鈍藥野木瓜果實的抗氧化及體外降血糖活性研究*

謝華松，魏愛紅，鄒玉冰，李龍輝，龍昊邦，張聲源，2△

（1.嘉應學院醫(yī)學院，廣東 梅州 514031；2.廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護與精準利用重點實驗室，廣東 梅州 514031）

自由基的化學性質活潑，其引發(fā)的氧化損傷可導致如糖尿病、癌癥、心腦血管疾病、動脈粥樣硬化等許多疾病發(fā)生［1-2］。研究表明，天然植物中含有豐富的抗氧化活性物質（黃酮類、多糖、有機酸以及酚類等）［3］，且其中的黃酮類、酚類等成分均具有良好的降血糖作用［4］，部分天然產(chǎn)物中含有降血糖活性的有效成分［5-6］。鈍藥野木瓜Stauntonia leucanthaDiels ex Y.C.Wu 屬木通科野木瓜屬植物，俗稱繞繞藤、五葉木通、八月瓜，主要分布于貴州、四川、安徽、江浙和兩廣等地，其入藥部位主要為藤莖、葉，味甘性溫，具有除濕消痹、活血散瘀、祛風止痛、利水通經(jīng)等功效［7-9］。近年來，野木瓜屬植物被發(fā)現(xiàn)含有三萜苷元、苷類、木脂素類、黃酮類、酚類、脂肪酸類、甾醇類等成分，具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤、抗病毒、促進神經(jīng)細胞生長、抗氧化、放射增敏和驅蟲等作用。民間習慣食用鈍藥野木瓜果實，但國內(nèi)外對此研究報道較少。為進一步深入挖掘鈍藥野木瓜果實的食用和藥用價值，本研究中擬對廣東省梅州山區(qū)該果實的果皮、果肉、種子的抗氧化及降血糖作用進行探討，為其在食藥領域的綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：UV - 1800 型紫外- 可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；Q-Gard A2型超純水儀（德國Millipore公司）；BT125D 型電子分析天平、BS110s 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；GL-25M 型高速離心機（上海趙迪生物科技有限公司）；JP - 100S 型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設備有限公司）；WJX-A1000型高速多功能粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司）；pHSJ - 3F 型pH 計（上海精科儀器有限公司）；DHP -9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；Spark型Tecan酶標儀（上海帝肯貿(mào)易有限公司）。

試藥：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批號為D141336）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，批號為P112193）、無水檸檬酸（批號為H1827027）、鐵氰化鉀（批號為I1814108）、對氨基苯磺酸（批號為E1929192）、4 - 硝基苯基-β-D- 吡喃葡萄糖苷（pNPG，批號為D1717029）、沒食子酸（批號為K1805015）、蘆丁（批號為L2010248），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二氫鈉（批號為20190301）、可溶性淀粉（批號為20180501），均購自天津市大茂化學試劑廠；十二水磷酸氫二鈉（西隴科學股份有限公司，批號為2110141）；3，5 - 二硝基水楊酸（DNS，國藥集團化學試劑有限公司，批號為20170904）；α- 淀粉酶（批號為SLCF5282）、α - 葡萄糖苷酶（批號為SLCG0041），均購自美國Sigma 公司；牛血清蛋白（上海百研生物科技有限公司，批號為WXBC2003V）；維生素C（VitC，批 號 為C10701117）、福 林 酚（批 號 為C10496226）、硝酸鋁（批號為C10373927），均購自上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為分析純。鈍藥野木瓜果實于2020 年10 月采自廣東省梅州市平遠縣，經(jīng)嘉應學院醫(yī)學院張聲源副教授鑒定為正品。

1.2 方法

1.2.1 醇提物制備

取樣品果實，將其果皮、果肉、種子曬干，粉碎，按料液比1∶2（g/mL）分別加入95%乙醇浸泡12 h，40 ℃超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取40 min，濾過，重復3次，合并濾液后減壓濃縮，得到種子、果肉、果皮乙醇提取物分別為65.11，16.40，23.60 g，于5 ℃貯存，備用。

1.2.2 總酚、總黃酮含量測定

以沒食子酸為對照品，采用福林酚法測定總酚含量［10-11］。以沒食子酸當量（每1 g 樣品中酚類化合物的沒食子酸當量mg GA/g）為橫坐標、吸光度為縱坐標進行線性回歸。以蘆丁為對照品，采用硝酸鋁法測定總黃酮含量［12-13］。以蘆丁當量（每1 g 樣品中黃酮類化合物的蘆丁當量mg RT/g）為橫坐標、吸光度為縱坐標進行線性回歸。

1.2.3 抗氧化活性測定

DPPH 法：取3 種醇提物各適量，分別制成醇提液。各取1.0 mL及VitC溶液（陽性對照，下同）1 mL，分別加入1.0 mL 0.1 mmol/ L DPPH 無水乙醇溶液，置于暗處，室溫下反應20 min，分別計算醇提液和VitC 溶液對DPPH自由基的清除率［14-15］。

