張子杭, 成元華, 2, 李小梅

胃癌起源于胃表層黏膜[1-2］。侵襲和轉(zhuǎn)移是病人死亡的主要原因[3］。胃癌的發(fā)病率逐年升高, 在全球癌癥死亡率中排第二[4］, 但其確切發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）信號(hào)通路參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展[5］, 胃癌病人TGF-β1（TGF-β通路激活劑）的高表達(dá)可能與病人預(yù)后差相關(guān)[6-7］。當(dāng)給予外源性TGF-β1時(shí), 腫瘤細(xì)胞的生長速度、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力均增加[8］。TGF-β1通過促進(jìn)腫瘤間質(zhì)中血管的生長從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞侵襲能力, SB431542可抑制激活素受體樣激酶（activin receptor-like kinase, ALKs）活力, 是ALK家族中ALK-5（TGF-βI型受體）的有效抑制劑, SB431542使胞內(nèi)信號(hào)蛋白Smad2和Smad3不能被激活, 進(jìn)一步抑制其磷酸化過程, TGFβ信號(hào)通路因此被阻斷。TGF-β信號(hào)通路已被證實(shí)參與體內(nèi)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-mesenchymal transition, EMT）的激活[9］。TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過Smads的中間傳導(dǎo), 使信號(hào)得以從細(xì)胞外部傳入到細(xì)胞內(nèi)部, 是TGF-β信號(hào)通路傳導(dǎo)的關(guān)鍵。相關(guān)研究提示, EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Slug在高分化胃癌中低表達(dá), 在低分化胃癌中高表達(dá), 而上皮鈣黏素（E-cadherin, E-cad）的表達(dá)則與之相反, 不難推測胃癌惡性程度與slug蛋白的表達(dá)程度成正比, 而與E-cad表達(dá)程度成反比。本研究于2021年1月至2022年1月, 旨在探討TGF-β信號(hào)通路對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖侵襲能力、slug和E-cad蛋白表達(dá)的影響, 以期進(jìn)一步為闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制, 充實(shí)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑 胃癌HGC-27細(xì)胞系購自上海傳秋生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自KATAWA。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑 TGF-β1購自美國Enzo, TGF-β通路阻滯劑SB-431542購自MedChemExpress, 二甲基亞砜（DMSO）購自Solarbio Technology公司, 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購自大連美倫生物科技公司, 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上?？道噬锟萍脊? RIPA細(xì)胞裂解液購自索萊寶科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 配置88%RPMI 1640+11%胎牛血清（FBS）+1%雙抗體成分的完整細(xì)胞培養(yǎng)基（KATAWA有限公司）, 在37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 體外實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)對(duì)細(xì)胞給藥不同進(jìn)行分組：（1）空白對(duì)照組：僅使用等量常規(guī)培養(yǎng)基；（2）激 動(dòng) 劑 組：TGF-β1（25 μg/L）；（3）阻 斷 劑 組：SB431542（2 mg/L）；（4）激動(dòng)劑+低濃度阻斷劑組：TGF-β1（25 μg/L）+SB431542（2 mg/L）；（5）激動(dòng)劑+高濃度阻斷劑組：TGF-β1（25 μg/L）+SB431542（4 mg/L）。

