蝴蝶蘭組織培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)分析

張 婷

(廣東省惠州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 惠州 516000)

本文研究了蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的相關(guān)技術(shù)，通過實(shí)驗(yàn)論證了在散射光環(huán)境下幼葉誘導(dǎo)蝴蝶蘭原球莖能夠達(dá)到最佳效果。最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA6毫克/升水解乳蛋白500毫克/升+蔗糖5克/升（pH=5.4）；最適增殖培養(yǎng)基為MA+6-BA2毫克/升+NAA1毫克/升+水解乳蛋白500毫克/升+蔗糖25克/升+瓊脂5克/升（pH=5.4）；最適生根長苗培養(yǎng)基為1/2MS+IBA1.5毫克/升+NAA0.05毫克/升+0.3%活性炭+蔗糖25克/升+瓊脂5克/升（pH=5.4）。

1 蝴蝶蘭組織培養(yǎng)技術(shù)的注意事項(xiàng)

1.1 培養(yǎng)基添加物對(duì)蝴蝶蘭增值與分化的影響

一般可以在蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中添加適量天然物質(zhì)，能夠供給蝴蝶蘭幼苗微量營養(yǎng)成分、生長激素等，像是在其中加入120毫克/升香蕉泥，就能夠?qū)υ衟H值進(jìn)行緩沖，以此達(dá)到壯苗與生根作用。相關(guān)資料指出，在培養(yǎng)基中加入適量椰乳或香蕉泥，能夠促進(jìn)原球莖的增值。在蝴蝶蘭叢生芽中加入一定的添加物，能夠促進(jìn)和誘導(dǎo)幼苗生根。而在其內(nèi)加入高濃度活性炭，能夠促進(jìn)原球莖增值。

1.2 原球莖繼代中褐化的防治

蝴蝶蘭與其他蘭科植物類似，原球莖狀體在繼代培養(yǎng)過程中易褐變死亡，很難增值。通過將1克/升活性炭加入到培養(yǎng)基中，并在合適時(shí)間內(nèi)將原球莖褐化的部分進(jìn)行切除，并重新配置新鮮的培養(yǎng)基，防治外植體出現(xiàn)褐變死亡，將10%椰子水加入培養(yǎng)基中，能夠讓原球莖更快生長，在其增值環(huán)節(jié)中有效抑制褐變現(xiàn)象。

2 蝴蝶蘭組織培養(yǎng)技術(shù)分析

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

大紅品系的3～4月齡蝴蝶蘭幼苗。

2.2 試驗(yàn)方法

第一，清洗消毒外植體。取蝴蝶蘭植株幼葉（生長齡分別為2周、4周）與氣生根尖，用自來水清洗。在試驗(yàn)工作臺(tái)絕對(duì)干凈的環(huán)境下，將葉與根尖置入無菌瓶中，用75%酒精消毒半分鐘，之后利用無菌水重復(fù)清洗3次，再將其浸泡在0.1%升汞溶液中，持續(xù)10分鐘，再用無菌水重復(fù)沖洗4次，結(jié)束后放置待用。第二，原球莖的誘導(dǎo)。將幼葉切塊，每塊規(guī)格4毫米×4毫米，長根尖規(guī)格為8毫米，使用極性接種方式，培養(yǎng)基選擇MS，加入NAA1毫克/升激素與不同濃度BA（1毫克/升、2毫克/升、4毫克/升L、6毫克/升）配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所要比較的光照環(huán)境為散射光與2000勒克斯兩種，每瓶要完成一個(gè)接種工作，處理10瓶后，重復(fù)操作3次。2個(gè)月后對(duì)不同外植體在不同培養(yǎng)基中原球莖的誘導(dǎo)率與生長狀態(tài)進(jìn)行觀察總結(jié)。第三，原球莖增殖。在MS培養(yǎng)基中以5個(gè)為單位將原球莖接種到其中，并在其內(nèi)加入NAA1毫克/升激素與不同濃度BA（1毫克/升、2毫克/升、4毫克/升、6毫克/升）配比的增殖培養(yǎng)基。2個(gè)月后，對(duì)原球莖所得到的增殖倍數(shù)以及原球莖大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在上述培養(yǎng)基中加入500毫克/升水解乳蛋白，5克/升瓊脂以及25克/升蔗糖，pH值5.4，培養(yǎng)條件均為26℃，光照時(shí)間18小時(shí)，光照強(qiáng)度2000勒克斯。

2.3 壯苗與生根

將培養(yǎng)基所產(chǎn)生的蝴蝶蘭小苗轉(zhuǎn)接到各生根培養(yǎng)基中，每瓶3株，待10瓶完成后，上述流程重復(fù)3次，在30天后對(duì)苗生根率以及生長狀態(tài)、平均生根率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在生根培養(yǎng)基中加入0.3%的活性炭+蔗糖25克/升+瓊脂5克/升，培養(yǎng)條件均26℃，光照時(shí)間18小時(shí)，光照強(qiáng)度2000勒克斯。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同外植體誘導(dǎo)原球莖的差異