ABTS 法：精密移取不同質量濃度的醇提液及VitC溶液各100μL，ABTS+溶液3.9 mL，置同一試管中，室溫放置10 min，以100 μL 無水乙醇和3.9 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）的混合溶液調(diào)零，分別計算醇提液及VitC 溶液對ABTS+的清除率［16-17］。

鐵還原能力法：分別精密移取2.5 mL 的PBS 和K3Fe（CN）6溶液于10 mL 試管中，搖勻，50 ℃恒溫水浴反應20 min，急速冷卻，加入2.5 mL 三氯乙酸溶液，搖勻，6 000 r/ min 離心10 min，取上清液2.5 mL 于試管中，依次加入2.0 mL 蒸餾水與0.5 mL FeCl3溶液混勻，于700 nm 波長處測定吸光度（Ai）。以與待測溶液等量的無水乙醇為對照，以與K3Fe（CN）6溶液、三氯乙酸溶液和FeCl3溶液等量的蒸餾水為空白，同法測定對照的吸光度（A0）和空白的吸光度（Aj）。以VitC 的質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標進行線性回歸，以3 種醇提液的吸光度與VitC相比，計算鐵還原能力［18-19］。

1.2.4 降血糖活性測定

α-葡萄糖苷酶活性：取0.067 mol/L PBS 110μL、醇提液10μL、α-葡萄糖苷酶溶液（1 U/mL）20μL，混勻，37 ℃孵育15 min，加入4.0 mmol/L pNPG 20μL，混勻，37 ℃反應15 min，加入0.2 mol/L無水碳酸鈉80μL終止反應，混勻，測定吸光度，并分別計算醇提液及阿卡波糖溶液（陽性對照，下同）對酶活性的抑制率［20-21］。

α-淀粉酶活性：制備系列質量濃度的3 種醇提液和阿卡波糖溶液，分別加入120μLα-淀粉酶溶液，混合，37 ℃孵育5 min，取出，加入1%淀粉底物緩沖液120 μL，混勻，37 ℃反應15 min，取出后加DNS 溶液200μL，置沸水浴5 min，取出，冷卻至室溫，加入1 040μL PBS；測定吸光度，并分別計算醇提液和阿卡波糖溶液對酶活性的抑制率［21-22］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5 軟件分析，結果以X±s表示；采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行單因素差異顯著性分析和Pearson相關性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 總酚、總黃酮含量

沒食子酸回歸方程為Y1= 95.577X1+ 0.032 1（r=0.996 5）、蘆丁回歸方程為Y2=12.823X2-0.003 2（r=0.999 4）。結果表明，沒食子酸、蘆丁分別在2.00～10.00 μg/ mL、8.00～72.00 μg/ mL 質量濃度范圍內(nèi)與相應吸光度線性關系良好。結果果肉的總酚含量（6.40 mg GA/ g）最高，其次為果皮（4.40 mg GA/ g），最低為種子（0.04 mg GA/g）。果皮的總黃酮含量最高（6.84 mg RT/g），其次為果肉（2.14 mg RT/g），最低為種子（0.28 mg RT/g）。

2.2 體外抗氧化活性

DPPH 自由基清除能力：DPPH 自由基的清除能力見圖1。3 種醇提液對DPPH 自由基均有一定清除能力，且種子在0.62～20.00 mg/ mL，果皮和果肉在0.16～20.00 mg/ mL 范圍內(nèi)，清除能力隨質量濃度的增加而增強。對DPPH 自由基清除能力，VitC［半數(shù)抑制濃度（IC50）=（0.007 ± 0.000 01）mg/ mL］＞果皮［IC50=（0.586 ± 0.016）mg/ mL］＞果 肉［IC50=（1.177 ±0.029）mg/mL］＞種子［IC50=（4.603±0.281）mg/mL］；且兩兩之間差異顯著（P＜0.05）。

圖1 DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ability

ABTS 自由基清除能力：ABTS 自由基清除能力見圖2。3 種醇提液對ABTS 自由基均有一定清除能力，且種子在2.34～75.00 mg/ mL，果皮和果肉在0.59～75.00 mg/mL 范圍內(nèi)清除能力隨質量濃度的增加而增強。ABTS 自由基清除能力大小為，VitC［IC50=（0.023±0.000 47）mg/mL］＞果皮［IC50=（2.850±0.08）mg/mL］＞果肉［IC50=（3.403 ± 0.11）mg/ mL］＞種子［IC50=（15.984 ± 0.19）mg/ mL］；且 兩 兩 之 間 差 異 顯 著（P＜0.05）。

圖2 ABTS+清除能力Fig.2 ABTS+ radical scavenging ability

鐵還原能力：VitC 回歸方程為Y= 14.109X+0.488 3（R2= 0.993 2），同法得3 種醇提液的回歸方程。結果見圖3。果肉的鐵還原能力為（164.530 ±3.78）μmol VitC/g，顯著強于果皮的（147.330±1.51）μmol VitC/g和種子的（75.010±3.73）μmol VitC/g（P ＜0.05）；且單因素方差分析和Duncan法分析顯示，果皮、果肉及種子與VitC的鐵還原能力存在顯著差異（P ＜0.05）。

