尹楊萍 關(guān)文靈 宋 杰 李葉芳 杜 娟

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，云南 昆明 650201）

比利時(shí)杜鵑（Rhododendron hybridum）又名西洋杜鵑，屬于杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）常綠灌木。因其株型矮壯、花大且花期長(zhǎng)，受到了銷售市場(chǎng)的喜愛(ài)。但比利時(shí)杜鵑存在嚴(yán)重的退化現(xiàn)象，其適應(yīng)性及抗病抗蟲能力較差[1]，在栽培后期易出現(xiàn)觀賞性不佳的情況。常綠灌木野生杜鵑爆杖花（Rhododendron spinuliferum）為杜鵑花屬，糙葉杜鵑亞屬（Subgen.Pseudorhodorastrum）植物，花色朱紅或橙紅，花形筒狀，觀賞性佳，具有作為雜交親本的潛能。

我國(guó)杜鵑花種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)已較為成熟，但育種進(jìn)程緩慢，對(duì)野生杜鵑資源的開發(fā)和利用還不足，在種質(zhì)創(chuàng)新研究中應(yīng)加大對(duì)我國(guó)豐富野生杜鵑資源的利用[2]。當(dāng)前育種途徑還是以傳統(tǒng)雜交育種為主，通常采用遠(yuǎn)緣雜交育種方法打破生殖隔離來(lái)培育觀賞性強(qiáng)、抗性高的新品種杜鵑。通過(guò)雜交親和性來(lái)判斷遠(yuǎn)緣雜交是否成功，一般包括以下幾個(gè)指標(biāo)：子房膨大情況、坐果率、單果種子數(shù)、授粉后花粉在柱頭的萌發(fā)情況、花粉管伸長(zhǎng)及受精情況[3]。在前人研究中常綠杜鵑組亞組間雜交可達(dá)到高育性[4]，然而總體上杜鵑花種間雜交還是存在嚴(yán)重的受精前障礙，野生杜鵑存在雜交子房膨大率低的情況，不同亞屬間的杜鵑雜交后還存在嚴(yán)重受精前障礙[5]。雜交受精前障礙存在的現(xiàn)象一般包括：柱頭上花粉大量萌發(fā)，但會(huì)分泌出胼胝質(zhì)來(lái)阻止花粉管伸入花柱，即使進(jìn)入花柱后，花粉管也可能發(fā)生扭曲變形、頂端膨大和停止生長(zhǎng)等現(xiàn)象，或者是花粉管過(guò)度生長(zhǎng)等[6-7]。在目前的報(bào)道中有多種克服遠(yuǎn)緣雜交受精前障礙的有效方法，其中一種是利用不同授粉方式進(jìn)行雜交授粉，能夠打破雜交障礙，成功獲得雜種后代。國(guó)內(nèi)外育種研究者發(fā)明了多種能夠有效克服遠(yuǎn)緣雜交受精前障礙的授粉方式，如延遲授粉[8]、重復(fù)授粉[9]、切割柱頭授粉[10]等，Lee 等[11]的研究表明，正己烷處理和蒙導(dǎo)授粉是克服杜鵑花受精前障礙有效辦法。本研究對(duì)不同亞屬間的比利時(shí)杜鵑‘西瑪’和野生杜鵑爆杖花的雜交親和性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并探討不同授粉方式對(duì)克服杜鵑雜交障礙的效應(yīng)，研究成果有助于比利時(shí)杜鵑的遺傳改良，以培育出適應(yīng)性更強(qiáng)，觀賞性更優(yōu)的新品種杜鵑。

1 材料與方法

1.1 材料

母本為園藝品種比利時(shí)杜鵑‘西瑪’，栽植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院苗圃，植株生長(zhǎng)健康，可正常開花。父本野生杜鵑爆杖花花粉采自云南省昆明市大哨村。

1.2 雜交前準(zhǔn)備

在‘西瑪’和爆杖花盛花期時(shí)分別進(jìn)行花柱長(zhǎng)度的測(cè)量，得出父/母本花柱長(zhǎng)度比為1.02，根據(jù)父/母本花柱長(zhǎng)度比越接近1.0 則雜交越容易成功的理論判定此親本組合可進(jìn)行雜交[12]。父本爆杖花朵采集后用針將花粉挑出，取部分新鮮花粉以MTT 染色法進(jìn)行活力測(cè)定，得出花粉活力為71.44%，判定其可用于雜交授粉，剩余花粉放入硅膠干燥鍋里干燥48 h，后密封貯藏于-20 ℃冰箱里，待母本花期時(shí)進(jìn)行雜交授粉。

