郭佳妮，向妮艷，張文才，陳忠海，劉 星,3*，丁亞麗

1.西藏大學(xué)理學(xué)院 青藏高原生態(tài)與環(huán)境研究中心極端環(huán)境生物適應(yīng)與進化實驗室，西藏 拉薩 850000

2.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩 850000

3.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072

轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的基因表達調(diào)控因子，通常具有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、反轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、核定位信號和寡聚位點，能夠調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄與表達。在轉(zhuǎn)錄因子家族中，MYB 轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量眾多、功能多樣，是植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[1]，MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族具有高度保守的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該保守結(jié)構(gòu)域由1～4 個串聯(lián)且不完全重復(fù)的R 基序組成，每一個R 基序編碼50～53 個氨基酸殘基，經(jīng)過折疊形成HTH 的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)[2]。MYB 轉(zhuǎn)錄因子依據(jù)其N 端含有的特有保守基序的數(shù)量劃分為 1R-MYB（MYB-related）、

2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB 4 個亞家族[3]，其中2R-MYB 是植物中最常見和目前功能研究最多的亞家族[4-5]。MYB轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)控生長發(fā)育、次級代謝物和脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]，在植物應(yīng)對高鹽、干旱、極端溫度和營養(yǎng)缺乏等非生物脅迫方面具有重要意義[7-8]。目前，MYB 轉(zhuǎn)錄因子在植物中得到了廣泛研究，Cao 等[9]過表達蘋果MdoMYB121 基因顯著增強了轉(zhuǎn)基因番茄和蘋果植株對高鹽、干旱和低溫脅迫的耐受性；Cao 等[10]通過外源過表達楊梅MrMYB12 基因增加了煙草中黃酮醇的積累，從而減少了花青素的合成，產(chǎn)生淡粉色和純白色的花；Zhang 等[11]發(fā)現(xiàn)在脅迫環(huán)境下，擬南芥AtMYB49基因可以調(diào)節(jié)葉片角質(zhì)層的沉積，從而調(diào)控植株的耐鹽性；Vannini 等[12]將水稻OsMYB4 基因在擬南芥中過表達顯著的提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性和抗凍性；Feng 等[13]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtMYB68 基因在根中柱鞘細(xì)胞中的特異表達能參與調(diào)節(jié)木質(zhì)素的生成，影響植株根系發(fā)育。

多刺綠絨蒿Meconopsis horridulaHook.f.et Thoms.為罌粟科綠絨蒿屬一年生草本植物，葉全部基生，葉片披針形，花芽近球形，主根肥厚而延長，生長于海拔3600～5100 m 以上的草甸、高山和流石灘地帶，在中國主要分布于西藏、甘肅西部、青海東部至南部和四川西部等高原地區(qū)。多刺綠絨蒿作為傳統(tǒng)藏藥，具有清熱止痛、活血化瘀等功效，被藏醫(yī)廣泛用于治療頭傷、骨折和跌打損傷等疾病[14]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，多刺綠絨蒿在抗病毒、抗腫瘤及心肌保護方面也有重要療效[15-16]。李長山等[17]對多刺綠絨蒿乙醇提取物進行抗病毒活性測試，結(jié)果顯示其提取物可以抑制甲型流感病毒。郭志琴[18]發(fā)現(xiàn)多刺綠絨蒿乙醇提取物對心肌缺血導(dǎo)致的血脂紊亂和心功能下降具有一定改善作用。多刺綠絨蒿具有豐富的次級代謝產(chǎn)物，目前從多刺綠絨蒿中分離得到黃酮類、萜類、生物堿類等化合物，其中黃酮類物質(zhì)作為重要的藥效物質(zhì)，其含量與生長環(huán)境密切相關(guān)[19-22]，在高原環(huán)境下黃酮類物質(zhì)的積累，有助于植物抵御強輻射所造成的氧化損傷[23-24]。近年來多刺綠絨蒿的研究大多集中在化學(xué)成分鑒定及臨床醫(yī)藥方面，對其如何應(yīng)對高原極端環(huán)境的適應(yīng)性進化及次級代謝物的調(diào)控機制卻鮮有報道[25]。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定了多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，對其理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、保守基序、系統(tǒng)進化關(guān)系和表達模式進行分析，并預(yù)測了部分多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能，篩選出可能參與黃酮類代謝及非生物脅迫等方面的MYB 轉(zhuǎn)錄因子，為進一步揭示和深入研究MYB 轉(zhuǎn)錄因子在多刺綠絨蒿的生長發(fā)育、次生代謝及脅迫響應(yīng)機制等方面提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為藏藥多刺綠絨蒿的可持續(xù)開發(fā)利用、生物多樣性保護及環(huán)境適應(yīng)性機制的研究提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

