黃 河 莊 鐿 鐘國(guó)防, 唐香山

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部魚類營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 4. 杭州眺旺生物科技有限公司, 杭州 310030)

大口黑鱸(Micropterus salmoides), 俗稱加州鱸,自20世紀(jì)80年代引入我國(guó), 經(jīng)過(guò)多年養(yǎng)殖發(fā)展, 目前已經(jīng)成為我國(guó)淡水養(yǎng)殖的重要品種之一。據(jù)統(tǒng)計(jì), 2019年年產(chǎn)量高達(dá)477808000 kg, 同比增長(zhǎng)10.59%[1]。但是隨著集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展及飼養(yǎng)方式不規(guī)范, 加州鱸病害頻發(fā)。預(yù)防和治療魚類細(xì)菌性疾病的傳統(tǒng)方法是在水產(chǎn)飼料中添加抗生素。然而濫用抗生素會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性、免疫抑制和藥物殘留等問(wèn)題[2]。因此抗生素的安全使用一直倍受關(guān)注, 歐盟自2006年起便禁止在動(dòng)物飼料中添加抗生素。2019年我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部宣布自2020年7月1日起, 飼料企業(yè)全面禁抗[3]。于是篩選合適的抗生素替代品用于水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)是當(dāng)務(wù)之急, 對(duì)日益發(fā)展壯大的大口黑鱸等水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)具有深遠(yuǎn)的意義。

對(duì)抗生素替代品的研究發(fā)現(xiàn), 抗菌肽是生物體內(nèi)非特異性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種多肽類物質(zhì), 因其獨(dú)特的生物活性、異于傳統(tǒng)抗生素的抑菌和殺菌機(jī)制、不易產(chǎn)生耐藥性和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn), 有望被開發(fā)成為一類新型高效抗菌藥物, 在飼料添加劑領(lǐng)域具備替代抗生素的巨大潛力[4]。有研究表明, 在飼料中添加不超過(guò)20 mg/kg的重組抗菌肽能顯著提高羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚生長(zhǎng)性能和部分免疫指標(biāo)以及攻毒后存活率, 而50 mg/kg抗菌肽在一定程度上對(duì)羅非魚幼魚的生長(zhǎng)性能和部分酶指標(biāo)則有抑制作用[5]。同樣, 在湘云鯽(Carassius auratusXiangyun)[6]的研究中也發(fā)現(xiàn), 在飼料中添加150 mg/kg天蠶素抗菌肽可以顯著提高湘云鯽的生長(zhǎng)性能、血清非特異性免疫力和抗病力。另外,翟少偉等[7]研究認(rèn)為, 在飼料中適量添加抗菌肽Surfactin可增加吉富羅非魚腸道皺襞高度、調(diào)節(jié)腸道菌群和提高腸道抗氧化能力。

本試驗(yàn)所用的牛乳鐵蛋白肽(Bovine lactoferricin, LfcinB)是一種由牛乳鐵蛋白在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶水解產(chǎn)生的含25個(gè)氨基酸殘基的陽(yáng)離子型抗菌肽, 這些氨基酸殘基通過(guò)分子內(nèi)的二硫鍵形成某種扭曲的反平行 β 折疊結(jié)構(gòu), 使其生物活性強(qiáng)于牛乳鐵蛋白, 具有更強(qiáng)的抗菌和抗病毒能力[8,9]。另外, 牛乳鐵蛋白肽溶解時(shí)會(huì)形成一個(gè)正電荷殘基包圍起來(lái)的疏水表面, 使其具有水脂兩親性的特點(diǎn)[10],所以它具有乳化功能, 可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[11]。因此, 牛乳鐵蛋白肽可以成為良好的抗生素替代品。但是, 目前關(guān)于它的研究主要集中在對(duì)細(xì)菌膜超微結(jié)構(gòu)的影響[12]、體外抑菌效果[13,14]和對(duì)疾病創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用[15]等方面, 而作為飼料添加劑的研究目前只在牛乳鐵蛋白上有所報(bào)道, 所涉及的水產(chǎn)動(dòng)物包括尼羅羅非魚[16]、亞洲鯰(Clarias batrachus)[17]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[18,19]、黃鰭鯛(Acanthopagrus latus)[20]等, 牛乳鐵蛋白肽上還未見報(bào)道。本文通過(guò)在研究飼料中添加牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚生長(zhǎng)性能、消化酶活力、腸道組織結(jié)構(gòu)及抗病力的影響, 旨在評(píng)估其替代抗生素的潛力, 為牛乳鐵蛋白肽在漁用功能性飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