1.2.3 CCK-8檢測體外細(xì)胞增殖活性 培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系HGC-27后, 共分為五組, 每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性, 在96孔板中配置100 μL細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板放入37 ℃, 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)分組情況, 每孔加入試劑10 μL, 分別于0、6、12、24、48和72 h時(shí)行CCK-8法檢測。測量450 nm處的吸光度。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 配置基質(zhì)膠, 使其達(dá)到基質(zhì)膠∶PBS=1∶8的比例, 將人胃癌HGC-27細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中, 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 按照分組加入藥物, 在Transwell小室的上室膜上用棉簽均勻涂抹預(yù)先配置好的基質(zhì)膠, 37 ℃條件下放置30 min, 小室的下室中加入500 μL完全培養(yǎng)基, 上室中加入200 μL按照分組處理后的細(xì)胞懸液（無血清）。37 ℃過夜, 棄去孔中培養(yǎng)液, 使用PBS潤洗2遍, 用棉簽輕輕擦去上層未遷移細(xì)胞, 甲醛固定30 min, 將小室適當(dāng)風(fēng)干。用0.1%結(jié)晶紫染色30～60 min, 用PBS洗3遍。用棉簽輕輕擦掉上室水分。于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.2.5 ELISA試劑盒檢測不同組細(xì)胞slug和E-cad蛋白表達(dá)情況 使用PBS清洗培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞, 冰浴條件下加入300 μL RIPA細(xì)胞裂解液, 反復(fù)鋪勻10 min, 刮取細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至冰浴下的離心管中吹打數(shù)次, 持續(xù)裂解10 min, 裂解完成后12 000g, 4 ℃, 離心5 min, 吸取上清, 上清液使用ELISA試劑盒檢測, 標(biāo)準(zhǔn)孔各加50 μL不同標(biāo)準(zhǔn)濃度；分別設(shè)置待測空白孔和樣品孔。稀釋后, 樣品的最終稀釋度為5倍。加入100 μL酶標(biāo)試劑, 密封避光, 37 ℃孵育60 min, 棄去液體, 洗滌5次, 顯色后在450 nm波長處測量各孔的吸光度。根據(jù)試劑盒說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線從而計(jì)算各組細(xì)胞總蛋白中slug和E-cad蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示, 多組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β通路對(duì)HGC-27細(xì)胞體外增殖活性的影響使用CCK-8對(duì)細(xì)胞進(jìn)行增殖活性檢測后, 結(jié)果顯示：在12 h內(nèi), 各組之間增殖能力幾乎沒有差別（P＞0.05）；24 h后激動(dòng)劑組細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于空白對(duì)照組（P＜0.05）；阻斷劑組細(xì)胞增殖活性在24 h后低于空白對(duì)照組（P＜0.05）；激動(dòng)劑+高濃度阻斷劑與激動(dòng)劑+低濃度阻斷劑兩組的細(xì)胞增殖活性在24 h內(nèi)與空白對(duì)照組相比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）, 在24 h后兩組增殖活性出現(xiàn)明顯下降, 但與空白對(duì)照組相比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.181）。見表1。

表1 TGF-β通路促進(jìn)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖活性/±s

表1 TGF-β通路促進(jìn)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖活性/±s

注：TGF-β為轉(zhuǎn)錄生長因子β。①與空白對(duì)照組比較,P＜0.05。

組別空白對(duì)照組激動(dòng)劑組阻斷劑組激動(dòng)劑+低濃度阻斷劑組激動(dòng)劑+高濃度阻斷劑組F值P值重復(fù)次數(shù)5 5 5 5 5 0 h 0.42±0.13 0.41±0.16①0.41±0.13①0.40±0.13①0.40±0.16①10.02 0.785 6 h 0.43±0.15 0.58±0.13①0.41±0.13①0.43±0.12①0.43±0.11①40.25 0.348 12 h 0.51±0.13 0.59±0.14①0.43±0.14①0.52±0.19①0.51±0.14①105.16 0.193 24 h 0.52±0.10 0.70±0.13①0.50±0.11①0.55±0.13①0.42±0.16①431.49 0.001 48 h 0.57±0.11 0.72±0.12①0.32±0.16①0.59±0.11①0.41±0.13①316.48 0.013 72 h 0.59±0.13 0.81±0.13①0.38±0.11①0.43±0.13①0.38±0.16①441.25 0.001

2.2 使用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測體外培養(yǎng)人胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力變化各組細(xì)胞使用藥物處理24 h后, 于倒置顯微鏡下觀察到, 細(xì)胞穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量激動(dòng)劑組多于空白對(duì)照組, 阻斷劑組低于空白對(duì)照組, 均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而激活劑+高濃度阻斷劑組和激活劑+低濃度阻斷劑組與空白對(duì)照組相比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.179）。見表2。

表2 TGF-β通路激活和阻斷后胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的變化/（個(gè),±s）

表2 TGF-β通路激活和阻斷后胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力的變化/（個(gè),±s）

注：TGF-β為轉(zhuǎn)錄生長因子β。①與空白對(duì)照組比較,P＜0.05。

組別空白對(duì)照組激動(dòng)劑組阻斷劑組激動(dòng)劑+低濃度阻斷劑組激動(dòng)劑+高濃度阻斷劑組F值P值重復(fù)次數(shù)5 5 5 5 5細(xì)胞遷移數(shù)117.81±3.11 227.45±5.46①68.47±3.36①113.84±5.21①115.19±5.12①479.15 0.001

2.3 ELISA檢測體外培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞的slug和E-cad蛋白的表達(dá)情況激動(dòng)劑組的slug蛋白表達(dá)水平高于空白對(duì)照組（P=0.001）；阻斷劑組slug蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組和激動(dòng)劑組（P＜0.000 1）；激動(dòng)劑+高濃度阻斷劑組slug蛋白表達(dá)水平低于激動(dòng)劑組（P=0.009）。激動(dòng)劑組E-cad蛋白水平低于空白對(duì)照組（P＜0.000 1）；阻斷劑組E-cad蛋白濃度高于其他組（P＜0.000 1）。見表3。

