王玉婷 王安琪 李志利 呂政融 黃楚月 樊志敏

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院肛腸科，江蘇南京 210000

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居世界范圍內(nèi)第3 位，且病死率處于第2位[1]。當(dāng)前，CRC 的診療方面主要存在兩大困境。首先，早期診斷篩查常用的生物標(biāo)志物，例如癌胚抗原、糖類抗原19-9 等，存在特異性以及敏感性不足的問題[2-4]。其次，耐藥性常限制靶向化療藥物的療效。因此，尋找可以有效靶向診療CRC 的方式是亟待解決的問題。近年來，不斷有研究指出循環(huán)中的外泌體分泌的一些微小RNA（microRNA，miRNA）與CRC 密切相關(guān)，它們不僅可以作為生物標(biāo)志物，早期特異性提示腫瘤的增殖與分化，還可以成為創(chuàng)新性靶點(diǎn)，為CRC 的治療提供更廣泛的思路[5-7]?；谝陨媳尘埃疚氖崂砹搜h(huán)中外泌體及其分泌的miRNA 的生物學(xué)特征，并分別闡釋了外泌體miRNA 診斷與治療CRC 的潛在方式與相關(guān)通路，以期建立基于外泌體miRNA 診療CRC 的創(chuàng)新模式。

1 外泌體miRNA 的生物學(xué)特征

外泌體是直徑30～100 nm 具有介導(dǎo)細(xì)胞間通信功能的內(nèi)源性小囊泡，它廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液及乳汁等多種體液中，且常攜帶著蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸、核糖核酸、脂質(zhì)等活性物質(zhì)[8-9]。其中，miRNA 的功能最為廣泛且具有功效強(qiáng)、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，因此現(xiàn)代研究較深入地探討了其生物學(xué)特性及作用機(jī)制。

首先，在生理學(xué)特性方面，miRNA 是一種21～22 nt的小非編碼RNA，通過與靶mRNA 的互補(bǔ)3’-非翻譯區(qū)結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控作用[10]。其次，在功能特征方面，miRNA 可以影響包括細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、細(xì)胞增殖和凋亡在內(nèi)的多種通路，并通過影響腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生與發(fā)展，例如：姜黃素誘導(dǎo)的miR-192-5p 上調(diào)，可以通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信號通路，進(jìn)而影響人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。后續(xù)的研究表明[12]，CRC 患者循環(huán)miR-192-5p 含量下調(diào)還會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)血管增生，引起腫瘤內(nèi)環(huán)境紊亂，最終增加CRC 淋巴轉(zhuǎn)移及血管侵襲的風(fēng)險(xiǎn)?；谝陨咸匦?，外泌體miRNA 可以從細(xì)胞代謝及腫瘤微環(huán)境等方面影響癌癥的發(fā)生與發(fā)展，同時(shí)結(jié)合其功效強(qiáng)、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，外泌體miRNA 有望成為CRC 等癌癥診斷的關(guān)鍵生物標(biāo)志物以及創(chuàng)新性的治療靶點(diǎn)。

2 外泌體miRNA 作為CRC 潛在的臨床生物標(biāo)志物

首先，在生物標(biāo)志物方面，外泌體miRNA 不僅參與CRC 的檢測與診斷，還可作為判斷預(yù)后的標(biāo)志物，為優(yōu)化CRC 治療方案提供切實(shí)可靠的客觀依據(jù)。