多刺綠絨蒿實驗材料采集于西藏自治區(qū)拉薩市達瓊村（89°19?57″E，30°42?97″N，4925 m）、東德措（92°94?52″E，30°99?18″N，4872 m）和奪底溝（91°11'16″E，29°43'33″N，3980 m）3 個不同海拔地點，每個地點3 個生物學(xué)重復(fù)，共采集9 份葉片組織樣品，液氮速凍后，存放于超低溫冰箱（-80 ℃）；進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得60.15 Gb 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。樣品由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉星教授鑒定多刺綠絨蒿M.horridulaHook.f.et Thoms.植株，標(biāo)本現(xiàn)保存于西藏大學(xué)青藏高原生態(tài)與環(huán)境研究中心極端環(huán)境生物適應(yīng)與進化實驗室。

2 方法

2.1 多刺綠絨蒿MYB 家族鑒定及理化性質(zhì)分析

在Pfam（http://pfam.xfam.org）網(wǎng)站中下載MYB轉(zhuǎn)錄因子的隱馬爾可夫模型（PF00249），利用HMMER3.0 軟件中hmmsearch 程序進行鑒定；下載擬南芥已發(fā)表MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族成員作為種子文件，利用Blast 軟件進行blastp 比對；將hmmsearch與blastp 2 種鑒定結(jié)果進行合并取交集作為候選基因提交至SMART（https://smart.embl.de/）、NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Pfam.search（http://pfam.xfam.org/） 和 PROSITE （https://prosite.expasy.org/）數(shù)據(jù)庫進行保守結(jié)構(gòu)域的驗證。

通過ExPASy（https://web.expasy.org/）網(wǎng)站對MYB 轉(zhuǎn)錄因子的基本理化性質(zhì)進行預(yù)測；利用CELLO[CELLO:Subcellular Localization Predictive System]網(wǎng)站（nctu.edu.tw）進行亞細(xì)胞定位分析；利用 SOPMA[NPS@:SOPMA secondary structure prediction]網(wǎng)站（ibcp.fr）對蛋白質(zhì)進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2.2 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子基因本體（gene ontology，GO）GO 功能注釋

利用 Blast2GO （Basic 6.0 https://www.blast2go.com/）軟件對多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子進行功能預(yù)測，利用軟件的Blast 工具將多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列與非冗余（nr）蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，并對每個MYB 轉(zhuǎn)錄因子進行GO 注釋，使用R 軟件（version 4.2.1）繪制GO 注釋分類圖。

2.3 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子保守基序分析

利用MEME（MEME，V.5.4.1，http://memesuite.org/tools/meme）在線分析網(wǎng)站，對多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員進行保守基序的鑒定，并使用TBtools 軟件（version 1.09876）對保守基序分析結(jié)果進行可視化。

2.4 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 軟件（version 11）內(nèi)置的Clustal W程序，將多刺綠絨蒿106 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥195 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列以及52 個R2R3-MYB 和擬南芥126 個R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列分別進行序列比對，選用鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap method參數(shù)取值1000，其余參數(shù)選擇默認(rèn)值，并使用iTOL網(wǎng)站（https://itol.embl.de/）進行進化樹美化。

2.5 多刺綠絨蒿R2R3-MYB 蛋白特征結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN（version 9.0）軟件對多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進行多序列比對，提取其R2 和R3 保守結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)的氨基酸殘基分布，利用WebLogo 3 網(wǎng)站（http://weblogo.Threeplusone.com/）繪制特征結(jié)構(gòu)域的序列標(biāo)識。