在以白魚粉和發(fā)酵豆粕為主要蛋白源, 魚油、豆油和大豆磷脂油為主要脂肪源的基礎(chǔ)飼料中分別添加0 (陰性對(duì)照)、1000、1500和2000 mg/kg牛乳鐵蛋白肽(由杭州眺旺生物科技有限公司研發(fā)并生產(chǎn))及30 mg/kg氟苯尼考(陽(yáng)性對(duì)照), 并依次命名為L(zhǎng)fcinB0、LfcinB1000、LfcinB1500、LfcinB2000和F。將原料粉碎, 稱重, 混合均勻, 然后加入油脂和水, 徹底混合。經(jīng)飼料制粒機(jī)制成直徑2 mm的顆粒, 60℃烘至水分低于10%, 密封于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。試?yàn)基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平如表 1。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(%干飼料)Tab. 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (% dry diet)

1.2 試驗(yàn)分組與管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)場(chǎng)地位于上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地內(nèi)場(chǎng), 試驗(yàn)用魚購(gòu)自于上海秦皇山漁業(yè)有限公司,試驗(yàn)正式開始之前暫養(yǎng)1周, 暫養(yǎng)期間投喂LfcinB0組基礎(chǔ)飼料。試驗(yàn)前大口黑鱸饑餓24h, 然后挑選450尾(19.88±0.03) g健康、規(guī)格均勻的幼魚用于養(yǎng)殖試驗(yàn), 每組3個(gè)重復(fù), 隨機(jī)放置30尾于15個(gè)大小一致的網(wǎng)箱(1 m ×1 m × 1 m)中。試驗(yàn)周期為8周, 采取表觀飽食方式進(jìn)行投喂, 每日兩次(8: 00和16:00)。定期檢測(cè)水質(zhì), 水溫在24—30℃, 氨氮＜0.5 mg/L, pH為7.5—8.5, 溶氧＞5 mg/L, 每3天換水1次, 換水量占網(wǎng)箱水容量1/3左右。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

飼料營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定飼料水分含量采用105℃烘箱干燥恒重法(GB/T 6435-2014)測(cè)定, 粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量依次采用凱氏定氮法(GB/T 6432-2018)、索氏抽提法(GB/T 6433-2006)測(cè)定。

生長(zhǎng)及形體指標(biāo)的測(cè)定經(jīng)過(guò)8周飼養(yǎng)試驗(yàn)后, 將大口黑鱸禁食24h, 然后統(tǒng)計(jì)每個(gè)網(wǎng)箱中魚的存活數(shù)并稱重, 用于計(jì)算生長(zhǎng)指標(biāo)。每網(wǎng)箱隨機(jī)取6尾魚, 使用MS-222(60 mg/L)麻醉后測(cè)體長(zhǎng)和體重。解剖, 測(cè)量肝臟重和內(nèi)臟重, 用于肝體比和臟體比的計(jì)算。

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=100×(試驗(yàn)魚終末體重-試驗(yàn)魚初始體重)/試驗(yàn)魚初始體重

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate, SGR, %/d)=100×(ln試驗(yàn)魚終末體重-ln試驗(yàn)魚初始體重) /試驗(yàn)天數(shù)

成活率(Survival rate, SR, %)=100×試驗(yàn)終末魚尾數(shù)/試驗(yàn)初始魚尾數(shù)

