基于Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇葉揮發(fā)油提取工藝的研究

陶曉倩，張強，付慧敏，張純剛，2，3*，程嵐*（. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6620；2. 長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山西 長治 046000；3. 祈蒙股份有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024330）

紫蘇葉為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉（或帶嫩枝）[1]，是我國的傳統(tǒng)中藥材，是衛(wèi)生部頒布的首批既是食品又是藥品的60種中藥之一[2]。紫蘇葉中含有豐富的揮發(fā)油，主要包括紫蘇酮、紫蘇醛、紫蘇烯、石竹烯、α-法尼烯等31種成分，可分為紫蘇酮（PK）型、紫蘇醛（PA）型、芳香族化合物（PP）型、香薷酮（EK）型、紫蘇烯（PL）型五個化學(xué)型[3]，其中以紫蘇酮含量較多的PK型和以紫蘇醛及檸檬烯含量較多的PA型為主流化學(xué)型[4]。紫蘇葉揮發(fā)油（以下簡稱紫蘇葉油）具有多種生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗過敏、抗抑郁、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護等[5]。研究表明，紫蘇葉油中的紫蘇醛是重要的活性成分，具有治療口咽念珠菌病的抗真菌作用[6]；治療結(jié)腸炎小鼠模型的抗炎活性[7]；治療與氧化應(yīng)激有關(guān)疾病的潛在抗氧化作用[8]等。

水蒸氣蒸餾法是最經(jīng)典、最常用的揮發(fā)油提取方法，具有操作簡單、設(shè)備要求不高、成本低廉、適合工業(yè)化生產(chǎn)等特點[9]，多年來仍為揮發(fā)油提取的國標(biāo)方法[10]。紫蘇醛作為紫蘇葉油中重要的有效成分，以其為評價指標(biāo)優(yōu)化紫蘇葉油的提取工藝尚未見報道。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量為評價指標(biāo)，以料液比、浸泡時間、加熱時間為考察因素，利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇葉油的提取工藝，以期為紫蘇葉的開發(fā)利用及深入研究提供參考。

1 材料

1.1 試藥

紫蘇葉購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為唇形科紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉（或帶嫩枝）。紫蘇醛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111806-201806，純度：95.7%），甲醇（瑞典歐森巴克化學(xué)公司，色譜純），甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純），純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.2 儀器

LC-1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，包括四元泵，VWD可變波長掃描紫外檢測器，Chemstations化學(xué)工作站），CP225D十萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，SG3300H超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司），TGL-16G高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），DZTW調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司），揮發(fā)油提取器（太原三益生物有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫蘇葉油提取

參考《中國藥典》2020年版（四部）通則2204揮發(fā)油測定法[11]，取剪碎的紫蘇葉適量，置于燒瓶中，加水適量，搖勻混合后，浸泡一定時間，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水，使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分并溢流入燒瓶時為止。置電熱套中緩緩加熱至沸，從冷凝管中回流下第一滴油水混合物時開始計時，保持微沸，一定時間后停止加熱，放置1 h，吸取油層，12 000 r·min-1離心3 min，吸取油層，減重法得紫蘇葉油質(zhì)量（m油），其與紫蘇葉的質(zhì)量（m葉）百分比即為紫蘇葉油提取率（m紫蘇葉油）。

