楊宇珂 劉良裕 崔秀梅 顧 選 王建農(nóng) 付建華*

三銀芪丹顆粒是由黃芪、丹參、三七、當(dāng)歸、銀杏葉等中藥經(jīng)加工制成的顆粒劑，具有益氣活血的功效，適用于中風(fēng)、恢復(fù)期屬氣虛血瘀證患者的康復(fù)和輔助治療，癥見半身不遂、舌強(qiáng)語蹇、氣乏力短、自汗等。目前，根據(jù)原國家食品藥品監(jiān)督管理局相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜法（TLC）鑒別，對(duì)三銀芪丹顆粒中黃芪、丹參和三七進(jìn)行質(zhì)量控制，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)黃芪中黃芪甲苷含量進(jìn)行控制。但上述質(zhì)量控制方法存在方法較為簡單，專屬性不強(qiáng)的問題，無法全面反映和控制三銀芪丹顆粒的質(zhì)量。故本研究針對(duì)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-5066（B-0066）-2014Z 中的鑒別項(xiàng)目進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)建立鑒別丹參藥材中丹參素鈉的TLC 及測(cè)定丹參素鈉含量的HPLC，為三銀芪丹顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及提升提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 1200、1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；AUW220D 型萬分之一電子分析天平（日本島津公司）；XZ-6DTD 型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠，規(guī)格為10 cm×10 cm、10 cm×20 cm）。

三銀芪丹顆粒（華頤藥業(yè)有限公司，批號(hào)為190101、190102、190103）；丹參素鈉對(duì)照品（批號(hào)為110855-201614），人參皂苷Re 對(duì)照品（批號(hào)為110754-200320），人參皂苷Rg1 對(duì)照品（批號(hào)為110703-200322），人參皂苷Rb1 對(duì)照品（批號(hào)為110704-200318），均購自中國食品藥品檢定研究院；三七皂苷R1 對(duì)照品（批號(hào)為P27J9F64476）購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 丹參的TLC 鑒別取本品0.5 g，加水1 ml，鹽酸2 滴，振搖溶解，加乙酸乙酯3 ml，萃取，分層完全后取上層過濾，即得供試品溶液。另取丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，加入75%甲醇制得1.0 mg/ml 的丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取丹參陰性樣品0.8 g 干膏粉（相當(dāng)于顆粒1 g），加水2 ml 和稀鹽酸3～4 滴振搖使溶解，加入乙酸乙酯6 ml，萃取，分層后取上清液，即為丹參陰性樣品溶液。參考TLC（中華人民共和國藥典2015 版四部0502 通則）試驗(yàn)，在同一硅膠G 板上，分別吸取10 μl 供試品溶液和2 μl 標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行點(diǎn)樣。展開劑選擇三氯甲烷-丙酮-甲酸（25∶10∶4）進(jìn)行展開，展開后取出，并晾干。將薄層板置于氨蒸汽中，氨熏15 min，放置30 min 后，于紫外光（365 nm）下檢視。

1.2.2 三七的TLC 鑒別取本品2 g，研細(xì)，加至具塞錐形瓶中，用50 ml 甲醇進(jìn)行溶解，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml 使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用20 ml 乙醚振搖提取，重復(fù)2 次，再用20 ml 水飽和正丁醇振搖提取，重復(fù)3 次，合并正丁醇提取液，用20 ml 氨試液洗滌，重復(fù)2 次，再用20 ml 正丁醇飽和的水洗滌，重復(fù)2 次，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml 使溶解，即得供試品溶液。另取人參皂苷Rb1 對(duì)照品、人參皂苷Re 對(duì)照品、人參皂苷Rg1 對(duì)照品和三七皂苷R1 對(duì)照品，加入甲醇制得各成分濃度均為0.5 mg/ml 的混合對(duì)照品溶液。按處方工藝制備缺三七藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法得到陰性對(duì)照溶液。參考薄層色譜法（中國藥典2015年版四部0502 通則）試驗(yàn)，在同一硅膠G 薄層板上，分別吸取5 μl 供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液進(jìn)行點(diǎn)樣，展開劑選擇三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液，放置于10 ℃以下進(jìn)行展開，展距15 cm，取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液作為顯色劑，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。

