改進的固相萃取-高效液相色譜法測定土壤中15種醛酮類化合物

薛昆鵬, 俞靈鈺, 任興發(fā), 屠炳芳, 陳 超, 徐 婷, 何 歡, 胡 帥

(1. 南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 江蘇 南京 210097; 2. 浙江月旭材料科技有限公司, 浙江 金華 321016; 3. 永康市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測中心, 浙江 金華 321300)

醛酮類化合物是土壤中常見的含氧有機污染物,是重要的污染物之一。土壤中的醛酮類化合物大多具有刺激性和毒性[1],該類化合物對人的眼睛、鼻子、皮膚、肺和呼吸道等均有強烈的刺激性,且有致癌、致畸等風(fēng)險,危害性不容小覷[2]。土壤中的醛酮類化合物主要是人類活動所造成的,化工、制藥、印染和農(nóng)藥生產(chǎn)等企業(yè)大量使用醛酮類化合物,尤其是甲醛被大量用作拔色劑、還原劑、消毒劑和防腐劑等的化學(xué)原料試劑,其運輸、儲存過程中發(fā)生的泄露以及排放的廢水進入土壤和沉積物,是醛酮類化合物重要的污染來源。目前國內(nèi)外制定并頒布的環(huán)境法規(guī)中均將醛酮類化合物列入重點控制的有毒有害污染物名單。2022年國務(wù)院發(fā)布的第三次全國土壤普查通知文件也將土壤中醛酮類化合物作為重點監(jiān)測對象之一。

常用于檢測醛酮類化合物的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3-13]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[14-17]、氣相色譜法(GC)[18-20]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[21,22]等。在這些方法中,色譜法主要是利用2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine, 2,4-DNPH)與醛酮類化合物結(jié)構(gòu)上的羰基反應(yīng)生成穩(wěn)定的腙類化合物,然后經(jīng)過常規(guī)的液液萃取方式進行濃縮,最后進行分離檢測。該方法存在的問題是液液萃取需要消耗大量的有機溶劑,會造成二次污染,且檢測靈敏度不高;采用GC-MS和HPLC-MS進行檢測雖然能夠極大程度地提高醛酮類化合物的檢測靈敏度,但是儀器設(shè)備昂貴,實驗室配置率低,質(zhì)譜儀器對檢測人員的技術(shù)水平要求也較高,從而導(dǎo)致該方法在基層實驗室可操作性不強;且由于土壤基質(zhì)復(fù)雜,測定時存在嚴重的基質(zhì)干擾效應(yīng),因此檢測難度也較大。環(huán)境標準HJ 997-2018[23]采用的檢測方法主要是利用醋酸-醋酸鈉溶液對土壤進行振蕩提取,提取液中的醛酮類化合物在一定溫度和pH下與2,4-DNPH發(fā)生衍生化反應(yīng),生成穩(wěn)定的腙類化合物,利用C18小柱對樣品進行凈化,然后用高效液相色譜-紫外檢測法對醛酮類化合物進行測定。使用該小柱凈化步驟簡單,并不需要經(jīng)過復(fù)雜的液液萃取步驟,效果明顯;該標準針對15種醛酮類化合物的方法檢出限為0.02～0.06 mg/kg,定量限為0.08～0.24 mg/kg。但是,該標準中采用的檢測方法存在一些問題,主要表現(xiàn)為以下幾點:(1)提取劑用量大,樣品需要用高達200 mL醋酸-醋酸鈉提取溶劑進行提取,提取時間長且提取不完全;(2)衍生的溶劑體系中有機相比例極低導(dǎo)致衍生不完全[24]; (3)采用C18小柱進行前處理凈化時發(fā)現(xiàn),由于C18小柱是純粹的反相疏水模式的小柱,其吸附保留、分離模式單一,很容易造成目標物吸附穿透,從而導(dǎo)致回收率偏低。