3 結(jié)果與分析

3.1 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子鑒定與理化性質(zhì)分析

通過Hmmsearch 和blastp 比對在多刺綠絨蒿中共得到187 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子，利用SMART、PROSITE、NCBI-CDD 和Pfam 數(shù)據(jù)庫篩選，去掉保守結(jié)構(gòu)域不完整的和重復(fù)的序列，最終鑒定到106 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子，其中1RMYB 類49 個、R2R3-MYB 類52 個、3R-MYB 類5 個，命名為MhMYB1～106（表1）。

對106 個多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子進行蛋白長度、相對分子質(zhì)量、等電點和酸堿性等基本性質(zhì)預(yù)測（表 1），結(jié)果顯示其蛋白序列長度為 77（MhMYB101）～976（MhMYB50）個氨基酸殘基；蛋白相對分子質(zhì)量為8750（MhMYB101）～110 680（MhMYB50）；等電點為4.720（MhMYB78）～10.452（MhMYB101），其中53 個轉(zhuǎn)錄因子蛋白等電點小于7，偏酸性，其中53 個轉(zhuǎn)錄因子等電點大于7，偏堿性；蛋白疏水性為-1.12（MhMYB37）～-0.31（MhMYB17），表明多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子均為親水性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定系數(shù)為28.348（MhMYB29）～71.011（MhMYB9），其中MhMYB77、MhMYB47、MhMYB44、MhMYB25、MhMYB30、MhMYB94 和MhMYB29 的不穩(wěn)定系數(shù)系小于40 為穩(wěn)定蛋白，其余蛋白序列不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子以不穩(wěn)定蛋白為主。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示106個MYB 轉(zhuǎn)錄因子有97個預(yù)測到細(xì)胞核（nuclear）中，8 個預(yù)測到線粒體（mitochondrial）中，1 個預(yù)測到細(xì)胞質(zhì)（cytoplasmic）中，表明MYB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

為明確多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成，對MhMYBs 蛋白序列進行了二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（表1），結(jié)果顯示多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族二級結(jié)構(gòu)主要由4 種類型組成，其中無規(guī)則卷曲（random coil）占比為29.07%～73.45%；α-螺旋結(jié)構(gòu)（alpha helix）占比為11.43%～60.47%；β-轉(zhuǎn)角（beta turn）占比為1.02%～14.61%；延伸鏈（extend strand）占比為0～20.45%。

表1 多刺綠絨蒿MYB 蛋白基本信息及理化性質(zhì)預(yù)測Table 1 Basic information and physicochemical properties prediction of MYB protein of M.horridula

續(xù)表1

3.2 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子GO 功能注釋

多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子GO 功能預(yù)測結(jié)果顯示（圖1），多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要注釋在細(xì)胞成分（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）、和分子功能（molecular function，MF）3 大類。GO 富集分析結(jié)顯示，MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白功能在細(xì)胞成分（cellular component，CC）方面主要富集在細(xì)胞核（GO：0005634）、細(xì)胞上細(xì)胞器（GO：0043229）和核糖體（GO：0000786）等細(xì)胞成分；生物過程（biological process，BP）中主要富集在細(xì)胞發(fā)育過程（GO：0048869）、細(xì)胞分化（GO：0030154）和生物合成調(diào)節(jié)（GO：0048583）等方面；分子功能（molecular function，MF）方面主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（GO：0140110）、DNA結(jié)合（GO：0003677）和有機環(huán)化合物結(jié)合（GO：0097159）等方面。

圖1 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族GO 注釋Fig.1 GO annotation of MYB transcription factor family in M.horridula

3.3 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子保守基序分析

為進一步說明多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的多樣性和進化關(guān)系，利用MEME 網(wǎng)站進行保守基序分析，并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹進行可視化（圖2）。結(jié)果顯示，多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族共鑒定到10 個保守基序，其中motif3（89.62%）、motif1（51.89%）和motif7（46.23%）三者出現(xiàn)的頻率較高。其中2R-MhMYBs 亞家族基序保守性強，大多都包含了motif2、motif3、motif5、motif1 和motif7，且都位于蛋白序列N 端。1R-MhMYBs 保守基序的數(shù)量較少且位置變化較大，大多都包含了motif3 和motif4。結(jié)合系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，同一亞家族具有相似的motif 的種類與分布，不同亞家族在種類與分布上具有較大差異，且處于鄰近分支的MYB 轉(zhuǎn)錄因子的保守基序的位置結(jié)構(gòu)與類型更相近。