1.2.3 丹參素鈉含量測(cè)定

1.2.3 .1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%醋酸水溶液（3∶97）；流速：1 ml/min；檢測(cè)波長：280 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。理論板數(shù)按丹參素鈉峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

1.2.3 .2 溶液制備精密稱定丹參素鈉對(duì)照品粉末，加50%甲醇制成40 μg/ml 的丹參素鈉溶液，即得對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的本品，混勻，研細(xì)，取約3 g，精密稱定后，置具塞錐形瓶中，精密加入25 ml 的50%甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷后，再次精密稱定，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。取方中去除丹參的各藥味，按處方比例及制備工藝制得陰性樣品，取該陰性樣品，制備方法同供試品溶液一致，制得陰性對(duì)照品溶液。

1.2.3 .3 方法學(xué)考察1）專屬性考察：分別進(jìn)樣測(cè)定丹參素鈉對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液，并記錄色譜圖。2）線性關(guān)系考察：精密吸取已配制好的丹參素鈉對(duì)照品貯備液0.5、1、2、3、4、8 ml 于5 ml 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，按“1.2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣和測(cè)定，以對(duì)照品溶液濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）計(jì)算線性回歸方程。3）精密度試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液（批號(hào)190102），按“1.2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別記錄丹參素鈉色譜峰面積。4）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)（190102）的三銀芪丹顆粒6 份，按“1.2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，新制的6 份供試品溶液，按“1.2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算6 份供試品溶液中丹參素鈉的含量，并計(jì)算平均值及相應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。5）重現(xiàn)性試驗(yàn)：不同實(shí)驗(yàn)室、不同儀器、不同分析人員下，按“1.2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取已配制好的供試品溶液（批號(hào)190102），連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別記錄丹參素鈉的色譜峰面積。6）穩(wěn)定性試驗(yàn)：將已配制好的供試品溶液（批號(hào)為190102），于室溫放置，在制備后0、2、4、6、8、10 和12 h 時(shí)，按“1.2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取5 μl，注入高效液相色譜儀，記錄丹參素鈉的色譜峰面積。7）加樣回收試驗(yàn)：精密稱取同一批已知含量的三銀芪丹顆粒（批號(hào)為190102，丹參素鈉含量1.09 mg/g）1 g，6 份，各組再加入丹參素鈉對(duì)照品溶液（前期配制時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液濃度為0.2 mg/ml）5 ml，依法制得供試品溶液。再按外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定，計(jì)算丹參素鈉的加樣回收率。

1.2.3 .4 含量測(cè)定采用HPLC 測(cè)定公司生產(chǎn)的3 批（190101、190102、190103）三銀芪丹顆粒的丹參素鈉含量。

2 結(jié)果

2.1 丹參的TLC 鑒別

供試品在和對(duì)照品相應(yīng)位置的薄層色譜上，顯示相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無相應(yīng)顏色斑點(diǎn)。見圖1A。

2.2 三七的TLC 鑒別

供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無相應(yīng)顏色斑點(diǎn)。見圖1B。

圖1 薄層色譜

2.3 丹參素鈉含量測(cè)定

2.3.1 方法學(xué)考察1）專屬性考察：供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)丹參素鈉色譜峰，而丹參陰性對(duì)照品溶液色譜圖在丹參素鈉的位置無吸收峰，表明方法專屬性良好。見圖2。

圖2 高效液相色譜

2）線性關(guān)系考察：回歸方程Y= 6.648 2X+5.341 1（R2=0.999 9）。表明在20～200 μg/ml 的濃度范圍內(nèi)丹參素鈉線性關(guān)系良好。3）精密度試驗(yàn)：結(jié)果顯示丹參素鈉RSD 值為2.14%（n=6），表明儀器精密度良好。4）重復(fù)性試驗(yàn)：結(jié)果表明，丹參素鈉平均含量為1.09 mg/g，RSD 值為1.66%（n=6），說明方法重復(fù)性良好。5）重現(xiàn)性試驗(yàn)：計(jì)算RSD 值為3.15%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性良好。6）穩(wěn)定性試驗(yàn)：計(jì)算RSD 值為2.75%（n=6），表明本實(shí)驗(yàn)條件下12 h內(nèi)測(cè)定，樣品穩(wěn)定性良好。7）加樣回收試驗(yàn)：計(jì)算平均回收率為103.28%，RSD 值為1.59%（n=6），表明該方法回收率良好。見表1。