2.1 外泌體miRNA 作為CRC 的診斷生物標(biāo)志物

在早期CRC 階段，循環(huán)中外泌體miRNA 的含量波動(dòng)可能對CRC 的早期診斷具有重要的指示作用。常文婧等[13]在提取40 名健康受試者與78 例CRC 患者的血清并分析后指出，CRC 患者較對照組血清外泌體miR-218-5p 的表達(dá)明顯降低，這提示miR-218-5p具有成為CRC 診斷標(biāo)志物的潛力。另一項(xiàng)通過檢索TCGA-COAD 數(shù)據(jù)庫獲得的miR-27a 表達(dá)譜顯示，過表達(dá)miR-27a 的CRC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力增加，這項(xiàng)研究支持miR-27a 作為CRC 的診斷標(biāo)志物[14]。此外，大量研究證實(shí)包括miR-130a[15]、miR-21[16]、miR-29[17]、miR-125a-3p[18]等在內(nèi)的多種循環(huán)外泌體miRNA 均可以作為CRC 的診斷標(biāo)志物。其中，CRC疾病進(jìn)程中常過度表達(dá)的原癌基因miR-21 潛在的臨床意義更受認(rèn)可，下文將著重闡釋。

由于miR-21 具有高度的敏感性和特異性[19]，其含量的變化不僅可以用于CRC 的早期篩查診斷，還可以靈敏地反映出CRC 的分期[20]。首先，在CRC 早期篩查診斷方面，一項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)指出，息肉和CRC患者血清miR-21 的表達(dá)顯著升高[21]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)的miR-21 可以通過調(diào)控磷酸酶和張力蛋白同系物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）/PI3K/Akt 信號通路，下調(diào)大腸癌中PTEN 的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤細(xì)胞遷移和凋亡等生物學(xué)過程。其次，在反映CRC 分期方面，能夠顯著區(qū)分大腸癌Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期[22]。

結(jié)合上述研究可得，外泌體miRNA 有望成為診斷CRC 的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。但由于miRNA 種類的廣泛性及靶點(diǎn)的非特異性，其反映CRC 的敏感性尚存疑問。事實(shí)上，相關(guān)研究已指出外泌體miRNA 常由于多種非靶點(diǎn)效應(yīng)干擾對疾病的診斷及治療[23]。因此，后續(xù)研究應(yīng)聚焦外泌體miRNA 的關(guān)鍵性、特異性功能，以推動(dòng)其臨床應(yīng)用進(jìn)程。

2.2 外泌體miRNA 作為CRC 的預(yù)后生物標(biāo)志物

除了作為CRC 的診斷標(biāo)志物，外泌體miRNA 與淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)等臨床病理學(xué)特征相關(guān)，因此它還可作為CRC 患者的預(yù)后標(biāo)志物。臨床研究表明，CRC Ⅴ期患者血清miR-200c 水平的顯著升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲等預(yù)后不良指標(biāo)呈正相關(guān)[24]。同樣，Cho等[25]通過qRT-PCR 檢測了69 例CRC 患者血漿中的外泌體也證實(shí)了血清外泌體miR-193a 顯著減少，及l(fā)et-7g 含量增加，與CRC 靜脈浸潤和淋巴浸潤等不良預(yù)后指標(biāo)關(guān)聯(lián)顯著，并不同程度地降低了患者的存活率。而從機(jī)制上分析，外泌體miRNA 含量異常的變化常通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的代謝，影響相關(guān)疾病的進(jìn)程，例如，Sun等[26]發(fā)現(xiàn)源自轉(zhuǎn)移性CRC 細(xì)胞系（SW620）的外泌體miR-335-5p 通過其靶基因RASA1 激活RAS 信號傳導(dǎo)，最終促進(jìn)CRC 細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，外泌體miR-193a、let-7g及miR-335-5p 等有潛力成為判斷CRC 預(yù)后的生物標(biāo)志物，并為CRC 的臨床治療提供有價(jià)值的前沿策略。但是目前如何將復(fù)雜的miRNA 變化與患者個(gè)體情況交叉對應(yīng)，并據(jù)此制訂更加精準(zhǔn)的個(gè)體化治療方案是亟待解決的問題之一。

