余碧霞，哈滿林，李 萍，金季也

（安慶職業(yè)技術學院農(nóng)林與服裝學院，安慶 246003）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）屬麥角菌科蟲草屬，又名北冬蟲夏草，是蟲草屬的模式種，2019年入選《中華人民共和國農(nóng)業(yè)植物品種保護名錄》（第十一批），含有蟲草素、蟲草多糖等多種活性成分，在抗腫瘤、增強免疫力等方面具有很好的藥理作用[1-5]。蛹蟲草現(xiàn)已列為易危菌類，可通過人工栽培解決野生資源嚴重不足的情況。但在蛹蟲草栽培時，易發(fā)生菌株退化現(xiàn)象。從野外采集的菌株經(jīng)3～5代傳代，菌種保藏時不適宜的溫度、光照、氧氣環(huán)境條件，培養(yǎng)基中不適宜的營養(yǎng)元素，菌株交配型的改變與基因變異等均會導致菌種退化，表現(xiàn)為菌絲生長速度慢、菌絲活力低、子實體產(chǎn)量下降、畸形或不產(chǎn)生子實體、有效活性成分降低等[6-7]。菌株退化具有可遺傳性，給生產(chǎn)帶來極大風險。研究蛹蟲草菌株退化的表型特征與退化機制，為生產(chǎn)甄別退化菌株與菌株復壯提供理論依據(jù)[8]。

1 菌株退化的表型特征

1.1 形態(tài)特征

蛹蟲草屬絲狀真菌，經(jīng)多次繼代培養(yǎng)發(fā)生菌株退化。固體培養(yǎng)時，菌落出現(xiàn)扇形、半月形和放射形局變現(xiàn)象，氣生菌絲旺盛，菌絲顏色變淺，產(chǎn)孢數(shù)量減少，菌株生長的節(jié)律環(huán)不明顯[9]；液體培養(yǎng)時，菌株培養(yǎng)液渾濁，菌絲球之間黏連，單個菌絲球不明顯，呈粥糊狀[10]。有的發(fā)生菌絲自溶現(xiàn)象，分生孢子聚集在一起呈頭狀，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲分枝多，呈纖細彎曲的不規(guī)則狀，皺縮菌絲數(shù)量增加，退化程度加重[11]。子實體形成階段，見光轉(zhuǎn)色慢或不轉(zhuǎn)色，產(chǎn)量下降，形態(tài)纖細，沒有子囊殼，或只形成類似子實體原基的菌絲體[12-13]。

1.2 生理生化特征

蛹蟲草退化菌株生長速率早期逐漸降低，第18天左右開始加快，細胞內(nèi)小液泡增多增大，細胞壁皺縮變形、縊裂，細胞核數(shù)量減少，線粒體分布密集、體積變小，膜邊體減少，圓球體溶解，形成脂滴和嗜鋨顆粒[14-15]。退化菌株體內(nèi)類胡蘿卜素、纖維素酶、淀粉酶、胞外多糖、蟲草多糖、腺苷、脂質(zhì)、蟲草素含量降低，麥角甾醇含量與轉(zhuǎn)代次數(shù)呈負相關，急驟下降，體內(nèi)過氧化氫酶（CAT）、單脫氫抗壞血酸酶（MDHAR）、氧化酶（GR）活性降低，而胞內(nèi)多糖、生長點活性氧含量升高。構巢曲霉的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）基因在菌株體內(nèi)過量表達，使菌株具有更高的GPX活性，可增強清除細胞內(nèi)活性氧的能力[16-18]。退化菌株細胞自噬基因Atg22、Atg22-2、Atg13、Atg18表達量上升，分別為336.06%、61.01%、432.19%、170.45%，培養(yǎng)液中添加合成染料BTB，顏色變成綠色或藍色，pH升高至6.9～7.9，總糖含量隨傳代次數(shù)增加而下降，總蛋白含量呈先下降再升高的趨勢[19]。退化菌株體內(nèi)各成分含量的變化可作為早期檢測的標志。