飼料系數(shù)(Feed coefficient ratio, FCR)=攝食飼料質(zhì)量/(試驗(yàn)魚終末體重-試驗(yàn)魚初始體重)

肥滿度(Condition factor, CF, g/cm3)=100×體重/體長(zhǎng)3

肝體比(Hepatosomatic index, HSI)=100×肝臟重/體重

臟體比(Viscerosomatic index, VSI)=100×內(nèi)臟團(tuán)重/體重

腸道組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)的測(cè)定每網(wǎng)箱隨機(jī)取3尾魚的腸, 分前腸、中腸和后腸(各1 cm), 用0.86%生理鹽水沖洗后浸入Bouin氏液中。腸組織(每個(gè)網(wǎng)箱3個(gè)樣品)在Bouin氏液中浸泡24h之后轉(zhuǎn)入70%無(wú)水乙醇中, 1周內(nèi)用一系列乙醇溶液脫水,石蠟包埋。切片(6 μm), 蘇木精-伊紅(HE)染色, 中性樹脂封閉。每組前、中和后腸各9個(gè)切片, 用成像顯微鏡(Nikon YS100, 日本)觀察組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。每個(gè)切片測(cè)量15個(gè)絨毛的高度和寬度。圖像分析采用ImageJ14.0圖像分析軟件。

腸道消化酶活力的測(cè)定每網(wǎng)箱隨機(jī)取3尾魚的全腸于-20℃保存, 將樣品在冰上解凍, 用0.86%的冷生理鹽水漂洗, 除去血液, 濾紙擦干, 稱重, 按重量 (g)∶體積 (mL) 比=1∶9的比例加入勻漿介質(zhì)或0.86%冷生理鹽水, 冰浴條件下機(jī)械勻漿, 離心后取上清液用于腸道消化酶活力的測(cè)定。腸胰蛋白酶(Trypsin)、α-淀粉酶(α-amylase)和脂肪酶(Lipase)活力均采用南京建成生物技術(shù)研究所的測(cè)試試劑盒進(jìn)行測(cè)定, 測(cè)定方法參照說(shuō)明書。腸勻漿上清液的蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定。

攻毒試驗(yàn)試驗(yàn)所用的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)菌種由上海海洋大學(xué)病原庫(kù)提供, 先用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h(復(fù)壯), 再挑取少量菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基在28℃搖床培養(yǎng)箱中培24h, 最后將菌液在4000 r/min條件下離心5min, 收集沉淀的細(xì)菌, 用滅菌生理鹽水稀釋至終濃度為1×107CFU/mL, 置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在試?yàn)結(jié)束后, 分別從各組取30尾試驗(yàn)魚,每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)10尾魚, 進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。每尾魚經(jīng)胸鰭基部注射200 μL/100 g體重的嗜水氣單胞菌菌液進(jìn)行攻毒, 然后放回養(yǎng)殖網(wǎng)箱。連續(xù)7d記錄每天試驗(yàn)魚的死亡數(shù)目, 計(jì)算存活率和死亡率, 根據(jù)死亡率計(jì)算免疫保護(hù)率, 根據(jù)每日存活數(shù)量使用Graphpad Prism 8.4.0軟件作生存曲線圖。

存活率(%)=100×存活數(shù)/初始試驗(yàn)魚總數(shù);

死亡率(%)=100×死亡數(shù)/初始試驗(yàn)魚總數(shù);

免疫保護(hù)力(%)=100×(陰性對(duì)照組試驗(yàn)魚死亡率-試驗(yàn)組試驗(yàn)魚死亡率)/陰性對(duì)照組試驗(yàn)魚死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 用Duncan法進(jìn)行多重差異顯著性檢驗(yàn), 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示,P＜0.05表明不同組差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚生長(zhǎng)性能的影響

隨著飼料中牛乳鐵蛋白肽含量的增加, 大口黑鱸幼魚的FBW、WGR和SGR均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì), LfcinB1000組結(jié)果最好且與各組均有顯著差異(P＜0.05)。各組間的SR和FCR無(wú)顯著差異(P＞0.05; 表 2)。