針對上述問題,本文采用乙腈作為提取溶劑,大大縮短了提取時間;改進了凈化方式,利用具有高比表面積、大孔徑和均勻孔道結(jié)構(gòu)的親水親脂平衡的N-乙烯基吡咯烷酮/二乙烯基苯共聚物填料小柱進行前處理凈化,由于該填料表面同時具有親水性吡咯烷酮基團和疏水性苯基基團,能夠兼顧15種醛酮類化合物的保留和土壤樣品中雜質(zhì)的去除效果,從而克服了HJ 997-2018方法采用C18小柱無法對15種醛酮類化合物進行有效吸附、保留等問題,獲得了滿意的雜質(zhì)去除效果和理想的加標回收率。該方法改進了HJ 997-2018標準中存在的不足,在檢測效率、準確度和重復(fù)性等方面均具有較大提升,極其適用于土壤中15種醛酮類化合物的準確定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate3000高效液相色譜儀(ThermoFisher公司); JP-020S超聲波清洗器(功率600 W、頻率40 kHz,深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司); XW-80A渦旋混合儀振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); 12位真空固相萃取裝置與Welchrom?BRP固相萃取小柱(規(guī)格為1 000 mg/6 mL)購自浙江月旭材料科技有限公司。

甲醛(FOR,純度37%)、乙醛(ACETA,純度40%)、丙烯醛(ACR,純度98%)、丙酮(ACETO,純度99%)、丙醛(PRO,純度97%)、丁烯醛(CRO,純度99%)、丁醛(BUT,純度99%)、苯甲醛(BEN,純度99%)、異戊醛(ISO,純度97%)、正戊醛(VAL,純度97%)、鄰-甲基苯甲醛(o-TOL純度97%)、間-甲基苯甲醛(m-TOL純度97%)、對-甲基苯甲醛(p-TOL純度97%)、正己醛(HEX,純度98%)、2,5-二甲基苯甲醛(DIM,純度99%),購于德國Merck公司;15種醛酮類化合物-DNPH混合標準溶液(甲醛-DNPH、乙醛-DNPH、丙烯醛-DNPH、丙酮-DNPH、丙醛-DNPH、丁烯醛-DNPH、丁醛-DNPH、苯甲醛-DNPH、異戊醛-DNPH、正戊醛-DNPH、鄰-甲基苯甲醛-DNPH、間-甲基苯甲醛-DNPH、對-甲基苯甲醛-DNPH、正己醛-DNPH和2,5-二甲基苯甲醛-DNPH,以醛、酮類化合物計的質(zhì)量濃度均為100 mg/L),購自上海安譜實驗科技股份有限公司。乙腈(色譜純,德國Merck公司); 2,4-DNPH(色譜純,上海麥克林生化科技有限公司);磷酸(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。實驗用水為娃哈哈超純水(色譜級,杭州娃哈哈集團有限公司)。

主要試驗材料為土壤,所有樣品均采集于金華市婺城區(qū)白龍橋附近不同區(qū)域的土壤。

1.2 標準溶液的配制

系列標準溶液:將100 mg/L醛酮-DNPH混合標準溶液用乙腈配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、2、5、10和20 mg/L的系列標準溶液。

DNPH衍生劑:準確稱取0.3 g 2,4-DNPH粉末,用乙腈溶解定容至100 mL,質(zhì)量濃度為3 g/L。

1.3 樣品的提取和衍生

提取:首先,去除土壤樣品中的異物(石子、葉片等),稱取10 g土壤樣品于50 mL離心管中,準確加入25 mL乙腈,渦旋混勻,30 ℃條件下超聲分散提取10 min, 4 000 r/min離心5 min,收集上清液;然后準確加入15 mL乙腈,重復(fù)提取一次,4 000 r/min離心5 min,收集上清液;第三次準確加入10 mL乙腈重復(fù)提取,4 000 r/min離心5 min,收集上清液。合并3次提取后的上清液,待衍生。

衍生:準確移取25 mL樣品提取液,加入6 mL的DNPH衍生劑,1 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的磷酸溶液,于4 ℃條件下衍生6 h,加入100 mL水稀釋,待凈化。

1.4 樣品的凈化

采用BRP小柱對樣品進行凈化,分為以下4個步驟:(1)活化:向BRP固相萃取小柱中依次加入10 mL乙腈和10 mL 20%(v/v)乙腈水溶液,棄去流出液;(2)上樣:將待凈化溶液加入活化后的小柱中,控制流速為2～3滴/s,棄去流出液;(3)淋洗:加入10 mL 20%乙腈水溶液,棄去流出液;(4)洗脫:加入9 mL乙腈洗脫小柱,收集洗脫液至10.0 mL容量瓶中,并用乙腈定容至10 mL,待檢測。