圖2 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守motifFig.2 Motif analysis of MYB transcription factors in M.horridula

3.4 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化分析

對106 個多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥195 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列進行多序列比對及系統(tǒng)進化分析（圖3）。結(jié)果顯示，多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子不同亞家族成員均能與擬南芥相應(yīng)類型的轉(zhuǎn)錄因子聚類到一起，該結(jié)果與結(jié)構(gòu)域鑒定分類結(jié)果基本一致，說明MhMYBs 的鑒定及分類結(jié)果可靠，表明多刺綠絨蒿和擬南芥的MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族具有相似的進化過程，具有比較高的保守性。

圖3 多刺綠絨蒿和擬南芥MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of MYB transcription factors in M.horridula and A.thaliana

為研究多刺綠絨蒿R2R3-MhMYB 的系統(tǒng)進化關(guān)系，對多刺綠絨蒿與擬南芥R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 4），并結(jié)合擬南芥R2R3-MYB 蛋白亞組的分類依據(jù)[3]，將多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子分為了24 個亞組（C1～C24），其中有18 個亞組能與擬南芥已分類亞組聚為一支，包括C1（S4）、C6（S1）和C10（S6）等，C3、C12 和C14 等6 個多刺綠絨蒿亞組包含擬南芥未分類的轉(zhuǎn)錄因子，有S3、S10、S12、S15和S16 這5 個擬南芥亞組未能與多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子聚類。多刺綠絨蒿與擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的聚類結(jié)果表明，聚類在一起的轉(zhuǎn)錄因子具有較高的同源性與序列相似性，并可能具有類似的功能，多刺綠絨蒿與擬南芥物種后期朝不同的進化方向發(fā)展，也導(dǎo)致了部分R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子的特異性分化。

圖4 多刺綠絨蒿與擬南芥R2R3-MYB 系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of R2R3-MYB of M.horridula and A.thaliana

3.5 多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)域分析

為研究多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域同源性特征，進一步展示在特定位置的保守性，分別對多刺綠絨蒿和擬南芥R2R3-MYB 蛋白序列進行多序列比對分析，并對R2 和R3 保守結(jié)構(gòu)域特征進行可視化（圖5）。結(jié)果顯示多刺綠絨蒿R2R3-MYB 蛋白與擬南芥R2R3-MYB 蛋白相似，在R2 和R3 重復(fù)序列中存在多個保守的氨基酸，尤其是特征色氨酸（W），且都具有［-W-（X19）-W-（X19）-W-］和［-F-（X18）-W-（X18）-W-］結(jié)構(gòu)域；其中R2 結(jié)構(gòu)包括3 個極度保守的色氨酸（W），每2 個色氨酸殘基間隔19 個氨基酸殘基；R3 結(jié)構(gòu)包括2 個極度保守的色氨酸（W），第1 個色氨酸被苯丙氨酸（F）、異亮氨酸（I）及亮氨酸（L）取代，第2 個色氨酸和第3 個色氨酸殘基間隔18 個氨基酸殘基；除高度保守的色氨酸（W）外，R2 和R3 結(jié)構(gòu)中也存如賴氨酸（K）、蘇氨酸（T）、精氨酸（R）、天冬酰胺（N）、甘氨酸（G）和谷氨酸（E）等保守氨基酸殘基，這類保守氨基酸殘基通常出現(xiàn)在各重復(fù)區(qū)的后半部分，即第2 和第3 個的保守色氨酸之間的區(qū)域，且在每個重復(fù)區(qū)中與前2 個螺旋區(qū)域相比第3 個螺旋區(qū)保守性更高，表明這類保守氨基酸殘基具有維持MYB 結(jié)構(gòu)域的HTH 結(jié)構(gòu)的作用。

圖5 多刺綠絨蒿和擬南芥R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)識Fig.5 Conserved domain logos of R2R3-MYB transcription factors in M.horridula and A.thaliana