表2 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Tab. 2 Effects of bovine lactoferricin on growth indexes of juvenile largemouth bass

飼料中添加1000 、1500和2000 mg/kg牛乳鐵蛋白肽及30 mg/kg氟苯尼考對(duì)大口黑鱸幼魚的形體指標(biāo)CF、HSI和VSI不會(huì)造成顯著影響(P＞0.05;表 3)。

表3 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚形體指標(biāo)的影響Tab. 3 Effects of bovine lactoferricin on body indexes of juvenile largemouth bass

2.2 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚消化酶活力的影響

與陰性對(duì)照組相比, LfcinB1000組腸道胰蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶活力均顯著升高(P＜0.05),LfcinB1500、LfcinB2000組腸道胰蛋白酶、α-淀粉酶活力無(wú)顯著變化(P＞0.05), LfcinB1500組腸道脂肪酶活力顯著上升(P＜0.05), LfcinB2000組腸道脂肪酶活力無(wú)顯著變化(P＞0.05), 陽(yáng)性對(duì)照組的腸道胰蛋白酶活力顯著下降(P＜0.05)、α-淀粉酶和脂肪酶活力無(wú)顯著變化(P＞0.05)。LfcinB1000組腸道消化酶活力顯著高于其余各組(P＜0.05; 表 4)。

表4 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚腸道消化酶活力的影響Tab. 4 Effects of bovine lactoferricin on the activity of digestive enzymes in juvenile largemouth bass

2.3 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

觀察腸道組織結(jié)構(gòu)切片發(fā)現(xiàn): 前腸, LfcinB1000組杯狀細(xì)胞數(shù)目增加, LfcinB1500、LfcinB2000、F組黏膜下層與肌層間出現(xiàn)空隙; 中腸, LfcinB1500、LfcinB2000組黏膜層與固有層間出現(xiàn)空隙; 后腸,LfcinB1500、LfcinB2000組黏膜下層與肌層、黏膜層與固有層間均出現(xiàn)空隙(圖 1)。

圖1 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effects of bovine lactoferricin on intestinal tissue structure of juvenile largemouth bass

腸道切片量化數(shù)據(jù)表明, 隨著飼料中牛乳鐵蛋白肽添加量的增加, 腸道絨毛高度和寬度均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì), LfcinB1000、LfcinB1500和LfcinB2000組前腸和中腸絨毛高度均顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05), LfcinB1000和LfcinB1500組后腸絨毛高度顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05)。LfcinB1000、LfcinB1500和LfcinB2000組前腸絨毛高度顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05), LfcinB1000和LfcinB1500組中腸和后腸絨毛高度顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。LfcinB1000組前腸和后腸絨毛寬度顯著寬于陰陽(yáng)兩對(duì)照組(P＜0.05), LfcinB1000、LfcinB1500和LfcinB2000組中腸絨毛寬度和陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05), 但均顯著寬于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。與陰性對(duì)照組相比, 陽(yáng)性對(duì)照組腸道絨毛高度和寬度一定程度上均有所降低, 但只有前腸和中腸的寬度變化顯著(P＜0.05; 表 5)。

表5 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響Tab. 5 Effects of bovine lactoferricin on intestinal tissue structure of juvenile largemouth bass

2.4 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚抗病力的影響

與陰性對(duì)照組相比, 在飼料中添加牛乳鐵蛋白肽及氟苯尼考均能提高嗜水氣單胞菌攻毒的大口黑鱸幼魚的存活率(表 6)。LfcinB1000組與F組大口黑鱸3—7d的存活率和免疫保護(hù)率基本相同, 這說(shuō)明適量牛乳鐵蛋白肽與氟苯尼考的免疫保護(hù)效果相當(dāng)。同時(shí), LfcinB1000組的存活率與陰性對(duì)照組的存活率存在極顯著差異(P＜0.01), 陽(yáng)性對(duì)照組的存活率顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05), 其余各組間差異并不顯著(P＞0.05; 圖 2)。