表1 三銀芪丹顆粒加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 含量測(cè)定結(jié)果表明，3 批樣品中丹參素鈉含量均高于1.0 mg/g，樣品檢驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定。見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

中藥制劑由于藥材成分復(fù)雜，有效成分不明確，制備工藝繁瑣且劑型豐富，使其在質(zhì)量控制上受到較多限制[1]。本品原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中選擇原兒茶醛作為丹參的薄層鑒別指標(biāo)成分，然而前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在儲(chǔ)存期間，原兒茶醛含量不穩(wěn)定，采用TLC 難以檢測(cè)到斑點(diǎn)且專屬性較差，且受展開劑組成影響易導(dǎo)致假陰性現(xiàn)象，故考慮選擇丹參中活血化瘀有效成分丹參酮ⅡA、丹酚酸B、丹參素鈉作為薄層檢測(cè)指標(biāo)成分[2-3]。通過前期文獻(xiàn)調(diào)研和條件摸索，同時(shí)參考三銀芪丹顆粒的水提醇沉提取工藝發(fā)現(xiàn)，由于丹參酮ⅡA 為脂溶性成分，丹酚酸B 雖為水溶性成分但熱不穩(wěn)定，故兩者在薄層鑒別中均未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)成分，最終選擇丹參素鈉為對(duì)照品進(jìn)行薄層鑒別和含量測(cè)定[4-6]。此外，在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，銀杏葉的TLC 鑒別參照2015 版《中華人民共和國藥典》[7]中方法，標(biāo)品斑點(diǎn)清晰，但樣品斑點(diǎn)未能與標(biāo)品完全對(duì)應(yīng)，改變?nèi)恿考肮┰嚻分苽浞椒ň鶡o法改善實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，故未列入正文。

在考察丹參TLC 鑒別方法時(shí)，分別對(duì)點(diǎn)樣量、薄層板品牌、展開劑比例、氨氣熏蒸時(shí)間是否影響樣品斑點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示本研究所建立方法具有特征斑點(diǎn)清晰，分離度好，耐用性強(qiáng)，成熟可靠的特點(diǎn)。

丹參素鈉是丹參發(fā)揮活血化瘀、理氣止痛藥效的主要成分之一[8]。在流動(dòng)相選擇時(shí)，文獻(xiàn)多采用乙腈（甲醇）-磷酸（醋酸）-水系統(tǒng)[9-10]。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)對(duì)比考察，最終選出分離效果好、保留時(shí)間適中的甲醇-1%醋酸水溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相。對(duì)提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇）和提取時(shí)間（10、20、30 min）進(jìn)行篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)提取溶劑對(duì)丹參素鈉的測(cè)定無顯著影響，而提取時(shí)間在較短時(shí)刻樣品溶解不充分，故最終選擇提取條件為50%甲醇作為提取溶劑，提取時(shí)間為30 min。同時(shí)還考察不同流動(dòng)相比例（2∶98、3∶97、4∶96）、不同色譜柱（資生堂SPOLAR 柱、資生堂CAPCELL PAK C18色譜柱、資生堂SUPERRIOREX ODS 柱）、不同柱溫（30、35、40 ℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）、不同檢測(cè)波長（275、280、285 nm）對(duì)于丹參素鈉含量測(cè)定的影響，結(jié)果各色譜條件下，柱溫、流速及波長的變化對(duì)測(cè)量結(jié)果無干擾，而流動(dòng)相比例則應(yīng)控制為甲醇-1%醋酸水（3∶97），色譜柱則應(yīng)選擇CAPCELL PAK C18柱，表明該方法耐用性較好。

在吸收波長的選擇上，在波長210～400 nm 范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示丹參素鈉在280 nm 處出峰完全，有最大吸收，故選擇280 nm 作為檢測(cè)波長。

綜上所述，在三銀芪丹顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，對(duì)丹參的TLC 鑒別項(xiàng)進(jìn)行了修訂和完善，并建立了有效成分指標(biāo)丹參素鈉的含量測(cè)定。本研究建立的方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性均較好，且簡單易行，質(zhì)量可控，為完善和提升三銀芪丹顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。