不同貯藏年限對莼菜種子保護酶活性及種子活力的影響

王凱飚，王先龍，王博文，向如意，王明紅

（湖北民族大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院，湖北恩施 445000）

莼菜（Brasenia schreberi）作為名、特、稀、優(yōu)的野生水生蔬菜[1]，是國家二級保護野生植物[2]，主要生長在湖泊、沼澤、池塘等淡水濕地中[3]，莼菜還是休閑觀光農(nóng)業(yè)中獨具特色的觀賞蔬菜，是我國傳統(tǒng)園林綠化植物配置中常用的植物素材[4-5]。為保持品種的優(yōu)良性狀，且莼菜種子發(fā)芽率低，因此莼菜栽培以莖段扦插的無性繁殖為主，具有繁殖周期短、速度快和數(shù)量大等優(yōu)點，但長期無性繁殖會導(dǎo)致品質(zhì)下降和產(chǎn)量降低等[6-7]，需提純復(fù)壯。莼菜在自然狀態(tài)下可以開花結(jié)籽，利用其種子開展育種研究對于保護種質(zhì)資源、保持遺傳多樣性[8]具有重要作用。但目前有關(guān)莼菜種子的研究較少，主要集中于莼菜的栽培技術(shù)方面[9-10]。覃章輝[11]解析了莼菜種子休眠的原因，并研究了光照、溫度處理對莼菜冬芽休眠解除的影響，但貯藏年限對種子活力的影響尚無研究。有作者分別研究了貯藏年限對苜蓿[12]、燕麥[13]、煙草[14]、沙芥屬[15]種子萌發(fā)和生理特性的影響，均發(fā)現(xiàn)貯藏年限對作物種子發(fā)芽影響較大，且不同作物貯藏年限差異也較大，因此，為探尋莼菜種子最佳的貯藏年限，本研究以莼菜種子為材料，比較了不同貯藏年限下莼菜種子抗氧化酶活性和發(fā)芽指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選用2018（貯藏4 年）、2019（貯藏3 年）、2020（貯藏2 年）、2022（貯藏0 年）（2021 年種子受新冠肺炎疫情影響未采集）采集的莼菜種子為材料，試驗種子均采自湖北省利川市涼霧鄉(xiāng)繼昌莼菜基地。采后待種莢腐爛，經(jīng)人工剝離種皮，消毒處理后，于4℃低溫保存。隨機選取種皮完整且無污染的不同年限種子各300 粒，備用。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 丙二醛含量和保護酶活性測定。選取不同貯藏年限種子各200 粒，用75%酒精浸泡消毒5min 后，用自來水反復(fù)沖洗，再用純水沖洗3～5 遍，用濾紙將種子表面水分吸干后，置于研缽中研磨成粉末，稱取約0.1g 樣品，各重復(fù)3 次，用于測定丙二醛含量和保護酶活性，其中，MDA 采用硫代巴比妥酸法[16]，SOD、POD、CAT 采用分光光度法[17-19]，具體提取和測定步驟按照蘇州科銘生物有限公司試劑盒內(nèi)說明書進行。

1.2.2 測定種子發(fā)芽指標(biāo)。選取貯藏不同年限的莼菜種子各100 粒，用75%酒精浸泡消毒5min 后，用自來水反復(fù)沖洗，再用純水沖洗3～5 遍，用濾紙吸干水分后，種子置于鋪有雙層濕濾紙的培養(yǎng)皿（9mm）中，每個處理4 皿，每皿25 粒種子，用純水浸透濾紙萌發(fā)，于25℃下培養(yǎng)。每天觀察發(fā)芽情況，適當(dāng)補充純水，以種子胚根長度達到種子長度視為發(fā)芽，統(tǒng)計并計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率[20]，公式如下。

發(fā)芽率（%）=（最終種子發(fā)芽數(shù)／供試種子數(shù)）×100

發(fā)芽勢（%）=（發(fā)芽種子數(shù)達到高峰時正常發(fā)芽種子總數(shù)／供試種子數(shù)）×100

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt／Dt

式中：Gt 為第t 天發(fā)芽種子數(shù)，Dt 為發(fā)芽天數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用EXCEL 2013 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，GraphPad Prism 5 和SPSS 20.2 作圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏年限對莼菜種子中丙二醛含量及抗氧化酶活性的影響