m紫蘇葉油（%）＝m油/m葉×100%

2.2 紫蘇醛含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ChromCore AR C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；預(yù)柱：Phenomenex C18（2.0 mm×4.0 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（75∶25，V/V）；流速：1 mL·min-1；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：230 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱量4.70 mg紫蘇醛對照品于10 mL量瓶中，加適量甲醇，超聲10 min，放至室溫，定容后搖勻，得450 μg·mL-1的紫蘇醛對照品儲備液。準(zhǔn)確移取0.2 mL紫蘇醛對照品儲備液于100 mL量瓶中，甲醇定容，即得0.90 μg·mL-1紫蘇醛對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱量5.00 mg紫蘇葉油于10 mL量瓶中，加適量甲醇，超聲10 min，放至室溫，定容后搖勻。準(zhǔn)確移取1 mL至10 mL量瓶中，定容，搖勻，過0.2 μm有機濾膜，供高效液相色譜分析用。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取1 mL紫蘇醛對照品儲備液于10 mL量瓶中，甲醇定容，得45 μg·mL-1的紫蘇醛對照品溶液。采用逐級稀釋的方法，將上述紫蘇醛對照品溶液稀釋成各質(zhì)量濃度為0.11、0.23、0.45、0.90、2.25、4.50、11.25、22.5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。進樣測定紫蘇醛含量，以對照品紫蘇醛的質(zhì)量濃度X（μg·mL-1）和峰面積Y繪制回歸曲線，得回歸方程Y＝86.62X-6.437（R2＝0.9999），表明紫蘇醛在0.11～22.5 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 專屬性試驗 分別取甲醇（陰性樣品）、紫蘇醛對照品溶液及紫蘇葉油供試品溶液，進樣測定，色譜圖見圖1。紫蘇醛色譜峰與其他組分峰可達基線分離，紫蘇葉油供試品與紫蘇醛對照品在相同時間點出現(xiàn)同一色譜峰，陰性對照品無干擾，紫蘇醛保留時間為5.241min。

圖1 陰性樣品（A）、紫蘇醛對照品（B）及紫蘇葉油供試品（C）的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of negative sample（A），perillaldehyde control substance（B）and volatile oil from perillae folium test sample（C）

2.2.6 精密度試驗 取同一紫蘇葉油供試品溶液，連續(xù)進樣測定6次，記錄紫蘇醛峰面積，計算紫蘇醛含量分別為1.9%、1.6%、1.6%、1.6%、1.6%、1.6%，RSD＜2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批號的紫蘇葉，按“2.1”項下紫蘇葉油提取方法提取紫蘇葉油樣品6份，按 “2.2.3”項下方法制備紫蘇油供試品溶液，進樣測定，記錄紫蘇醛峰面積，計算紫蘇醛含量分別為1.6%、1.6%、1.6%、1.6%、1.6%、1.6%，RSD＜1%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 同一紫蘇葉油供試品溶液，在0、2、4、6、8、12、24 h按“2.2.1”項下色譜方法進樣測定，記錄紫蘇醛峰面積，計算紫蘇油中紫蘇醛的含量分別為1.7%、1.6%、1.6%、1.7%、1.7%、1.6%、1.7%，RSD＜2%，表明紫蘇油供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收試驗 向6份1 mL已知濃度的紫蘇葉油樣品溶液中分別加入1 mL相同濃度的紫蘇醛對照品溶液，進樣測定，計算加樣回收率，測得平均加樣回收率為99.42%，RSD＜2%。表明測定方法符合要求。

2.2.10 紫蘇葉油中紫蘇醛含量測定 精密稱量紫蘇葉油適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，采用外標(biāo)一點法計算紫蘇醛含量。

m紫蘇醛（%）＝A2C1/A1C2×100%

其中，m紫蘇醛為紫蘇葉油中紫蘇醛的含量，A1為紫蘇醛對照品的峰面積，A2為紫蘇葉油供試品的峰面積，C1為紫蘇醛對照品濃度，C2為紫蘇葉油濃度。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2019b作圖，Design-Expert 8.0.6進行響應(yīng)面分析，GraphPad Prism 9進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 單因素試驗

2.4.1 紫蘇葉前處理方式 以紫蘇葉粉碎與剪碎兩種前處理方式處理紫蘇葉。取適量紫蘇葉，分別粉碎過60目篩、剪碎，以料液比（g/mL）為1∶20加水，浸泡0.75 h，加熱3 h，進樣測定，比較紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量。

由圖2可知，當(dāng)其他試驗條件相同時，紫蘇葉經(jīng)粉碎后揮發(fā)油含量明顯降低，可能是由于粉碎過程中粉碎機運作時的產(chǎn)熱作用，導(dǎo)致紫蘇葉油的揮發(fā)，使紫蘇葉油的含量明顯降低；而剪碎與粉碎得到的紫蘇醛含量相差不大，故選擇前處理方式為剪碎。

圖2 前處理方式對紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量的影響Fig 2 Effect of pretreatment on the extraction yield of volatile oil from perillae folium and perillaldehyde content

2.4.2 料液比 取適量紫蘇葉，剪碎，分別以料液比1∶10、1∶12、1∶15、1∶20、1∶25加水，浸泡0.75 h，加熱3 h，進樣測定，比較紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量。