1.5 液相色譜條件

色譜柱:月旭Ultimate?XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相:乙腈-水(65∶35, v/v);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL;檢測波長:360 nm。

1.6 基質(zhì)匹配標準溶液的配制

按照1.4節(jié)的步驟,采用SPE小柱對空白樣品進行前處理,收集乙腈洗脫液作為空白基質(zhì)溶液,配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、2、5、10和20 mg/L的基質(zhì)匹配標準溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

HJ 997-2018標準采用的液相色譜流動相條件為乙腈-水(60∶40, v/v),該標準給定的參考色譜圖見圖1?？梢钥闯龉灿?組峰無法基線分離,分別是ACR和ACETO、m-TOL和p-TOL、HEX和DIM。本文考察了流動相中乙腈的比例對15種醛酮類化合物分離的影響。將乙腈的比例分別調(diào)整為60%、65%和68%,考察15種醛酮類化合物的分離效果。結(jié)果表明15種醛酮類化合物的分離度對流動相中有機相的比例極為敏感,如圖2所示。15種醛酮類化合物在3種不同乙腈比例下,仍然有兩組目標物無法基線分離,分別是ACR和ACETO、m-TOL和p-TOL,但是,HEX和DIM卻完全能夠基線分離,分離度均超過1.5,明顯優(yōu)于HJ 997-2018標準給定色譜圖的分離效果。此外,流動相乙腈的比例分別為65%和68%時,ACR和ACETO、m-TOL和p-TOL這兩組目標物的分離度類似,65%乙腈對15種醛酮類化合物的整體分離效果更好,且15種醛酮類化合物的保留時間均在30 min以內(nèi),因此本文選擇65%乙腈水溶液作為最優(yōu)的流動相。

圖1 HJ 997-2018標準中15種醛酮-DNPH衍生物的色譜圖[23]

圖2 15種醛酮-DNPH衍生物標準溶液的色譜圖

2.2 衍生試劑的選擇

HJ 997-2018標準采用的衍生方法具體為:準確移入采用醋酸-醋酸鈉緩沖液提取的樣品提取液100 mL于平底燒瓶中,加入4 mL pH 3.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、6 mL 2,4-DNPH乙腈溶液,置于恒溫振蕩器中,40 ℃振蕩1 h。該衍生體系中水和乙腈的比例約為17∶1,水分的含量極高,而2,4-DNPH試劑微溶于水,從而造成衍生后有明顯的絮狀沉淀析出,且衍生產(chǎn)物腙類化合物在高比例的水中不穩(wěn)定[24],如圖3a所示。增加衍生體系中乙腈的比例,當水和乙腈比例為10∶1時,仍然可以看到有部分絮狀沉淀出現(xiàn),如圖3b所示。因此,本文改進了HJ 997-2018標準中的衍生方式,在衍生過程中增加乙腈的比例,具體為:準確移取100 mL用乙腈提取的樣品提取液,依次加入6 mL 2,4-DNPH乙腈溶液衍生試劑和1 mL 20%磷酸溶液后于4 ℃冷藏衍生6 h,結(jié)果表明沒有絮狀沉淀析出,如圖3c所示。該結(jié)果也進一步證明了乙腈作為土壤的提取溶劑是合適的,不僅有利于土壤基質(zhì)中目標物提取完全,同時也確保了醛酮類化合物在高比例有機相衍生溶劑體系下與2,4-DNPH衍生完全,不產(chǎn)生絮狀沉淀。