圖2 生存曲線Fig. 2 Survival curve

表6 牛乳鐵蛋白肽對(duì)攻毒后大口黑鱸幼魚存活率和免疫保護(hù)率的影響Tab. 6 Effect of bovine lactoferricin on survival rate and immune protection rate of juvenile largemouth bass after challenge

3 討論

3.1 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚生長(zhǎng)性能的影響

本研究結(jié)果表明, 在飼料中添加1000 mg/kg牛乳鐵蛋白肽能顯著提高大口黑鱸幼魚的FBW、WGR和SGR, 但添加量過(guò)高反而會(huì)抑制其生長(zhǎng)。這與其他水產(chǎn)動(dòng)物在飼料中添加抗菌肽的研究結(jié)果相似。如陳冰等[21]在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的飼料中添加2000 mg/kg家蠅抗菌肽, 顯著提高了對(duì)蝦的SR、WGR和SGR, 但隨著劑量的增加, 這些指標(biāo)逐漸降低。同樣, 在姜珊等[5]對(duì)吉富羅非魚的研究中, 當(dāng)飼料中添加5 mg/kg重組抗菌肽,魚體的FBW、WGR和SGR均明顯增加, 但當(dāng)抗菌肽劑量增至50 mg/kg時(shí), 魚體的生長(zhǎng)卻受到抑制。在黃鰭鯛的研究中也已經(jīng)觀察到添加400—1200 mg/kg牛乳鐵蛋白的飼料顯著促進(jìn)了魚體生長(zhǎng)[20]。此外, 本試驗(yàn)結(jié)果還顯示, 在飼料中添加牛乳鐵蛋白肽不會(huì)顯著影響大口黑鱸幼魚的CF、HSI和VSI。這和王自蕊等[6]研究飼料中添加天蠶素抗菌肽對(duì)湘云鯽的影響得到的添加量為150 mg/kg時(shí), 湘云鯽的腎臟指數(shù)、肝胰臟指數(shù)、內(nèi)臟指數(shù)和脾臟指數(shù)沒(méi)有顯著變化的結(jié)論相似。另外也有研究發(fā)現(xiàn), 飼料中添加100—1600 mg/kg的牛乳鐵蛋白對(duì)西伯利亞鱘(Acipenser baeri)的CF和HSI無(wú)顯著影響[22]?？咕牡倪m宜添加量的不同可能與動(dòng)物品種以及抗菌肽的種類有關(guān), 而抗菌肽促生長(zhǎng)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.2 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚消化酶活力的影響

魚類對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分消化、吸收和利用的能力通常由營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率或消化酶活性衡量[23]。目前關(guān)于抗菌肽對(duì)動(dòng)物消化作用影響的研究主要集中在畜禽方面, Yoon等[24]的研究結(jié)果顯示, 合成抗菌肽A3和P5添加組斷奶仔豬全腸的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率均顯著高于對(duì)照組。在對(duì)肉雞的研究中,也有在飼料中添加抗菌脂肽(4000 U/kg)提高十二指腸和空腸內(nèi)容物脂肪酶和蛋白酶活力的報(bào)道[25]。然而, 在飼料中添加0.5 g/kg的蠶抗菌肽AD-酵母制劑對(duì)粵黃雞腸道內(nèi)容物的淀粉酶和蛋白酶活力并無(wú)顯著影響[26]。這種結(jié)果的差異可能是由于所用抗菌肽的種類和來(lái)源(天然或者合成)及物種不同所致。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 在飼料中添加1000 mg/kg的牛乳鐵蛋白肽可以顯著提高大口黑鱸幼魚腸道胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶的活力, 因此該劑量牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚腸道消化能力的提高具有顯著的促進(jìn)作用。除牛乳鐵蛋白肽溶解時(shí)疏水表面的水脂兩親性特點(diǎn)有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化外[10,11],抗菌肽提高魚類消化酶活性的機(jī)制還可能與其對(duì)消化道的生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)作用有關(guān), 研究表明, 抗菌肽能促進(jìn)動(dòng)物腸道的發(fā)育, 增加腸絨毛高度, 而絨毛高度與腸道成熟吸收細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān), 腸道成熟吸收細(xì)胞數(shù)量又與腸道消化酶活性成正相關(guān)[27,28]。