1.3 授粉方式

2020 年1—4 月為比利時(shí)杜鵑‘西瑪’的盛花期，在此期間選取即將開放且已分泌粘液的花苞，去除雄蕊和花冠后即可用不同方式授粉，每日授粉時(shí)間為早上08: 00—11: 00，每種授粉方式下授粉50 朵。授粉后觀察并統(tǒng)計(jì)子房膨大數(shù)。待果實(shí)由綠轉(zhuǎn)黃后將果實(shí)采收并統(tǒng)計(jì)坐果數(shù)，剝出種子統(tǒng)計(jì)單果種子數(shù)。

授粉方式有：1）常規(guī)授粉：在柱頭上直接涂抹花粉；2）切割柱頭授粉：切去子房上部的柱頭和花柱，在傷口處涂抹花粉培養(yǎng)液（蔗糖50 g/L +H3BO3100 mg/L + Ca(NO3)2·4H2O 300 mg /L）；3）加熱花粉法：將花粉40 ℃恒溫處理1 h 后，再用于授粉；4）延遲授粉法：在去雄后套袋至第4 天進(jìn)行授粉；5）重復(fù)授粉：以常規(guī)授粉方式連續(xù)授粉3 d；6）NAA 涂抹法：用0.1% NAA（萘乙酸）溶液涂抹柱頭后授粉。

1.4 花粉管的熒光觀察

取雜交授粉后8 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d 的花柱及子房觀察，每個(gè)時(shí)段每種授粉方式采集至少3 朵花的雌蕊。雌蕊采取后盡快放入FAA 固定液中固定24 h，保存?zhèn)溆谩ｋS后以70%乙醇—50%乙醇—30%乙醇—蒸餾水逐級(jí)漂洗3 次。壓片前，于60 ℃恒溫水浴中浸入8 mol/L NaOH 溶液中處理4 h，蒸餾水沖洗直至不再變色后用苯胺藍(lán)溶液染色24 h 后，雌蕊縱切展開滴加1～2 滴甘油壓片，在熒光顯微鏡下觀察，每張片子選取3 個(gè)視野拍照記錄。

1.5 雜交種子無(wú)菌萌發(fā)

將收獲的雜交種子在0.1%的GA3中浸泡24 h進(jìn)行預(yù)處理，在超凈工作臺(tái)中以2.0%的NaClO滅菌20 min 后接種于1/4 WPM 培養(yǎng)基，放置于組織培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)觀察，30 d 后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)數(shù)及綠苗數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)與指標(biāo)體系等級(jí)劃分

各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算方法為：

（1）子房膨大率（Or）=子房膨大數(shù)/授粉花朵數(shù) × 100% ；（2）坐果率（St）=蒴果數(shù)/授粉花朵數(shù) × 100%；（3）雜交種子萌發(fā)率（Gr）=萌發(fā)種子數(shù)/接種種子數(shù) × 100%；（4）雜交種子綠苗率（Gs）=綠苗數(shù)/發(fā)芽數(shù) × 100%；（5）綠苗系數(shù)（Gc）=綠苗率/萌發(fā)率；（6）單位可育種子數(shù)（Sf）=蒴果平均種子數(shù)（Cs） × 綠苗率。

各指標(biāo)等級(jí)劃分方法參照文獻(xiàn)[13]。1）作為雜交合適度指標(biāo)，坐果率劃分等級(jí)：不能坐果為0、0＜低＜20、20≤中＜40、高≥40；2）作為種子生活力指標(biāo)，綠苗率劃分等級(jí)：無(wú)綠苗為0、0＜低＜10、10≤中＜50、高≥50；3）綠苗系數(shù)為閾值0 ～1 的相對(duì)化指標(biāo)，劃分等級(jí)：無(wú)綠苗為0、0＜低＜0.6、0.6≤中＜0.9、高≥0.9；4）作為具有正常生活力種子絕對(duì)指標(biāo)，單位可育種子數(shù)劃分等級(jí)：無(wú)能育種子為0、0＜低＜20、20≤中＜200、高≥200。

將上述指標(biāo)根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)賦予權(quán)重并劃分等級(jí)分值，累計(jì)得出綜合評(píng)分，對(duì)雜交可育性進(jìn)行評(píng)價(jià)。設(shè)總權(quán)重（最高分值）為10 分，綠苗率最高5 分，綠苗系數(shù)最高2 分，坐果率與單位可育種子數(shù)分別最高1.5 分，方案見(jiàn)表1。根據(jù)綜合評(píng)分將可育性劃分為4 個(gè)等級(jí)，即0≤無(wú)＜2.5 為不育型；2.5≤低＜5 為弱育型；5≤中＜8 為能育型；高≥8 為高育型。

