋液陰性對照，豬輪狀病毒陽性糞便為陽性對照。取60 μL不同濃度各組樣品分別滴加到樣品墊上，靜置10 min，肉眼觀察檢測結(jié)果并拍照，確定試紙的檢測靈敏性。

1.2.5 特異性試驗 分別用試紙條檢測豬傳染性胃腸炎病毒、豬皰疹病毒1型、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒4種臨床癥狀相似的病毒以及大腸埃希氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、錫那羅州弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、無乳鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌等細(xì)菌，通過觀察結(jié)果，分析試紙條的特異性。

1.2.6 重復(fù)性試驗 從同一批制備的試紙條中隨機(jī)抽取4根試紙條，對陰性樣品和高、中、低濃度的陽性樣品進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，考察試紙條的批內(nèi)重復(fù)性。從3個不同批次制備的試紙條中，分別抽取4根對陰性樣品和高、中、低濃度的陽性樣品進(jìn)行檢測，考察試紙條的批間重復(fù)性。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗 將同一批次的試紙條分別在4 ℃、室溫和37 ℃條件下干燥避光保存，并分別在第7、14、21、56天，抽取6根試紙條，對陰性和不同濃度陽性樣品進(jìn)行檢測(稀釋倍數(shù)分別為1∶10，1∶50，1∶100，1∶300，1∶500)，此后每3個月重復(fù)此操作，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。

1.2.8 臨床樣品的檢測 用滅菌棉拭子蘸取糞便臨床樣品，于1 mL樣品稀釋液中，5 000 r/min離心10 min，取上清，用制備的膠體金試紙條，對50份臨床樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 膠體金顆粒的表征

檸檬酸鈉還原法和Tris輔助法制備膠體金溶液表征如圖1所示，其中圖1A和圖1B圖表明，采用上述兩種方法制備的金溶液，分別呈紫紅色和清澈透亮的酒紅色。圖1C和圖1D圖表明，Tris輔助法所制備的膠體金，顆粒大小均勻，呈圓球狀；檸檬酸鈉還原法制備的膠體金，顆粒大小不一，呈橢圓形。圖1E圖表明，Tris輔助法制備膠體金，粒徑集中40 nm。圖1F圖表明，Tris輔助法制備膠體金，紫外吸收峰波長為520 nm。

A.檸檬酸鈉還原法制備的膠體金溶液顏色；B.Tris輔助法制備的膠體金溶液顏色；C.檸檬酸鈉還原法制備的膠體金透射電鏡圖(30 000×)；D.Tris輔助法制備的膠體金透射電鏡圖(30 000×)；E.Tris輔助法制備的膠體金粒徑圖；F.Tris輔助法制備的膠體金紫外可見吸收圖譜

2.2 膠體金最適標(biāo)記pH的確定

如圖2結(jié)果顯示，當(dāng)1 mL膠體金溶液中添加2 μL K2CO3(0.1 mol/L)時，C、T線最清晰，膜面干凈，無假陽性。當(dāng)1 mL膠體金溶液中添加4 μL K2CO3(0.1 mol/L)時，金溶液滯留表面，膜面呈淺紅色。根據(jù)C、T線顯色程度及膜面干凈程度，后續(xù)試驗選擇1 mL膠體金溶液中添加2 μL K2CO3。

2.3 膠體金最適標(biāo)記蛋白濃度的確定

如圖3結(jié)果顯示，當(dāng)1 mL膠體金溶液中加入2.5 μg Ab2抗體時，膜面不干凈，有膠體金沉積。當(dāng)1 mL膠體金溶液中加入5 μg Ab2抗體時，膜面干凈，C、T線最清晰，后續(xù)試驗選擇1 mL膠體金溶液中添加5 μg Ab2抗體。

2.4 膠體金免疫層析試紙條的靈敏度

如圖4檢測結(jié)果顯示，陽性樣品稀釋倍數(shù)為1∶10時，C、T線顯色清晰，肉眼可觀測到最低稀釋倍數(shù)為1∶400。當(dāng)濃度低于稀釋倍數(shù)1∶400時，在自然光線下無法觀察到檢測線。

2.5 膠體金免疫層析試紙條的特異性

如圖5檢測結(jié)果顯示，試紙條檢測陽性樣品，T線清晰明顯。而豬傳染性胃腸炎病毒、豬皰疹病毒1型、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、大腸埃希氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、錫那羅州弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌的樣品檢測呈陰性，表明該試紙條具有較高的特異性。

A.陰性對照；B.陽性對照；1～6.0、1、2、4、8、10 μL K2CO3

A.陰性對照；B.陽性樣品；1～5.0、2.5、5、7.5、10 μg Ab2

2.6 膠體金免疫層析試紙條的重復(fù)性

同批次中的試紙條，對陰性樣品及高、中、低濃度的陽性樣品進(jìn)行檢測，如圖6和圖7所示，可見不同試紙條的C線、T線顯色程度基本一致。從批次1、批次2、批次3，分別抽取4根對陰性樣品及高、中、低濃度的陽性樣品進(jìn)行檢測，不同試紙條的C線、T線顯色程度基本一致。