表3 TGF-β通路激活促進(jìn)slug蛋白表達(dá)并抑制E-cad表達(dá)/±s

表3 TGF-β通路激活促進(jìn)slug蛋白表達(dá)并抑制E-cad表達(dá)/±s

注：TGF-β為轉(zhuǎn)錄生長因子β, slug為slug蛋白, E-cad為上皮鈣黏素。①與空白對(duì)照組比較,P＜0.05。

組別空白對(duì)照組激動(dòng)劑組阻斷劑組激動(dòng)劑+低濃度阻斷劑組激動(dòng)劑+高濃度阻斷劑組F值P值重復(fù)次數(shù)55555 Slug 101.25±20.11 149.45±24.46①43.16±10.26①87.46±15.21①74.22±10.12①447.59 0.007 E-cad 41.56±25.26 23.54±9.42①138.55±20.44①38.46±10.52①34.16±10.22①347.26 0.011

3 討論

TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在不同腫瘤中都通過EMT促進(jìn)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移[10］, 相關(guān)研究表明, 激活該信號(hào)通路后, 上皮細(xì)胞獲得侵襲特性[11］, 其生長速度和轉(zhuǎn)移能力得到提高[12］。在TGF-β信號(hào)通路中, Smads蛋白家族界導(dǎo)了TGF-β信號(hào)從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞核的過程[13］, 從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT的進(jìn)展, 調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老、遷移等[14］。

EMT主要特征是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad表達(dá)降低[15］, 正常生理?xiàng)l件下, E-cad表達(dá)于各類正常上皮細(xì)胞[16］, 在維持細(xì)胞的極性和組織結(jié)構(gòu)的完整性中起重要作用[17］。slug是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的一種轉(zhuǎn)錄因子, 同時(shí)也是E-cad的上游轉(zhuǎn)錄因子[18］, 相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn), slug轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況往往與E-cad表達(dá)情況相反。

本實(shí)驗(yàn)使用研究較少的人胃癌HGC-27細(xì)胞系, 豐富了TGF-β通路研究的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ), 旨在通過外源性藥物激活和阻斷TGF-β信號(hào)通路, 觀察胃癌細(xì)胞在體外增殖和侵襲能力的變化以及EMT過程中相關(guān)基因slug與E-cad的蛋白表達(dá)水平的變化。

最新研究結(jié)果顯示, 紡錘體蛋白 1（SPIN1）的表達(dá)情況與密封蛋白1（Claudin-1）成反比[19］, 而 Claudin-1本身是上皮細(xì)胞中slug家族的直接下游靶基因[20］。因此可推測SPIN1蛋白通過作用于slug蛋白而調(diào)節(jié)Claudin-1的表達(dá), Claudin-1蛋白的表達(dá)與EMT具有相當(dāng)緊密的關(guān)系, 而EMT的發(fā)展過程與Ecad和N-cad的蛋白表達(dá)具有直接關(guān)系[21］, 因此可以認(rèn)為, SPIN1蛋白與E-cad和N-cad蛋白在促癌過程中以某種方式相互作用, 具體作用方式目前尚未知曉, 而slug蛋白的表達(dá)在其中具有重要作用[22］。

相關(guān)研究顯示, 30%的胃癌組織均顯示出slug表達(dá)呈陽性[23］, 而在之后的研究中顯示約75%的胃癌病人均存在slug表達(dá)陽性[24］。這兩項(xiàng)研究結(jié)果存在較大差異的原因可能是：后者的研究中包含了更多的晚期胃癌病人。在早期的研究中, 大約60%的病人處于Ⅰ期, 而后者的研究中只有大約30%的病人處于Ⅰ期。提示slug在一定程度上可用于判斷胃癌的發(fā)展情況。slug在EMT誘導(dǎo)中具有公認(rèn)的作用[25］, 因此本實(shí)驗(yàn)研究了slug蛋白表達(dá)情況與E-cad蛋白的表達(dá)關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)：使用TGF-β通路激活劑TGF-β1激活該通路后, slug蛋白表達(dá)上升, 而E-cad蛋白表達(dá)下降, 腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲能力均上升。使用TGFβ通路阻斷劑SB431542阻斷該通路后, slug蛋白表達(dá)下降, 而E-cad蛋白表達(dá)水平上升, 腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力均下降。在激動(dòng)劑+低濃度阻斷劑和激動(dòng)劑+高濃度阻斷劑組兩組中, 隨阻斷劑濃度的提高, 通路的激動(dòng)效果下降, 激動(dòng)劑+高濃度阻斷劑組的slug蛋白表達(dá)水平低于激動(dòng)劑+低濃度阻斷劑組, 而E-cad蛋白表達(dá)水平高于激動(dòng)劑+低濃度阻斷劑組；腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力也低于激動(dòng)劑+低濃度阻斷劑組。從而可見：阻斷與激活TGF-β通路能夠改變slug與E-cad蛋白的表達(dá)情況, 隨slug蛋白與E-cad蛋白表達(dá)情況發(fā)生改變, 腫瘤的增殖與侵襲能力發(fā)生改變, 說明在該通路中slug與E-cad兩種蛋白之間呈負(fù)相關(guān), 且TGF-β通路激活水平與細(xì)胞增殖和侵襲能力成正比。