表1 雜交可育性指標(biāo)等級(jí)與權(quán)重分配Table 1 Fertility index grades and weight allocations

2 結(jié)果與分析

2.1 不同授粉方式下花粉管的熒光觀察

‘西瑪’ × 爆杖花雜交組合花粉管生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖1。雜交授粉8 h 后，切割柱頭法未見(jiàn)花粉萌發(fā)，常規(guī)授粉法、NAA 涂抹柱頭法、重復(fù)授粉法、加熱花粉法、延遲授粉法授粉在雌蕊柱頭上均觀察到花粉的大量萌發(fā)。常規(guī)授粉2 d 后發(fā)現(xiàn)花粉管扭曲，4 d 后花粉管生長(zhǎng)近花柱中部，同時(shí)發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)反應(yīng)，12 d 后僅有少量花粉管到達(dá)子房；NAA 涂抹柱頭法授粉4 d 后產(chǎn)生胼胝質(zhì)反應(yīng)，6 d 后發(fā)現(xiàn)花粉管扭曲纏繞，12 d 后大量花粉管生長(zhǎng)到達(dá)子房；加熱花粉法花粉管生長(zhǎng)迅速，1 d 后到達(dá)花柱1/4 處，4 d 后花粉管出現(xiàn)扭曲，8 d 后接近子房，10 d 后生長(zhǎng)進(jìn)入子房；延遲授粉法2 d 后出現(xiàn)花粉管折疊扭曲，6 d 后發(fā)現(xiàn)激烈胼胝質(zhì)反應(yīng)，12 d 后生長(zhǎng)到達(dá)子房；重復(fù)授粉法2 d后出現(xiàn)花粉管扭曲，6 d 后少量花粉管生長(zhǎng)到達(dá)子房。

圖1 不同授粉方式雜交后的花粉管熒光觀察Fig. 1 Fluorescence observation of pollen tube after hybridization with different pollination methods

2.2 授粉方式對(duì)子房膨大率和坐果率的影響

雜交組合‘西瑪’ × 爆杖花以不同授粉方式雜交后的子房膨大率及坐果率結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在常規(guī)授粉雜交方式中，‘西瑪’ × 爆杖花雜交子房膨大率及坐果率均為0.00%，但是NAA 涂抹柱頭法、重復(fù)授粉法、加熱花粉法、延遲授粉法4 種方式均能有效提高雜交子房膨大率及坐果率，說(shuō)明這些方法能夠有效提高‘西瑪’ ×爆杖花的雜交成功率。其中，重復(fù)授粉的子房膨大率最高，達(dá)到了58.00%，但坐果率只有50.00%，而切割柱頭法未見(jiàn)子房膨大，說(shuō)明此法不適用于本雜交組合。

表2 不同授粉方式對(duì)雜交親和性的影響Table 2 Effects of different pollination methods on cross affinity

2.3 雜交親和性指標(biāo)及綜合評(píng)價(jià)

雜交組合‘西瑪’ × 爆杖花的雜交親和性指標(biāo)包含蒴果平均種子數(shù)、萌發(fā)率、綠苗率、綠苗系數(shù)和單位可育種子數(shù)。經(jīng)測(cè)算得出雜交蒴果平均種子數(shù)為252.33，雜交種子的萌發(fā)率為15.00%，根據(jù)育性指標(biāo)等級(jí)與權(quán)重分配結(jié)果（表1）可知：雜交種子的綠苗率5.00%為低等，得分1.0；綠苗系數(shù)0.33 為低等，得分0.5；單位可育種子數(shù)12.62 為低等，得分0.5；根據(jù)表2 可得常規(guī)授粉下坐果率為0.00%，得分0 分。由以上各單項(xiàng)雜交親和指標(biāo)進(jìn)行加合，得出最終雜交可育性綜合評(píng)分為2.0，綜合評(píng)價(jià)‘西瑪’ × 爆杖花雜交組合可育性為不育型。