3.3 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道是魚類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位, 而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)存在于刷狀邊緣和基底外側(cè)膜的特定轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)出腸細(xì)胞[29], 腸道絨毛高度的增加通常與更好的腸道健康、更高的營(yíng)養(yǎng)吸收效率密切相關(guān), 從而導(dǎo)致生長(zhǎng)性能的改善[30]。在本研究中, 飼料中添加牛乳鐵蛋白肽在一定程度上提高了魚類前、中、后腸絨毛高度和寬度, 1000 mg/kg添加組結(jié)果最好且顯著優(yōu)于陰陽(yáng)兩對(duì)照組, 說(shuō)明添加一定水平的牛乳鐵蛋白肽對(duì)腸絨毛的生長(zhǎng)發(fā)育具有明顯促進(jìn)作用。研究表明, 抗菌肽能通過(guò)促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖和胞外基質(zhì)蛋白生成的方式修復(fù)腸道損傷[31,32], 同時(shí)還可以促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)、抑制有害菌生長(zhǎng), 優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu), 從而間接促進(jìn)腸道發(fā)育[31—33]。因此在本研究中, 可能是由于飼料中牛乳鐵蛋白肽的添加使得腸道組織結(jié)構(gòu)得以改善, 從而提高了大口黑鱸幼魚的生長(zhǎng)性能。該結(jié)果和已有的研究結(jié)果類似, Yoon等[24]發(fā)現(xiàn)飼料中添加合成抗菌肽A3和P5可增加斷奶仔豬十二指腸和空腸的絨毛高度,提高平均日增重。史慶超等[34]認(rèn)為飼料中添加抗菌肽Surfactin可以顯著提高吉富羅非魚腸絨毛高度, 促進(jìn)其生長(zhǎng)。

杯狀細(xì)胞分布于黏膜柱狀上皮細(xì)胞之間, 可以分泌黏液協(xié)助消化和保護(hù)胃腸道組織免受損傷[35]。腸道組織的完整是保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的順利吸收和防止各類有害病菌異物進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體內(nèi)部的保障[36]。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 在飼料中添加1000 mg/kg牛乳鐵蛋白肽時(shí), 大口黑鱸幼魚前腸杯狀細(xì)胞數(shù)目增加,而隨著牛乳鐵蛋白肽添加量的持續(xù)增加, 腸道組織的完整性有所下降。這說(shuō)明牛乳鐵蛋白肽對(duì)腸道發(fā)育的促進(jìn)作用受到其添加量的影響, 適量添加有益于腸道發(fā)育、過(guò)高反而會(huì)減弱其效果。同樣, 翟少偉等[7]在吉富羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn), 在飼料中添加50 mg/kg抗菌肽Surfactin對(duì)腸道健康狀態(tài)的改善作用顯著優(yōu)于其他高劑量添加組。