3.6 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子表達分析

MYB 轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫及植物黃酮類代謝方面具有重要調(diào)節(jié)作用，多刺綠絨蒿生長于青藏高原高海拔地區(qū)，生長環(huán)境惡劣多變，為探究多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子在不同海拔間的潛在關(guān)系，研究多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子與黃酮類合成途徑和非生物脅迫相關(guān)基因在不同海拔的表達特異性，對多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子進行表達模式分析（圖6）。結(jié)果顯示，106 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子中，有28 個轉(zhuǎn)錄因子的表達量隨海拔升高而升高，11 個轉(zhuǎn)錄因子表達量隨海拔升高而降低。52 個R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子中，14個轉(zhuǎn)錄因子的表達量變化與海拔變化一致，5 個轉(zhuǎn)錄因子表達量與海拔變化相反。其中MhMYB90、MhMYB84和MhMYB62分別聚類到擬南芥黃酮類代謝物相關(guān)的S4、S6、S7 亞組，表達量均與海拔呈正相關(guān)；MhMYB 81、MhMYB 82，MhMYB63、MhMYB56、MhMYB55，MhMYB83，MhMYB101，MhMYB 58分別聚類到擬南芥非生物脅迫相關(guān)的S2、S13、S21、S22、S23 亞組，其中MhMYB81，MhMYB63、MhMYB56、MhMYB55，MhMYB83，MhMYB101，MhMYB58 表達量變化與海拔變化一致，MhMYB82 表達量變化與海拔變化相反。

圖6 不同海拔梯度下多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達量分析Fig.6 Expression profiles of MYB transcription factors of M.horridula in different altitude gradients

4 討論

MYB 轉(zhuǎn)錄因子具有特有的MYB DNA 結(jié)合域，能夠特異結(jié)合基因啟動子區(qū)域的作用元件，根據(jù)植物生長發(fā)育及環(huán)境變化調(diào)控相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄表達，是植物生長過程中的重要調(diào)節(jié)因子[26]，對植物生長發(fā)育具有重要意義。目前已在擬南芥、小麥、大豆、刺梨、柑橘和楊梅等多個物種中被鑒定[27-30]。本研究基于多刺綠絨蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定獲得了106個MYB 轉(zhuǎn)錄因子，其中包含49 個1R-MYB、52個R2R3-MYB 和5 個3R-MYB，通過對多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)預(yù)測顯示，多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子均為親水性蛋白質(zhì)，53 個蛋白偏酸性，53 個蛋白偏堿性。不穩(wěn)定系數(shù)顯示多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子中除了7 個為穩(wěn)定蛋白，其余99 個都為不穩(wěn)定蛋白，這與王靜文等[31]對細(xì)葉百合的研究結(jié)果相類似。在亞細(xì)胞定位中預(yù)測到細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)3 種類型，且主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，這與Cao 等[32]分析MYB 轉(zhuǎn)錄因子在中國梨的細(xì)胞核中發(fā)揮重要作用相似。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員存在4 種二級結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲占比較高，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的功能息息相關(guān)，表明這2種結(jié)構(gòu)更有助于MYB 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)形成，這與張耐等[33]對甘草MYB 的研究及李明明等[34]對谷子MYB-CC 研究結(jié)果相一致。

多刺綠絨蒿保守基序分析表明，各亞家族motif組成相對保守，聚類到同一分支的MYB 因子具有更為相似的motif 組成和分布類型，而不同分支間則有所差異，這與谷佳等[35]對三色堇MYB 轉(zhuǎn)錄因子的研究相一致。保守基序分析能夠展現(xiàn)該家族進化過程中的結(jié)構(gòu)特點，為其功能研究提供理論基礎(chǔ)，相似的保守基序組成和分布表明其可能在多刺綠絨蒿的生長發(fā)育過程中具有相似的功能作用，而距離較遠的分支其保守基序的位置與結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)差異可能是造成轉(zhuǎn)錄因子功能分化的重要因素[36]。對多刺綠絨蒿R2R3-MYB 特征結(jié)構(gòu)域分析表明，該亞家族轉(zhuǎn)錄因子均含有［-W-（X19）-W-（X19）-W-］和［-F-（X18）-W-（X18）-W-］的2 個相鄰的典型結(jié)構(gòu)域，這與Liu 等[37]對秈稻R2R3-MYB 的研究結(jié)果一致，表明多刺綠絨蒿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域上具有較高的保守性，且在序列比對中發(fā)現(xiàn)在重復(fù)序列的第一個螺旋區(qū)及其臨近區(qū)域的保守性相對較低，常會發(fā)生氨基酸插入和缺失情況，推測該區(qū)域可能是該基因家族進化和功能分化的活躍區(qū)域，而色氨酸與其余保守度較高的氨基酸殘基對共同維持HTH 結(jié)構(gòu)具有重要意義。