2.1.1 對丙二醛含量的影響。在相同貯藏條件下，莼菜種子MDA 含量隨著貯藏年限的延長呈現(xiàn)明顯上升趨勢（見圖1）。其中收獲當(dāng)年的莼菜種子（貯藏0 年）MDA含量顯著低于其他各貯藏年限（P＜0.5）；貯藏2 年和貯藏3 年的種子MDA 含量無顯著差異；貯藏4 年的種子MDA 含量顯著高于其他貯藏年限，分別比貯藏0 年、2年、3 年的高31.8%、21%和15.4%。

圖1 不同貯藏年限莼菜種子MDA 含量變化

2.1.2 對抗氧化酶活性的影響。①SOD 活性。在相同貯藏條件下，莼菜種子中SOD 活性隨著貯藏時間的延長呈顯著降低的變化趨勢，平均每年下降36.03%；其中，收獲當(dāng)年的莼菜種子（即貯藏0 年）SOD 活性顯著強于其他貯藏年限（P＜0.05）（見圖2）。②POD 活性。在相同貯藏條件下，莼菜種子中POD 活性隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢，其中貯藏2 年的活性最強，顯著強于其他貯藏年限（P＜0.05）（見圖3），分別較貯藏0、3、4 年的提高36.6%、69.2%和59.6%。③CAT 活性。在相同貯藏條件下，莼菜種子CAT 活性隨貯藏年限延逐漸增強，其中貯藏4 年時活性最強，顯著強于其他貯藏年限（P＜0.5）（見圖4），分別較貯藏0、2、3 年的提高84.5%、41.5%和27.6%。

圖2 不同貯藏年限莼菜種子SOD 活性變化

圖3 不同貯藏年限莼菜種子POD 活性變化

圖4 不同貯藏年限莼菜種子CAT 活性變化

2.2 貯藏年限對莼菜種子萌發(fā)特性的影響

由表1 可知，在相同貯藏條件下，隨著貯藏年限延長，莼菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均呈先增加、后降低的趨勢，其中貯藏2 年的發(fā)芽率最高，顯著高于貯藏0、4 年的種子（P＜0.05），與貯藏3 年的種子無顯著差異；發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最大，顯著大于其他貯藏年限的種子（P＜0.05）。其次是貯藏3 年的種子，貯藏0 年的種子各指標(biāo)顯著低于其他貯藏年限。

表1 不同貯藏年限對種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的影響

2.3 種子萌發(fā)指標(biāo)與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表2 可知，各發(fā)芽指標(biāo)間相關(guān)性達極顯著水平。MDA 含量及CAT 活性與各發(fā)芽指標(biāo)呈負相關(guān)，其中MDA 含量與發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)相關(guān)性達顯著水平；CAT 活性與發(fā)芽率相關(guān)性達顯著水平，與發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)相關(guān)性達極顯著水平；POD 活性與發(fā)芽率呈負相關(guān)，與發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)呈正相關(guān)，但相關(guān)性均未達顯著水平；SOD 活性與各發(fā)芽指標(biāo)呈正相關(guān)，其中與發(fā)芽率相關(guān)性達顯著水平，與發(fā)芽勢相關(guān)性達極顯著水平。CAT 活性與MDA 含量呈極顯著正相關(guān)，POD、SOD活性與MDA 含量均呈負相關(guān)，其中SOD 與MDA 含量相關(guān)性達極顯著水平。