隨著加水量的增加，紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量均顯著增加，當(dāng)料液比為1∶20時，紫蘇葉油提取率達到最高（0.607%），而當(dāng)料液比為1∶12時紫蘇醛含量達到最大（10.332%），之后紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量均隨加水量的增加而顯著降低。當(dāng)加水量增大時，有利于紫蘇葉油及紫蘇醛在水蒸氣中的擴散和溶解；但是當(dāng)加水量過大時，加熱時間相對延長，相同加熱時間內(nèi)生成的紫蘇葉油及紫蘇醛含量減少，且易造成資源浪費。因此選擇料液比1∶12、1∶16、1∶20三個水平進行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.4.3 浸泡時間 取適量紫蘇葉，剪碎，以料液比1∶20加水，分別浸泡0、0.5、0.75、1、2 h，加熱3 h，進樣測定，比較紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量。

隨著浸泡時間的增加紫蘇葉油提取率顯著升高，當(dāng)浸泡時間達到0.75 h時，紫蘇葉油提取率達到最大值（0.607%）。而紫蘇醛含量隨浸泡時間的增加呈顯著下降趨勢，綜合選擇0.5、0.75、1 h進行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.4.4 加熱時間 取適量紫蘇葉，剪碎，以料液比1∶20加水，浸泡0.75 h，加熱1、1.5、2、3、4 h，進樣測定，比較紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量。

隨著加熱時間的增加紫蘇葉油提取率顯著升高，當(dāng)加熱時間達到3 h時，紫蘇葉油提取率達到最大值。隨著加熱時間的增加紫蘇醛含量下降，綜合考慮選擇加熱2、3、4 h進行響應(yīng)面試驗考察。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

2.5.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken試驗設(shè)計原理，綜合單因素影響試驗結(jié)果，以料液比（A）、浸泡時間（B）、加熱時間（C）為考察因素，進行三因素三水平試驗，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素與水平表Tab 1 Factor and level of Box-Behnken design

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計條件進行試驗，測定不同條件下紫蘇葉油的提取率及紫蘇醛含量，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.5.2 回歸模型的建立和方差分析 以紫蘇葉油提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的試驗結(jié)果進行分析，得到紫蘇葉油提取率的多元二次回歸方程為R＝0.51+0.048A+0.033B+0.038C-6.725×10-3AB-0.024AC-1.750×10-3BC-0.046A2-0.028B2-6.902×10-3C2。由表3回歸模型方差分析表可知，一次項A、B、C和二次項A2對提取得到的紫蘇葉油提取率影響極顯著，交互項AC和二次項B2對提取得到的紫蘇葉油提取率影響顯著，其他因素影響不顯著。影響紫蘇葉油提取率的因素順序為：A＞C＞B，即料液比＞加熱時間＞浸泡時間。此模型的P＝0.0005，響應(yīng)面回歸模型達到了顯著水平（P＜0.01），失擬項（P＝0.2985＞0.05）不顯著，變異系數(shù)3.93%（＜10%），說明非試驗因素對結(jié)果影響不大，模型具有較好的試驗穩(wěn)定性。模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9578，說明實際試驗中約95.78%的結(jié)果可以通過擬合模型進行解釋，擬合效果較好，試驗誤差較小。校正后的決定系數(shù)為0.9035，說明該模型能解釋響應(yīng)值變化的90.35%，因此該方程能很好地預(yù)測和解釋紫蘇葉油提取率隨各個影響因素變化的規(guī)律。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab 2 Response surface test design and results

表3 回歸模型方差分析Tab 3 Variance analysis for the regression model

以紫蘇醛含量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的試驗結(jié)果進行分析，得到紫蘇醛含量的多元二次回歸方程為R＝9.54-0.089A-0.47B-0.99C-0.29AB-0.039AC+0.23BC-1.53A2+0.17B2+0.38C2。由表4回歸模型方差分析表可知，一次項B、C和二次項A2對提取得到的紫蘇醛含量影響極顯著，二次項C2對提取得到的紫蘇醛含量影響顯著，其他因素影響不顯著。影響紫蘇醛含量的因素順序為：C＞B＞A，即加熱時間＞浸泡時間＞料液比。此模型的P＜0.0001，響應(yīng)面回歸模型達到了極顯著水平（P＜0.01），失擬項（P＝0.9858＞0.05）不顯著，變異系數(shù)3.01%（＜10%），說明非試驗因素對結(jié)果影響不大，模型具有較好的試驗穩(wěn)定性。模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9751，說明實際試驗中約97.51%的結(jié)果可以通過擬合模型進行解釋，擬合效果較好，試驗誤差較小。校正后的決定系數(shù)為0.9432，說明該模型能解釋響應(yīng)值變化的94.32%，因此該方程能很好地預(yù)測和解釋紫蘇醛含量隨各個影響因素變化的規(guī)律。