圖3 鐵還原能力Fig.3 Iron reduction ability

總酚、總黃酮含量與抗氧化能力的相關性分析：結果見表1。果肉、種子中的總酚、總黃酮含量與清除ABTS+、DPPH 自由基能力及鐵還原能力均呈極顯著正相關（P ＜0.01）；果皮的總酚、總黃酮含量與清除ABTS+能力呈極顯著正相關（P ＜0.01）。

表1 抗氧化活性與總酚、總黃酮含量的相關性考察Tab.1 Correlation between the antioxidant activity and the content of total phenols and flavonoids

2.3 降血糖活性

抑制α-葡萄糖苷酶活性：3 種醇提液及阿卡波糖溶液對α- 葡萄糖苷酶活性的抑制率見圖4。3 種醇提液對α- 葡萄糖苷酶活性均具一定抑制作用，且在3.12～200.00 mg/mL范圍內(nèi)時抑制率均隨質量濃度的增加而升高。當果肉質量濃度大于50 mg/mL 時，對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用趨于飽和。對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用大小為，阿卡波糖［IC50=（3.08±0.27）mg/mL］＞果肉［IC50=（15.85±0.70）mg/mL］＞果皮［IC50=（30.16 ± 1.30）mg/ mL］＞種子［IC50=（119.89 ± 0.98）mg/ mL］；且 兩 兩 之 間 差 異 顯 著（P＜0.05）。

圖4 α-葡萄糖苷酶活性抑制率Fig.4 Inhibitory rate of α-glucosidase activity

抑制α- 淀粉酶活性：3 種醇提液及阿卡波糖溶液對α-淀粉酶活性的抑制率見圖5。3 種醇提液對α-淀粉酶活性均具一定抑制作用，且種子、果皮在6.25～200.00 mg / mL，果肉在15.00～45.00 mg / mL 范圍內(nèi)抑制率隨質量濃度的增加而升高。當質量濃度小于30 mg/mL 時，果肉對α-淀粉酶活性的抑制作用小于阿卡波糖，當超過30 mg/ mL 時前者抑制作用大于后者。對α- 淀粉酶活性抑制作用的大小為，阿卡波糖［IC50=（0.34±0.016）mg/mL］＞果肉［IC50=（20.35±0.021）mg/mL］＞果皮［IC50=（37.11±1.12）mg/mL］；且兩兩之間差異顯著（P＜0.05）。種子未測出。

圖5 α-淀粉酶活性抑制率Fig.5 Inhibitory rate of α-amylase activity

3 討論

3.1 抗氧化活性

崔霖蕓［12］對野木瓜的抗氧化研究發(fā)現(xiàn)，醇提物中總黃酮含量及抗氧化活性均強于水提物，黃酮是野木瓜抗氧化活性的物質基礎。由此可知，醇溶劑能有效提取野木瓜的抗氧化有效成分。本研究結果表明，果皮、果肉及種子對DPPH 自由基及ABTS+清除能力的強弱順序一致，均為果皮＞果肉＞種子，而鐵還原力法的強弱順序卻為果肉＞果皮＞種子，其原因可能為，3 種評價方法的作用機制不同［23］，DPPH 法和ABTS 法是基于自由基機制，鐵還原力法基于鐵離子的價態(tài)改變反映抗氧化能力；種子、果皮及果肉中的抗氧化有效成分和含量不同，如本研究中發(fā)現(xiàn)3 個部位的總酚、總黃酮含量及其與不同抗氧化方法的相關性不一致。結果顯示，總黃酮與總酚是鈍藥野木瓜發(fā)揮抗氧化活性的物質基礎，該結果豐富了鈍藥野木瓜食用藥用的科學內(nèi)涵。

3.2 降血糖活性

陳瑛等［24］研究發(fā)現(xiàn)，野木瓜具有良好的降血糖作用。本研究結果表明，果皮、果肉對α- 葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性均有明顯的抑制作用，其中果肉的抑制能力最強，表明果肉中富含降血糖活性成分，后續(xù)可對其活性成分進行富集和分離純化，以評估其單體化合物的降血糖能力。

鈍藥野木瓜果實中的果皮、果肉具有良好的抗氧化及降血糖作用，后續(xù)可研究測定果皮、果肉不同溶劑提取物的總酚、總黃酮含量并進一步對提取物中的總酚、總黃酮分離純化，明確活性物質基礎；也可對果肉中的降血糖活性成分進行富集和分離純化，評估其單體化合物的降血糖能力，以分析構效關系，闡明其藥用科學內(nèi)涵。

綜上所述，鈍藥野木瓜果實具有開發(fā)成降血糖、抗腫瘤等功效保健食品或藥品的潛力，本研究結果可為其在食藥領域的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。