2 菌株退化機制

栽培中，發(fā)生菌株退化是多種因素共同作用導致，使菌株表型改變、代謝產(chǎn)物下降。研究發(fā)現(xiàn)引起蛹蟲草退化的原因主要為環(huán)境因素和菌株遺傳因素兩方面[20-21]。

2.1 環(huán)境因素

蛹蟲草菌株在全黑暗條件，不適宜的保藏溫度、保藏時間均可引起菌株退化。4 ℃低溫菌種可保藏1～2個月，10～20 ℃菌種只能保藏1個月。蛹蟲草菌種長期保藏時，超低溫、缺氧等方式可降低菌絲細胞代謝速率，有效降低菌種退化速率，但長期低氧環(huán)境下，菌株發(fā)生突變的可能性增加[22-23]。長時間光照有利于菌絲轉(zhuǎn)色，細胞內(nèi)活性氧含量隨之增高，活性氧含量過量積累是導致蛹蟲草菌株退化的重要因素[24-25]。

培養(yǎng)基中一定濃度K+、Ca2+、Zn2+能延緩菌株退化，而Mn2+、Mg2+加速菌株退化[26]。蔗糖或葡萄糖小分子碳源，對菌絲體生長有一定促進作用，利于菌絲細胞吸收養(yǎng)分，提高菌絲質(zhì)量和子實體產(chǎn)量，淀粉作為碳源時菌絲狀態(tài)和生長速度最差；蛋白胨、蛋清液、魚粉作為氮源時易被菌絲吸收，是最佳的氮源。一定濃度的Cr3+增加菌絲協(xié)迫作用，但可提高菌株子實體生物量和有效活性成分[27-29]。

2.2 遺傳因素

2.2.1 交配型基因缺失 蛹蟲草是典型二極性異宗配合子囊菌，具有子囊菌交配型位點同位異源結構，即同一位點存在兩類不同交配型基因。蛹蟲草有性生殖受交配型基因控制，不同交配型基因的菌株通過親和性交配形成雙核菌絲，再形成子實體[30-31]。含有MAT-HMG（MAT1-2-1）和MAT-alpha（MAT1-1-1、MAT1-1-2）兩種交配型基因是異核體菌株，可進行有性生殖，栽培可形成子實體；只含有MAT-HMG（MAT1-2-1）或MAT-alpha（MAT1-1-1、MAT1-1-2）兩種交配型基因中一種的是同核體菌株，栽培不形成子實體?？梢娊慌湫突虻娜笔怯枷x草退化的主要因素之一。

2.2.2 堿基突變 蛹蟲草菌株傳代次數(shù)增加，堿基發(fā)生變異的可能性增大，菌株傳代到第5代時，比原始菌株ITS序列不同位點發(fā)生2～3處堿基突變[32]。對蛹蟲草的ITS 5.8S、18S、28S區(qū)域進行檢測，ITS+5.8S+ITS2、28S區(qū)域沒有發(fā)生變化，退化菌株在18S區(qū)域7處堿基發(fā)生突變，在5.8S+ITS區(qū)域，退化菌株在第279和360個堿基處發(fā)生T到C轉(zhuǎn)換[33]。利用PCR-RFLP（限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應）和RAPD（隨機擴增多態(tài)性DNA標記）技術發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草退化菌株在DNA水平上突變頻率高于正常菌株，限制性XspI內(nèi)切酶在退化菌株上沒有酶切位點，這可能與蛹蟲草菌株退化相關。

2.2.3 基因差異 全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草菌株體內(nèi)有多種光受體基因，敲除藍光受體基因Cmwc-1時，菌株在光照下不發(fā)生變色，影響原基和子實體形成，類胡蘿卜素及蟲草素合成受阻，分生孢子數(shù)量降低[34-35]。而Cmcry-dash缺失會降低Cmwc-1基因表達[36]。一些光受體基因是菌株退化的可能因素。