2.5.3 Box-Behnken響應(yīng)面分析交互作用 在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件依據(jù)回歸方程繪制等高線圖及響應(yīng)面圖，分析料液比、浸泡時間、加熱時間對紫蘇葉油提取率的影響，結(jié)果見圖3。等高線圖與響應(yīng)面圖能直觀反應(yīng)交互作用對響應(yīng)值的影響程度，曲面越陡，等高線越密集，表示影響越顯著[12-15]。由圖3可知，紫蘇葉油提取率隨料液比、浸泡時間和加熱時間的升高變化幅度不同，但均呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢。料液比與加熱時間的響應(yīng)面曲線較彎曲且等高線呈橢圓形，表明料液比與加熱時間的交互作用對紫蘇葉油提取率的影響顯著（P＞0.05），料液比與浸泡時間的交互作用對紫蘇葉油提取率的影響次之，浸泡時間與加熱時間等高線趨于圓形，表明兩者的交互作用對紫蘇葉油的提取率影響最小。

圖3 各因素交互作用對紫蘇葉油提取率的影響Fig 3 Effect of interaction of various factors on extraction yield of volatile oil from perillae folium

根據(jù)表4，在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定料液比、浸泡時間、提取時間3個因素中的其中一個因素，其他兩個因素間的交互作用對紫蘇醛含量的影響可通過繪制等高線圖與響應(yīng)面圖來表示，結(jié)果見圖4。料液比與浸泡時間的交互作用對紫蘇醛含量的影響最大，浸泡時間與加熱時間的交互作用對紫蘇醛含量的影響次之，料液比與加熱時間的交互作用對紫蘇醛含量的影響最小，但其交互作用對紫蘇醛含量的影響均不顯著。

圖4 各因素交互作用對紫蘇醛含量的影響Fig 4 Effects of interaction of various factors on perillaldehyde content

表4 回歸模型方差分析Tab 4 Variance analysis for the regression model

2.6 優(yōu)化工藝及驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面分析軟件得到紫蘇葉油提取的理論最佳工藝條件為：料液比1∶17.12，浸泡時間0.68 h，加熱時間2 h。且在此條件下預(yù)測的紫蘇葉油提取率為0.473%，紫蘇醛含量為11%。結(jié)合試驗條件及實際操作的可能性，確定最佳工藝條件為：料液比1∶17，浸泡時間0.70 h，加熱時間2 h。在此條件下重復(fù)3次試驗，得到紫蘇葉油平均提取率為0.468%，紫蘇醛平均含量為10.65%。與預(yù)測值基本一致，表明該提取條件可靠，能較好地預(yù)測與分析紫蘇葉油的提取工藝，具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

紫蘇葉油的市場潛力巨大，可作為應(yīng)用于香水中的天然香料，作為芳香療法中的芳香藥物，作為食物中的調(diào)味劑和防腐劑，作為調(diào)理人體機能的保健品，作為治療人類疾病的新型消炎抗菌藥物、抗腫瘤藥物、抗抑郁藥物等[10]。本研究建立了有效測定紫蘇葉油中紫蘇醛含量的高效液相色譜方法，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上利用Box-Behnken響應(yīng)面法對紫蘇葉油的提取工藝進行了優(yōu)化，得到了紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量的兩個多元二次回歸模型，回歸模型擬合好，能很好地預(yù)測與分析紫蘇葉油的提取工藝。

本研究采用紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量兩個指標(biāo)優(yōu)化紫蘇葉油的提取工藝，相較于單一地使用其中任意一個指標(biāo)具有顯著優(yōu)勢，為獲得較高的紫蘇葉油與紫蘇醛的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論及技術(shù)支持，為紫蘇葉油的深入研究提供較優(yōu)的工藝參數(shù)，為紫蘇葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。