圖3 不同溶劑體系對15種醛酮類化合物的衍生效果

2.3 提取與凈化條件考察

2.3.1提取溶劑的選擇

按照HJ 997-2018標準推薦的方法進行土壤中15種醛酮類化合物提取效率的考察。具體步驟為:采用醋酸-醋酸鈉溶液作為提取液,經(jīng)2,4-DNPH衍生、C18小柱凈化后測定其提取回收率,結(jié)果如圖4所示。采用該提取方法時o-TOL、m-TOL、p-TOL和HEX的提取效率為0,且除FOR以外的其他醛酮類化合物的提取效率均在65.6%以下。針對這種情況,本文改變提取溶劑的種類進行提取,分別選用50 mL 10%乙腈水溶液、50 mL 50%乙腈水溶液以及50 mL乙腈分別提取3次,結(jié)果表明:采用10%乙腈水溶液和50%乙腈水溶液進行提取均有多種醛酮類化合物無法提取完全,m-TOL和p-TOL的提取效率仍然為0,且DIM的提取效率也僅為28.6%,處于較低水平。而采用乙腈的提取效果不但溶劑用量少,僅為標準方法提取溶劑體積的1/4,且提取效率高,加標回收率為64.5%～135.3%。原因可能是利用有機溶劑作為提取溶劑,依據(jù)相似相溶原理,乙腈能夠高效地將醛酮類化合物從土壤中萃取出來。

圖4 提取溶劑對15種醛酮類化合物提取效率的影響

2.3.2提取溫度的選擇

實驗過程中考察了20、30、40、50、60和70 ℃等不同提取溫度對醛酮類化合物提取效率的影響,結(jié)果見圖5。提取溫度低于30 ℃時,15種醛酮類化合物的提取效率較為穩(wěn)定,均在80.0%以上。提取溫度超過30 ℃時,大部分醛酮類化合物的提取效率降低,原因可能是15種醛酮類化合物大多是揮發(fā)性有機污染物,當提取溫度較高時會因為揮發(fā)造成損失,從而導(dǎo)致提取效率偏低。綜合考慮,本文選用提取溫度為30 ℃。

圖5 提取溫度對15種醛酮類化合物提取效率的影響

2.3.3樣品提取時間的選擇

HJ 997-2018標準給定的樣品提取時間為不少于18 h,提取時間較長。因此,本文考察了5、10、20、40和60 min等不同提取時間對醛酮類化合物提取效率的影響,結(jié)果見圖6。

由圖6可以看出,提取10 min時,提取效率達到最高,15種醛酮類化合物基本在80%以上,之后趨于穩(wěn)定。原因可能是乙腈作為有機溶劑萃取目標物的能力強,可以將醛酮類化合物快速地從土壤中萃取出來,從而縮短提取時間。

2.3.4樣品凈化小柱的選擇及優(yōu)化

按照HJ 997-2018的要求,用商品化的反相SPE柱對多種土壤進行前處理凈化。分別考察了使用Welchrom?C18小柱、Welchrom?PS-DVB小柱和Welchrom?BRP小柱(規(guī)格均為1 000 mg/6 mL)等3種不同類型的SPE小柱的凈化效果。結(jié)果表明:采用BRP小柱進行凈化后15種醛酮類化合物的加標回收率均在80.1%以上,而C18小柱和PS-DVB小柱有相當一部分目標物的加標回收率在70.0%以下。其中,C18小柱對ISO和VAL的加標回收率分別為62.4%和70.3%; PS-DVB小柱對ISO和VAL的加標回收率分別為71.7%和72.1%。原因可能是BRP和PS-DVB聚合物基質(zhì)小柱比表面積遠高于硅膠基質(zhì)C18小柱,粒徑相比硅膠基質(zhì)填料來說也更大,因而吸附容量更大,目標物在填料中擴散得更快,不會造成小柱堵塞;并且,BRP和PS-DVB填料的平均孔徑更大、孔道結(jié)構(gòu)分布比較均一,達到20 nm,而C18填料平均孔徑僅為4 nm,因而聚合物基質(zhì)填料小柱能夠促使目標物較好地保留且與土壤基質(zhì)中的雜質(zhì)較好地分離,3種小柱的填料理化參數(shù)如表1所示,SEM圖譜如圖7所示,可以明顯看出PS-DVB和BRP填料是相對均一的球型形貌,而C18填料存在一些不規(guī)則的顆粒,因此由于傳質(zhì)阻力的增大,導(dǎo)致其保留目標物和去除雜質(zhì)的效果不如球形的聚合物填料。而BRP小柱的加標回收率優(yōu)于PS-DVB小柱的原因可能是:BRP小柱填料是兼顧親水親脂平衡的分離材料,它可以通過反相疏水、空間位阻、氫鍵和離子交換等多種化學(xué)作用力對15種醛酮類化合物均具有較強的化學(xué)作用力,從而使得15種醛酮類化合物具有較高的加標回收率;而PS-DVB只能通過純粹的疏水作用力和目標物產(chǎn)生相互作用,無法兼顧結(jié)構(gòu)相似的醛酮目標物(例如o-TOL、m-TOL和p-TOL等)的保留和分離。