蛹蟲草單分生孢子菌株進行連續(xù)繼代培養(yǎng)，對第1代、第3代和第5代菌株形成的原基進行轉(zhuǎn)錄組測序，共檢測到10 901個基因，發(fā)現(xiàn)3 229個差異表達基因（DEGs）。第5代與第3代相比，DEGs的數(shù)目總和為2 099；第3代與第1代相比，DEGs的數(shù)目總和為656，說明分生孢子傳代到第3代是菌株退化的開始，且隨著傳代次數(shù)增加，DEGs數(shù)量不斷增多。對3 229個DEGs進行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)DEGs在生物過程中的GO富集主要表現(xiàn)在跨膜轉(zhuǎn)運過程，毒素、霉菌、次生代謝產(chǎn)物的生物合成過程和代謝過程，表明菌株退化與這些生物的合成與代謝過程有關。對DEGs進行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)第5代與第1代相比的2 366個DEGs與第5代與第3代相比的2 099個DEGs有相似的富集通路：酪氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、谷胱甘肽代謝、苯丙氨酸代謝，表明這些代謝通路可能與菌株退化有關。

DNA甲基化蛋白使退化菌株與正常菌株產(chǎn)生基因表達差異，退化菌株中CmDim-2、CmHh3、CmHmd、CmM16、CmLsd、CmHn和CmMfl7個甲基化基因表達量顯著升高，而CmHln、CmDmta和CmSam基因表達量顯著降低，通過基因敲除試驗發(fā)現(xiàn)，甲基化相關基因參與蛹蟲草的菌株生長速度、分生孢子產(chǎn)量、孢子萌發(fā)速率和菌絲尖端生長，與交配型基因在菌株退化過程中起協(xié)同作用[37]。

3 預防菌株退化的措施

3.1 適宜的環(huán)境條件

低溫黑暗是蛹蟲草菌種長期保藏的主要環(huán)境。菌種短期保藏，晝夜5～10 ℃變溫、一定量的散射光可較好保持菌種性能，菌絲生長健壯、具有整齊的菌落邊緣、生長速度快、角變面積小、轉(zhuǎn)色快、子實體品質(zhì)優(yōu)良，較4 ℃恒溫黑暗保藏效果好。菌種保藏時間超過30 d，菌種質(zhì)量顯著下降。菌種保藏時間超過1年，4 ℃低溫黑暗保藏效果較好。在培養(yǎng)基中添加0.5%瓊脂對防止水分蒸發(fā)有一定作用，密封口用無菌膠塞代替棉塞，可有效防止雜菌種污染[38]。

3.2 適宜的培養(yǎng)條件

在蛹蟲草培養(yǎng)基中添加1.5%的組氨酸和0.64%的賴氨酸明顯降低菌絲色素退化[39]。分別添加1.0 g·L-1K+、0.02 g·L-1Ca2+、250 μg·L-1或375 μg·L-1Zn2+能延緩菌落退化。蔗糖或葡萄糖等小分子碳源，蛋白胨、蛋清液等有機氮源，蠶蛹粉等復合氮源，一定濃度IAA等植物生長激素，維生素C，粉色光均有利于菌絲生長，可提升蟲草素的活性成分含量，提高菌種品質(zhì)。

3.3 減少傳代次數(shù)

研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌種在傳代培養(yǎng)時，第3代開始出現(xiàn)退化現(xiàn)象，傳代次數(shù)越多，菌種發(fā)生變異和退化的可能性越大，生產(chǎn)中盡量減少傳代次數(shù)。用液體菌種替代固體菌種，可延遲菌種退化發(fā)生的時間。

4 菌株復壯技術

4.1 組織分離法

選擇生長期10～20 d性狀優(yōu)良、顏色純正具有品種特性的優(yōu)質(zhì)子實體，或野外采集的子實體，75%酒精消毒，無菌水沖洗5次，吸干水分，在無菌操作臺上挑取上部菌體1 mm×1 mm接種于斜面培養(yǎng)基，22～25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 d，待菌絲布滿斜面，接種到大米栽培培養(yǎng)基進行子實體培養(yǎng)，人工選擇得到優(yōu)良菌株[40]。

4.2 單孢分離雜交法

將無菌培養(yǎng)獲得的優(yōu)良成熟子實體，在三角瓶上方固定，待孢子散落在三角瓶中，收集子囊孢子，采用稀釋涂布平板法獲得單孢菌落，以交配型為標記，選擇含有MAT1-1和MAT1-2的分生孢子和子囊孢子進行雜交，將獲得的雜交菌株進行子實體培養(yǎng)，篩選獲得優(yōu)良菌株[41]。