以往研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1具有能夠促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞系增殖能力的作用[26］, 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages, TAMs）是體內(nèi)TGF-β1的主要來源[27］, 耗竭TAMs后, TGF-β1的數(shù)量下降約7倍, 而腫瘤細(xì)胞的增殖能力顯著下降[28］, 但具體作用機(jī)制仍然不清楚。slug在惡性腫瘤中過度表達(dá), 并能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達(dá), 干擾slug能起到抑制胃癌血管生成的作用[29］。本研究觀察到, 使用TGF-β1激活TGF-β通路后, slug蛋白表達(dá)顯著升高, 并增強(qiáng)了胃癌HGC-27細(xì)胞的增殖能力, 而在阻斷TGF-β通路后細(xì)胞增殖活性明顯下降, slug蛋白表達(dá)下降, 可以推測TGF-β1是通過激活TGF-β通路, 促進(jìn)血管生成從而增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性。

Matrigel在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中充當(dāng)了體內(nèi)ECM的作用, 細(xì)胞穿過小室膜不僅僅反映了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力, 同時(shí)也反映了其分泌MMPS溶解ECM的能力。本研究使用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測人胃癌HGC-27細(xì)胞的侵襲能力時(shí), 激動(dòng)劑組的細(xì)胞相較于其余各組均發(fā)揮出了較強(qiáng)的侵襲能力。同時(shí)測得激動(dòng)劑組細(xì)胞E-cad表達(dá)下降, 推測當(dāng)使用TGF-β1激活通路后, E-cad表達(dá)的下降不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失去極性、降低細(xì)胞連接穩(wěn)定性[30］, 同時(shí)還會(huì)使胃癌細(xì)胞分泌更多的MMPS[31］, 溶解掉ECM, 從而增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的侵襲能力。

在使用CCK-8檢測人胃癌HGC-27細(xì)胞的增殖能力時(shí), 我們發(fā)現(xiàn)所有組別的HGC-27細(xì)胞在起初24 h均表現(xiàn)為快速增殖, 而添加了阻斷劑組的細(xì)胞在接下來的48 h和72 h表現(xiàn)為增殖活性的明顯下降, 可能提示SB431542的起效時(shí)間往往需要24 h以上。預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：當(dāng)TGF-β1濃度高于40 μg/L和低于10 μg/L時(shí), 激動(dòng)劑組HGC-27細(xì)胞的增殖活性不增高反而降低, 這意味著較高和較低濃度的TGFβ1可抑制胃癌細(xì)胞增殖, 提示TGF-β1的作用效果與濃度相關(guān)。在激動(dòng)劑TGF-β1（50 μg/L和10 μg/L）+阻斷劑SB431542（2 mg/L）的非最佳濃度組中, 觀察到TGF-β1和SB431542共同抑制細(xì)胞增殖, 且其抑制程度大于SB431542（2 mg/L）單藥組, 提示TGF-β1在某些濃度下可與SB431542共同作用從而阻斷TGF-β通路并抑制人胃癌HGC-27細(xì)胞的增殖。

綜合本研究和文獻(xiàn)報(bào)道可知, 當(dāng)TGF-β通路被激活后, 活化的TGF-β受體1將Smad2和Smad3磷酸化, 磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4組裝成異二聚體和三聚體復(fù)合物, 然后進(jìn)入細(xì)胞核[32］, 直接與slug的啟動(dòng)子結(jié)合以誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄, 促使slug結(jié)合E-cad基因CDH1的啟動(dòng)子, 抑制E-cad蛋白的編碼而促進(jìn)EMT的進(jìn)展, 導(dǎo)致N-cad的表達(dá)上升、E-cad的表達(dá)下降, TGF-β信號(hào)通路可改變slug和E-cad蛋白的表達(dá)情況, 從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力, 而TGF-β1和SB431542在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮的作用與藥物劑量和二者間相互作用有關(guān)。