3 結(jié)論與討論

杜鵑的柱頭可授期一般會(huì)持續(xù)一段時(shí)間，在性成熟時(shí)會(huì)分泌粘液。有學(xué)者的研究表明杜鵑的柱頭開始分泌粘液時(shí)可授性開始變強(qiáng)[14-15]，經(jīng)過(guò)測(cè)試比利時(shí)杜鵑‘西瑪’也有相同的結(jié)果，即粘液分泌時(shí)柱頭有較強(qiáng)的可授性，因此試驗(yàn)在確定授粉時(shí)機(jī)時(shí)以開始分泌粘液為認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。杜鵑雜交同時(shí)存在受精前障礙和受精后障礙[16]。受精前障礙是花粉不能在柱頭上萌發(fā)直到子代敗育的階段[13]，障礙表現(xiàn)在花粉管異常膨大、變形甚至是停止生長(zhǎng)以至于不能生長(zhǎng)到達(dá)胚珠[17]，具體表現(xiàn)在授粉后子房不會(huì)膨大或無(wú)坐果，本試驗(yàn)中花粉管熒光觀察發(fā)現(xiàn)‘西瑪’ × 爆杖花雜交組合出現(xiàn)了包括花粉管扭曲折疊，產(chǎn)生胼胝質(zhì)反應(yīng)或是不能生長(zhǎng)到達(dá)子房等花粉管異常的情況，推測(cè)存在受精前障礙。通過(guò)不同的授粉方法可以破除雜交障礙提高雜交的成功率，而不同的授粉方式對(duì)不同的雜交組合效果不一致，有可能表現(xiàn)為促進(jìn)坐果率的提升，也有可能表現(xiàn)出坐果率降低的情況，耿興敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)以正己烷處理不同的雜交組合，只提高了映山紅 × 猴頭杜鵑（Rhododendron simsii×R. simiarum）和映山紅 × 馬纓杜鵑（R. simsii×R. delavayi）的膨大率，其余雜交組織均表現(xiàn)為膨大率降低。本研究中采用的NAA 涂抹柱頭法、重復(fù)授粉法、花粉加熱法、延遲授粉法授粉結(jié)果對(duì)‘西瑪’ × 爆杖花的子房膨大率和坐果率均顯示為促進(jìn)作用。此外，切割柱頭法授粉后母本植株上未見(jiàn)坐果，顯示雜交失敗，通過(guò)授粉后花粉管熒光觀察的結(jié)果發(fā)現(xiàn)花粉在柱頭切割處并未見(jiàn)萌發(fā)，推測(cè)可能是切割柱頭后涂抹的花粉培養(yǎng)液配方不適用，或是由于切口過(guò)小，導(dǎo)致培養(yǎng)液揮發(fā)失效。因此，切割柱頭法并不適用于所有植物[19]，而切割柱頭法也與花柱的粗細(xì)，長(zhǎng)短以及切割位置等有關(guān)[20-21]。受精后障礙表現(xiàn)在胚珠停止發(fā)育，種子不能發(fā)芽和后代苗白化等情況[22-24]。本試驗(yàn)中存在坐果率低于子房膨大率的情況，說(shuō)明存在胚珠敗育的情況，同時(shí)還存在雜交種子萌發(fā)率偏低，有白化苗的情況，表明比利時(shí)杜鵑‘西瑪’與爆杖花雜交還存在受精后障礙。針對(duì)受精后障礙，可通過(guò)對(duì)雜交幼胚進(jìn)行拯救等方法來(lái)破除，耿興敏等[25]對(duì)杜鵑雜交幼胚進(jìn)行胚拯救，發(fā)現(xiàn)不同的雜交組合適宜拯救的胚齡也不同，后期研究可繼續(xù)探索杜鵑雜交的受精后障礙破除辦法，為提高杜鵑雜交成功率并獲得更多雜交后代提供參考信息。

雜交親和性的直接指標(biāo)是受精過(guò)程的完成與否，即胚的形成與否，但是胚的檢測(cè)存在一定難度，因此有必要取用間接指標(biāo)來(lái)評(píng)判雜交的親和性。單果種子數(shù)與受精率有關(guān)[26]，受精率越高 則種子數(shù)越高，雜交種子中具有潛在生活力的種子會(huì)萌發(fā)成綠苗，不具有生活力的種子則不會(huì)萌發(fā)或者小苗呈現(xiàn)黃化、白化或畸形以至于最終無(wú)法成活[27]，所以綠苗率也是評(píng)判雜交親和性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)選取了子房膨大率、坐果率、蒴果平均種子數(shù)及種子萌發(fā)率、綠苗率幾項(xiàng)直接指標(biāo)以及經(jīng)公式推算得出的綠苗系數(shù)及單位可育種子數(shù)作為判斷親和性的指標(biāo)，并劃分等級(jí)對(duì)其中幾項(xiàng)與雜交親和性相關(guān)度較大的指標(biāo)進(jìn)行分?jǐn)?shù)評(píng)定，最終得出雜交可育性綜合評(píng)分，這種評(píng)價(jià)方法比單純根據(jù)子房膨大率、坐果率等指標(biāo)判斷親和性更加科學(xué)。本研究根據(jù)雜交可育性綜合評(píng)分判定比利時(shí)杜鵑‘西瑪’ × 爆杖花雜交組合可育性為不育型。