表1 3種反相固相萃取小柱的填料理化參數(shù)

圖7 3種固相萃取小柱填料的SEM形貌圖

對1.6節(jié)配制的基質(zhì)匹配溶液和與其具有相同濃度的標準溶液在同等條件下進行測定,比較二者的峰面積,用于評價3種固相萃取小柱凈化方式的基質(zhì)效應(yīng)(ME),具體見公式(1)[25]。

(1)

式中,Am、Ab和As分別為基質(zhì)匹配標準溶液、空白基質(zhì)溶液和標準溶液中目標物的峰面積。3種不同類型的小柱凈化對15種醛酮目標物基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表2所示?？梢钥闯?采用C18小柱對15種醛酮類化合物的ME值為110.4%～145.6%, PS-DVB小柱對15種醛酮類化合物的ME值為108.7%～132.1%, BRP小柱對15種醛酮類化合物的ME值為90.5%～109.7%,進一步說明了BRP小柱能夠最大限度地降低基質(zhì)效應(yīng),提高分析測試結(jié)果的準確度,滿足其定量要求。

表2 3種SPE填料對15種醛酮類化合物基質(zhì)效應(yīng)的影響(n=6)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍與檢出限

準確配制0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10和20 mg/L的標準系列溶液,分別進樣20 μL,采用峰面積定量,測定結(jié)果進行線性回歸,線性曲線方程(y為峰面積,x為質(zhì)量濃度,mg/L)見表3,相關(guān)系數(shù)為0.996以上,可以滿足定量的要求。以信噪比為3和10時樣品的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ), 15種醛酮類化合物的LOD為0.02～0.06 mg/L,LOQ為0.10～0.20 mg/L。15種醛酮類化合物的LOD和LOQ大多優(yōu)于HJ 997-2018中規(guī)定的結(jié)果。

表3 15種醛酮類化合物的線性關(guān)系、檢出限和定量限

2.4.2準確度和精密度

在空白土壤樣品中加入一定濃度的醛酮類化合物標準溶液,使得樣品中醛酮類化合物的含量分別為0.2、0.5和2.0mg/kg,每個添加水平做6個平行試驗,按照上述優(yōu)化的實驗方法進行加標回收率試驗,計算平均回收率和相對標準偏差(RSD),如表4所示。15種醛酮類化合物的平均加標回收率為84.6%～115.9%,RSD為0.2%～5.1%。標準方法的加標回收率測定結(jié)果普遍在80%以下,充分說明本方法的準確度和精密度良好。

表4 15種醛酮類化合物的加標回收率及RSD (n=6)

2.5 實際土壤樣品的測定

選取10份金華市婺城區(qū)城鄉(xiāng)接合部工業(yè)園區(qū)土壤樣品, 按照優(yōu)化的實驗方法進行測定。結(jié)果表明:本次采集的土壤中甲醛、乙醛、丙酮和苯甲醛這4種醛酮類化合物均有檢出,其中甲醛的最大殘留量為0.94 mg/kg,乙醛的最大殘留量為1.53 mg/kg,丙酮的最大殘留量為1.34 mg/kg,苯甲醛的最大殘留量為1.36 mg/kg,充分表明土壤中存在的這4種醛酮類化合物值得重點關(guān)注。

3 結(jié)論

本文建立了改進的固相萃取-高效液相色譜法快速測定土壤中15種醛酮類化合物的方法。方法線性范圍、檢出限、精密度、準確度以及實際樣品測定均取得了滿意結(jié)果,表明本方法具有簡單準確、檢測效率高等特點。與現(xiàn)有的環(huán)境標準HJ 997-2018標準方法相比,該方法具有樣品提取效率高、節(jié)省試劑、靈敏度和準確度高、回收率高、重復(fù)性好等優(yōu)點,可以滿足大批量土壤樣品中15種醛酮類化合物的快速、同時檢測。