在植物中MYB 家族有選擇性地擴張，其中R2R3-MYB 是植物中存在最廣泛的一類MYB 轉(zhuǎn)錄因子，該亞家族成員因在植物生命活動中發(fā)揮的重要作用而被廣泛研究[38]。在多刺綠絨蒿中R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子可劃分為24 個亞組，其中有18 個亞組中含有不同數(shù)量已分類亞組的AtMYB 和MhMYB 蛋白，說明MYB 轉(zhuǎn)錄因子進化過程相對保守[8]。擬南芥作為模式物種，MYB 轉(zhuǎn)錄因子的功能研究較多，以擬南芥AtMYBs 的功能作為參考，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和表達分析，為探討多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能探究提供重要參考。聚類結(jié)果表明，MhMYB61 與擬南芥S9 的AtMYB16 聚類在一支，擬南芥AtMYB16 有助于花瓣表皮細(xì)胞的形成的功能[39]；MhMYB77 與AtMYB20 聚類到一支，擬南芥AtMYB20 參與調(diào)控擬南芥次生細(xì)胞壁形成過程中木脂素和苯丙氨酸的生物合成[40]。在多刺綠絨蒿中有4 個（MhMYB72、MhMYB100、MhMYB75、MhMYB90）、2 個（MhMYB84、MhMYB95）和2 個（MhMYB62、MhMYBS54）轉(zhuǎn)錄因子分別與擬南芥中黃酮類化合物的調(diào)控機制以及花青素積累相關(guān)的S4、S6 和S7 亞組聚類為一支[41-43]，推測此類多刺綠絨蒿轉(zhuǎn)錄因子也具有相似功能，表達量分析顯示其中MhMYB72、MhMYB75、MhMYB90、MhMYB84 和MhMYB62 這5 個轉(zhuǎn)錄因子在兩個高海拔居群中的表達量均高于低海拔居群，這可能與高海拔居群植株會生成黃酮類物質(zhì)應(yīng)對強光輻射以及干旱環(huán)境相關(guān)。擬南芥S4 亞組中的AtMYB4、AtMYB32 和AtMYB7 調(diào)控和表達能夠增強植物應(yīng)對強紫外線脅迫的能力[44]，聚類到同支的多刺綠絨蒿轉(zhuǎn)錄因子在高海拔居群中的上調(diào)表達可能也在多刺綠絨蒿應(yīng)對紫外線脅迫中發(fā)揮重要作用。擬南芥S1、S11、S13、S21、S22、S23 亞組主要與抗旱抗寒等非生物脅迫相關(guān)[45-48]，在多刺綠絨蒿的聚類和表達分析顯示共有15 個轉(zhuǎn)錄因子分別聚類在S1、S11、S13、S21、S22 和S23 這類亞組當(dāng)中，其中有10 個轉(zhuǎn)錄因子在高海拔地區(qū)表達量上調(diào)，說明多刺綠絨蒿在應(yīng)對更高海拔惡劣環(huán)境時會通過抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達來調(diào)控次級代謝通路以應(yīng)對脅迫環(huán)境，維持自身正常的生命活動。

目前，多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究還非常欠缺，MYB 轉(zhuǎn)錄因子在多刺綠絨蒿生長發(fā)育調(diào)控及非生物脅迫的響應(yīng)機制還不清楚，本研究通過生物信息學(xué)方法，鑒定了多刺綠絨蒿的MYB 轉(zhuǎn)錄因子，并系統(tǒng)地對該家族成員進行了基本理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化關(guān)系和表達模式等分析。為今后深入研究MYB 轉(zhuǎn)錄因子在多刺綠絨蒿生長發(fā)育中的作用和應(yīng)對高原極端環(huán)境的調(diào)控機制提供了參考基礎(chǔ)。

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