以蝴蝶蘭根尖、幼葉（分別為2周、1個(gè)月）的葉來展開誘導(dǎo)原球莖的實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)率最高為38%，褐變率最低為6%。成熟葉難以產(chǎn)生較高的誘導(dǎo)率，且褐化嚴(yán)重到39%。蝴蝶蘭根尖未誘導(dǎo)出原球莖。從結(jié)果上看，幼葉生長齡在2周的更容易產(chǎn)生原球莖。而就相同葉片來說，葉基部較葉中和葉尖的切塊能產(chǎn)生更高的誘導(dǎo)率。幼葉如果尺寸較小，即使不切割也能夠達(dá)到原球莖誘導(dǎo)的目的。

3.2 不同濃度的BA對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響

以大小在2厘米左右、生長齡在一周、色澤嫩綠的葉片做誘導(dǎo)材料。在做好滅菌處理后將其中的原球莖接種到不同濃度的BA培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)到15～20天發(fā)現(xiàn)葉片被切割周圍產(chǎn)生鮮綠色的原球莖狀小突起，和快發(fā)育成原球莖。

從表1看，BA培養(yǎng)液在不同濃度的情況下會(huì)對(duì)原球莖誘導(dǎo)率與大小造成較為明顯的影響。隨著2毫克/升的BA濃度上升到6毫克/升的BA濃度，最高誘導(dǎo)率為37.33%，高濃度BA對(duì)原球莖的誘導(dǎo)有著促進(jìn)作用。但原球莖直徑會(huì)隨著濃度的增大呈現(xiàn)由小到大再由大到小的趨勢(shì)。BA6毫克/升時(shí)存在最大原球莖直徑3.5毫米，BA10毫克/升時(shí)存在最小原球莖直徑1.6毫米。

表1 不同濃度6-BA對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響

4 不同光照條件對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響

在誘導(dǎo)原球莖的操作階段，外植體容易產(chǎn)生褐化現(xiàn)象，為能做好褐化問題的防治工作，需要頻繁更換培養(yǎng)基，通常每10天更換一次，在培養(yǎng)基更換過程要避免葉片被放置過長實(shí)踐，以此降低褐化程度。在培養(yǎng)過程中，可發(fā)現(xiàn)光照強(qiáng)弱也會(huì)影響到褐化程度，當(dāng)達(dá)到2000勒克斯的光照前度后，會(huì)產(chǎn)生很嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象，褐化程度將達(dá)到40%；如果光照是由其他培養(yǎng)架反射的弱散射光而形成，將能夠較好的抑制褐化現(xiàn)象，褐化程度只有10%。

5 不同濃度BA對(duì)原球莖增殖與誘導(dǎo)出苗的影響

將所誘導(dǎo)的原球莖接種到增殖培養(yǎng)基中來實(shí)行增殖培養(yǎng)。通過表2可以看出，BA在不同濃度時(shí)對(duì)原球莖大小存在較為明顯的影響。濃度增加，原球莖增殖配屬也將增加，而原球莖大小成先升后降趨勢(shì)。當(dāng)BA濃度為6毫克/升時(shí)，能夠達(dá)到最高原球莖增殖倍數(shù)6.8，原球莖最小為1.7。而在增殖的過程中還會(huì)生成許多叢生芽。如果BA濃度降低，當(dāng)其為2毫克/升，原球莖將減小增殖倍數(shù)。

表2 不同濃度6-BA對(duì)原球莖增殖和生長的影響

但生成的原球莖多而粗壯，因而最佳BA濃度為2毫克/升。

6 原球莖的生根壯苗

在小苗增殖后將其接種到生根壯苗培養(yǎng)基中，可以得到結(jié)果，基本培養(yǎng)基為1/2MA，NAA為0.05毫克/升，IBA為1.5毫克/升時(shí)，苗的生根率達(dá)到最高500%，且苗的生長勢(shì)最健壯。

7 結(jié)束語

通過實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，光照條件、外植體個(gè)數(shù)、BA濃度的不同，都會(huì)對(duì)原球莖的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響，葉基部的切塊較葉中和葉尖的誘導(dǎo)率更高，通過切割葉片時(shí)，如果切口過多，會(huì)導(dǎo)致葉片加快褐化死亡。因此在切割葉片的過程中，應(yīng)從葉基部進(jìn)行切割，以此提高誘導(dǎo)率。在實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，BA濃度增加，能夠提高原球莖增殖率，同時(shí)即使不加BA，原球莖也能實(shí)現(xiàn)增殖，大概率是因?yàn)樵蚯o體內(nèi)以存在一定的細(xì)胞分裂素。在生根壯苗培養(yǎng)環(huán)節(jié)，2/1MS能夠產(chǎn)生更好的效果。