2.7 膠體金免疫層析試紙條的穩(wěn)定性試驗

試紙條分別于4 ℃、室溫和37 ℃條件下干燥避光保存，第40天抽取不同保存條件下的試紙條，并對陰性和不同濃度的陽性樣品(稀釋倍數(shù)為1∶10，1∶50，1∶100，1∶300，1∶500)進(jìn)行檢測，如圖8顯示，4 ℃保存的試紙條，C線、T線顯色明顯，膜面干凈，37 ℃和常溫保存的試紙條，C線、T線顯色明顯，但顯色效果無4 ℃明顯。

1.陰性對照；2.陽性對照；3～10.陽性樣品的稀釋倍數(shù)分別為1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶1 000

1.陰性對照；2.陽性對照；3～15.豬傳染性胃腸炎病毒、豬皰疹病毒1型、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、大腸埃希氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、錫那羅州弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、無乳鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌

2.8 膠體金免疫層析試紙條的臨床試驗

采用制備的試紙條和常規(guī)RT-PCR方法，對已知背景的30例輪狀病毒臨床陽性樣本和20例陰性樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示，2種方法陽性符合率、陰性符合率與總符合率均為100%，這說明本試驗制備的膠體金免疫層析試紙條比較可靠。

1.陰性對照；2.高濃度陽性樣品；3.中濃度陽性樣品；4.低濃度陽性樣品

1.陰性對照；2.高濃度陽性樣品；3.中濃度陽性樣品；4.低濃度陽性樣品

1.陰性對照；2～6.陽性樣品稀釋倍數(shù)分別為1∶10、1∶50、1∶100、1∶300、1∶500

表1 膠體金免疫層析試紙條與RT-PCR對臨床樣品的檢測結(jié)果比較

3 討論

豬輪狀病毒是導(dǎo)致哺乳仔豬和斷奶仔豬腹瀉的主要原因之一，給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且為人畜共患的腹瀉病毒，通過糞-口途徑傳播，感染腸道腸上皮細(xì)胞，臨床癥狀為腹瀉、嘔吐、厭食、脫水[13-14]。近年來,膠體金檢測技術(shù)逐步興起，基于其快速、特異、不受場地限制、操作無需專業(yè)技術(shù)人員的優(yōu)勢，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。其中，膠體金的質(zhì)量至關(guān)重要，形狀不均一的膠體金顆粒會影響標(biāo)記的效果、檢測性能及其重復(fù)性。蛋白被標(biāo)記的不均一會導(dǎo)致標(biāo)記的膠體金積聚與凝集，即便立即將標(biāo)記好的膠體金干燥于金標(biāo)墊上，也會由于金顆粒形狀的不規(guī)則導(dǎo)致其表面標(biāo)記的蛋白易于脫落，造成檢測結(jié)果的假陽性和不穩(wěn)定性。

本研究通過改良標(biāo)記膠體金的制備方法，制備優(yōu)質(zhì)膠體金，構(gòu)建了一種基于Tris輔助法制備膠體金的豬輪狀病毒免疫層析快速檢測方法，用于糞便樣本中輪狀病毒的快速檢測。結(jié)果表明，檸檬酸鈉還原法制備的膠體金，顆粒大小不一，呈橢圓狀；Tris輔助法制備的膠體金，膠體金顆粒大小均勻，呈球狀，更利于金顆粒與抗體的偶聯(lián)，且從紫外掃描儀和粒徑儀的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)，確定制備的膠體金質(zhì)量佳，更加適用于檢測方法的建立。此外，該試紙條最小檢出稀釋倍數(shù)為1∶400，表明該試紙條靈敏性良好。此外，該試紙條與豬傳染性胃腸炎病毒、豬皰疹病毒1型、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒4種臨床癥狀相似的病毒和常見的細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，具有很高的特異性。而且，試紙條在4 ℃、室溫和37 ℃條件下，保存40 d，無假陽性，對高、中、低濃度的陽性樣品的檢測，T線顯色清晰，具有良好的穩(wěn)定性。豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條的重復(fù)性良好，從同一批次和不同批次隨機(jī)抽取試紙條，C線、T線清晰明顯。本文研制的膠體金免疫層析試紙條，對臨床樣品的檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果的符合率為100%。因此，本研究通過Tris輔助法制備的優(yōu)質(zhì)膠體金，與檸檬酸鈉還原法制備的膠體金相比，更適用于膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建，提升試紙條各方面的性能，具有普適性，對其它膠體金試紙條的構(gòu)建具有一定的參考意義。同時，基于Tris輔助法構(gòu)建膠體金的豬輪狀病毒免疫層析試紙條，適用于臨床糞便樣品中輪狀病毒的快速檢測，在輪狀病毒性腹瀉疾病的快速診斷和流行病學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文研制了一種基于Tris輔助法制備膠體金的豬輪狀病毒免疫層析快速檢測方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、簡單快捷等特點，可實現(xiàn)對臨床樣品的快速檢測，適用于輪狀病毒性腹瀉疾病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。