3.4 牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚抗病力的影響

魚類的抗病力及免疫力一般可以通過(guò)其感染致病菌后的死亡率高低來(lái)判斷[37], 本文以存活率及免疫保護(hù)率來(lái)評(píng)價(jià)魚類的免疫機(jī)制。已有大量研究證實(shí), 抗菌肽能夠?yàn)樗鷦?dòng)物提供免疫保護(hù)作用[5,6,38]。姜珊等[5]發(fā)現(xiàn), 飼料中添加5—20 mg/kg重組抗菌肽可以顯著降低嗜水氣單胞菌攻毒后吉富羅非魚的死亡率, 5 mg/kg組存活率最高。同樣, 日糧中補(bǔ)充天蠶素抗菌肽的湘云鯽[6]、錦鯉(Cyprinus carpio koi)[38]分別在抵抗嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌感染時(shí)都具有存活率提高的良好表現(xiàn)。此外, 飼喂補(bǔ)充牛乳鐵蛋白的飼料對(duì)尼羅羅非魚[16]、亞洲鯰[17]、黃鰭鯛[20]的細(xì)菌抵抗力也有積極影響。本試驗(yàn)對(duì)飼喂牛乳鐵蛋白肽后的大口黑鱸采用嗜水氣單胞菌進(jìn)行攻毒, 牛乳鐵蛋白肽組的成活率均高于陰性對(duì)照組, 1000 mg/kg牛乳鐵蛋白肽組和陽(yáng)性對(duì)照組的存活率明顯高于陰性對(duì)照組。這表明在飼料中添加適量牛乳鐵蛋白肽可以起到和氟苯尼考相當(dāng)?shù)拇罂诤邝|抵抗嗜水氣單胞菌人工感染的能力, 因而降低了魚體的死亡率。牛乳鐵蛋白肽使大口黑鱸對(duì)嗜水氣單胞菌抵抗力提高可能和其本身的抗菌作用和免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。Bellamy等[9]研究發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都有不同程度的抑制作用, 例如產(chǎn)氣莢膜梭菌、鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等。嗜水氣單胞菌屬于革蘭氏陰性菌, 推測(cè)牛乳鐵蛋白肽對(duì)其同樣具有抵抗能力。其抗菌機(jī)理包括: 阻斷細(xì)菌對(duì)鐵源的吸收而抑制其生長(zhǎng)[39];擾亂代謝途徑使細(xì)胞膜去極化[40], 影響細(xì)胞的細(xì)胞器和遺傳物質(zhì)[41]。此外, 彭麗媛[42]認(rèn)為牛乳鐵蛋白肽作為一種陽(yáng)離子型的抗菌肽, 可以和帶負(fù)電荷的抗原物質(zhì)結(jié)合, 阻斷其對(duì)機(jī)體的免疫刺激, 它還能通過(guò)靜電結(jié)合內(nèi)毒素使其喪失毒性。

3.5 氟苯尼考與牛乳鐵蛋白肽對(duì)大口黑鱸幼魚作用效果的總體比較

氟苯尼考作為一種廣譜抗菌氯霉素類藥物, 憑借著生物利用率高、組織滲透性強(qiáng)、半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn), 逐漸在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用[43]。有研究表明, 長(zhǎng)期服用抗生素會(huì)使魚類處于應(yīng)激狀態(tài), 導(dǎo)致其腸道微生態(tài)紊亂、腸道組織受損并進(jìn)一步引起飼料利用效率變低、生長(zhǎng)性能下降[44]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示, 氟苯尼考的長(zhǎng)期使用對(duì)大口黑鱸幼魚的生長(zhǎng)、消化酶活力和腸道組織結(jié)構(gòu)均造成了負(fù)面影響, 但在抵抗嗜水氣單胞菌感染方面作用顯著。而在飼料中添加1000 mg/kg牛乳鐵蛋白肽不僅有與氟苯尼考相當(dāng)?shù)拿庖咴鰪?qiáng)效果, 且還可以改善大口黑鱸幼魚腸道組織結(jié)構(gòu)、提高腸道消化酶活力進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下, 飼料中添加適量牛乳鐵蛋白肽能提高大口黑鱸幼魚的生長(zhǎng)性能和消化酶活力、改善腸道組織結(jié)構(gòu)和增強(qiáng)抗病力, 且1000 mg/kg添加組效果最佳, 在抗病力及免疫能力方面與氟苯尼考有相當(dāng)?shù)淖饔? 對(duì)魚體腸道組織結(jié)構(gòu)無(wú)不良影響。因此, 在大口黑鱸幼魚飼料中添加1000 mg/kg牛乳鐵蛋白肽可作為功能性飼料開發(fā)的一個(gè)優(yōu)選方案。