表2 不同貯藏年份的種子活力與生理指標(biāo)的Pearson 相關(guān)性分析

3 討論

本研究比較了不同貯藏年限對莼菜種子發(fā)芽指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，貯藏2 年的莼菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均最好，貯藏0 年即當(dāng)年采收的種子發(fā)芽指標(biāo)均最差，貯藏3、4 年的種子發(fā)芽指標(biāo)均顯著下降。陳新軍等[21]研究了貯藏時間和溫度對甘藍型油菜種子活力及脂肪酸含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油菜種子隨貯藏年限的增加發(fā)芽率和發(fā)芽勢下降；楊忠仁等[22]研究結(jié)果表明，貯藏1～3 年的沙蔥種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈升高趨勢，貯藏4～10 年的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢逐漸降低；劉玉蘭等[23]研究發(fā)現(xiàn)低溫（5℃）貯藏條件下，3 個小粒豆品種安全貯藏期不同，有的為1 年，有的為2 年。說明貯藏年限對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均有一定影響，但變化趨勢存在差異，與蔬菜種類和品種有關(guān)，且不同蔬菜貯藏最佳年限存在差異，本研究中的莼菜種子在4℃低溫條件下貯藏，其最適年限為2 年，且不宜采用當(dāng)年采收的種子，可能是因為當(dāng)年采收的莼菜種子未脫離休眠期，亦或種子內(nèi)源抑制物質(zhì)含量較高，但其內(nèi)源抑制物質(zhì)含量種類和高低等尚不明確[24]，以及是否可以采用物理或化學(xué)方法打破種子休眠以提高新采收種子的發(fā)芽率等還需進一步研究；而貯藏時間超過2 年后，種子活力下降，可能與長期的呼吸作用消耗了種子內(nèi)儲存的營養(yǎng)物質(zhì)以及種子酶活性降低有關(guān)。種子發(fā)芽率除與本身特性有關(guān)外，還受貯藏條件、催芽方法等影響，如郝樹芹等[25]發(fā)現(xiàn)，60 kHz 超聲波處理一定時間可延緩貯藏種子發(fā)芽率降低的趨勢；鄭國太[26]發(fā)現(xiàn)，變成層積催芽處理有助于提高山櫻花種子發(fā)芽率，因此后續(xù)可開展相關(guān)提高莼菜種子發(fā)芽率的試驗研究。

MDA 是細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量高低反映膜脂過氧化程度的強弱和毒害程度[27]，因此可作為種子在逆境脅迫下的重要評價指標(biāo)[28]；而CAT、POD、SOD 是植物細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的3 種重要保護酶，SOD 為抗氧化酶系統(tǒng)中的第一道防線[29]，可將O2-通過歧化作用轉(zhuǎn)化成H2O2，而CAT 和POD 可將H2O2分解成O2和H2O[30-31]，三者協(xié)同作用，清除細胞內(nèi)的超氧陰離子自由基和過氧化氫等，保護生物膜系統(tǒng)免受損傷[32]。本研究中，莼菜種子MDA 含量隨貯藏年限延長呈上升趨勢，貯藏4 年的種子MDA 含量最高，表明其膜脂過氧化程度最嚴重，貯藏2 年和3 年的種子MDA 含量相差不大；而SOD 活性變化趨勢與MDA 相反，貯藏4 年的種子SOD 活性最弱，側(cè)面反映隨著貯藏年限的增加，種子活力減弱；CAT 活性變化趨勢與MDA 一致，說明為清除其體內(nèi)過多的過氧化物，種子通過增強抗氧化系統(tǒng)中CAT 活性，以避免種子老化程度加?。籔OD 活性變化趨勢與其他酶不同，貯藏2 年的種子POD 活性最強，顯著強于其他貯藏年限，說明POD 在種子抗氧化老化過程中發(fā)揮了重要作用，是清除H2O2的關(guān)鍵酶，但貯藏3 年和4 年后種子內(nèi)的POD 酶活性減弱，不足以清除種子老化和劣變導(dǎo)致的MDA，因此貯藏年限超過2 年后，時間越長，種子活力越弱，發(fā)芽指數(shù)降低。劉逸童等[33]發(fā)現(xiàn)低溫和常溫貯藏下，隨貯藏時間延長，各品種水稻的MDA 含量逐漸升高，而SOD、POD、CAT 活性逐漸下降；徐寧偉等[34]研究自然貯藏時間對葉底珠種子保護酶活性及種子活力的影響，發(fā)現(xiàn)SOD 活性先升后降、POD 和MDA 含量逐漸升高，CAT 活性逐年下降，與本研究結(jié)果略有不同。由此可見，不同貯藏年限對種子內(nèi)抗氧化酶活性的影響比較復(fù)雜，因受貯藏環(huán)境和種間差異的制約有所不同。

為進一步研究各指標(biāo)間的關(guān)系，進行了指標(biāo)間的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示MDA 含量與種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著負相關(guān)，說明可通過測定MDA 含量判定種子活力；CAT 活性與MDA 含量極顯著正相關(guān)，說明CAT對清除種子體內(nèi)MDA 具有重要作用；SOD 活性與MDA 含量極顯著負相關(guān)，說明SOD 活性高低也可用于評價莼菜種子活力。

4 結(jié)論

在低溫貯藏條件下，莼菜種子最佳貯藏年限為2年。在實際生產(chǎn)過程中，利用種子進行莼菜的繁育，不建議使用貯藏2 年以上的種子；因2 年后種子劣變程度增加，其種用價值降低。