4.3 蟲體回接法

將退化的菌種接種到液體培養(yǎng)基中獲得菌懸液，用醫(yī)用注射器取0.2～0.4 mL菌懸液注射到70%～75%酒精消毒的活柞蠶蛹體內(nèi)，置于消毒瓶中16～18 ℃培養(yǎng)約50 d，待子實體長出，采用組織分離法挑取菌絲體接種到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)篩選得到優(yōu)良菌株。

4.4 物質(zhì)添加法

將退化菌株接種到含有0.1 mg·mL-1氨芐青霉素，或0.2 mg·mL-1卡那霉素，或0.025 mg·mL-1小諾霉素+頭孢霉素IV的培養(yǎng)基中進行第一次復壯培養(yǎng)3 d，再分別接種到含有添加0.3 mg·mL-1氨芐青霉素，或1 mg·mL-1鏈霉素，或1 mg·mL-1卡那霉素+0.3 mg·mL-1氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行第二次復壯培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)上培養(yǎng)，菌株菌絲生長速度大幅提高，菌絲體粗壯、致密，子實體產(chǎn)量大幅提高[42]。在100 mL MM培養(yǎng)基中添加9.375 g真姬菇菌渣（菌渣采用53.125 g大米、42%玉米芯、25%雜木屑、12%米糠、15%麩皮、6%玉米粉培養(yǎng)真姬菇），進行菌株培養(yǎng)，菌絲中蟲草素、腺苷含量增加，子實體產(chǎn)量提高[43]。

4.5 原生質(zhì)體誘變?nèi)诤戏?/h3>

蟲草屬真菌，利用原生質(zhì)體融合和誘變技術，打破種屬不親和現(xiàn)象，實現(xiàn)基因交換與重組，產(chǎn)生新的基因型。蛹蟲草育種時采用父本或母本滅活與正?；钚栽|(zhì)體融合，或父母本均采用藥物、紫外線誘變等滅活，融合子受損位點互補而具有活力，原生質(zhì)體融合后，25 ℃培養(yǎng)再生菌落，待菌絲體長滿進行優(yōu)良融合子篩選，獲得性狀穩(wěn)定的優(yōu)良菌株[44-45]。

5 結 論

蛹蟲草菌株發(fā)生退化時，其形態(tài)特征和生理生化特征會發(fā)生明顯改變，可通過直接觀測菌落形態(tài)，顯微鏡觀測菌絲結構、分生孢子形態(tài)，利用TTC-脫氫酶還原法[46]、溴麝香草酚藍指示劑法[47]、HPLC法、總糖含量測定（GB/T 15672-2009）、考馬斯亮藍G250法[19]、氮藍四唑NBT檢測法[48]測定脫氫酶活性、退化菌株的培養(yǎng)基顏色、蟲草素含量、培養(yǎng)基中總糖、培養(yǎng)基中總蛋白含量、菌絲活性氧含量，采用PCR擴增測序[17]、q RT-PCR檢測差異基因表達[19]，為生產(chǎn)中甄別退化菌株提供理論依據(jù)。

僅篩選退化菌株不能促進產(chǎn)業(yè)發(fā)展，需要采用適宜保藏條件、培養(yǎng)條件等延緩菌種退化時間，還需采用適宜的菌株復壯技術進行菌株復壯，降低生產(chǎn)風險，目前采用的菌株復壯方法主要包括組織分離法、單孢分離雜交育種法、蟲體回接法、培養(yǎng)基中添加抗生素等物質(zhì)、原生質(zhì)體誘變?nèi)诤系取?/p>

目前對蛹蟲草菌株退化的研究主要包括環(huán)境因素及菌株本身的遺傳特性兩方面，其中遺傳因素是起主導作用的因素。了解菌株退化機制，才能有效解決菌株退化問題，蛹蟲草菌種退化的研究方向包括探明退化相關基因的調(diào)控通路與有效成分合成途徑、差異表達基因的功能、基因工程改造技術等。