3 外泌體miRNA 在靶向治療CRC 中的應(yīng)用

外泌體miRNA 靶向治療CRC 主要體現(xiàn)在改善CRC 患者化療耐藥性以及通過“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)傳遞功能性miRNA。首先，CRC 患者長期治療過程中會(huì)普遍存在化療耐藥現(xiàn)象，影響患者的生活質(zhì)量及預(yù)后情況。有研究指出[23]，外泌體miRNA 可以調(diào)控許多藥物反應(yīng)中的關(guān)鍵功能蛋白，從而改善CRC 患者的化療耐藥性。此外，一些外泌體可以協(xié)助miRNA逃避宿主的免疫檢測，有效傳遞具有抑癌或改善化療耐藥性功能的miRNA，這一“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)也擁有良好的臨床應(yīng)用前景。

3.1 外泌體miRNA 改善CRC 化療耐藥

許多臨床常用的化療藥物靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式抑制CRC 的進(jìn)展。然而，患者對以氟尿嘧啶、奧沙利鉑為例的化療藥物的耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的原因之一。研究表明[27]，外泌體miRNA可有效改善患者對化療藥物的耐藥性。Jin等[28]在奧沙利鉑/氟尿嘧啶耐藥的CRC 細(xì)胞系模型中檢測了多種與CRC 進(jìn)展密切相關(guān)的miRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)模型中外泌體miR-21-5p、miR-96-5p、miR-1246 和miR-1229-5p 的表達(dá)明顯高于對照組。后續(xù)經(jīng)過富集信號通路發(fā)現(xiàn)，上述外泌體miRNA 參與了在細(xì)胞生長、代謝和化療耐藥發(fā)揮生物學(xué)作用的PI3K/Akt 信號通路。通過靶向抑制上述miRNA 的表達(dá)可以促進(jìn)CRC細(xì)胞對奧沙利鉑/ 氟尿嘧啶的敏感性，從而為改善CRC 化療過程中的耐藥現(xiàn)象提供新的靶點(diǎn)。Liu等[29]使用編碼miR-128-3p 的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染耐奧沙利鉑的CRC 細(xì)胞結(jié)果表明，外泌體miR-128-3p 增強(qiáng)了CRC 細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性，并顯著抑制了腫瘤的生長。這一方面是由于miR-128-3p 可上調(diào)E-鈣黏素水平，并通過抑制耐藥細(xì)胞中Bmi1 基因的表達(dá)來抑制奧沙利鉑誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。另一方面，它還通過抑制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP5 的表達(dá)而增加奧沙利鉑在體內(nèi)的蓄積時(shí)間。因此，外泌體miRNA 可以通過多靶點(diǎn)多通路的方式作用于化療藥物反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白，改善患者對化療藥物的耐藥性?；谶@一特性，靶向調(diào)節(jié)外泌體miRNA 作為化療輔助方式可以成為創(chuàng)新性的CRC 治療方式。

3.2 外泌體-miRNA 運(yùn)載體系

外泌體作為細(xì)胞間信息的天然載體，參與細(xì)胞間生物分子的交換，且其可以通過膜上的“配體-受體”識(shí)別并將miRNA 運(yùn)送到特定類型的細(xì)胞，協(xié)助miRNA 躲過宿主免疫識(shí)別，特異性發(fā)揮相關(guān)療效。此外，與脂質(zhì)體、樹突狀細(xì)胞和聚合物等合成納米制劑比較，外泌體還具有體積小、生物相容性好、毒性低的優(yōu)點(diǎn)，更適合作為特定miRNA 的遞送載體[30-31]。

上文已經(jīng)介紹miR-21 是一種原癌基因，使用miR-21 抑制劑是治療CRC 的有效方式之一，但是由于宿主免疫識(shí)別，miR-21 特定的抑制劑往往效能低下。2020 年，Liang等[32]創(chuàng)新性地將攜帶氟尿嘧啶和miR-21 抑制劑寡核苷酸的外泌體導(dǎo)入耐氟尿嘧啶的大腸癌細(xì)胞及荷瘤小鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞對氟尿嘧啶的攝取增加，且其內(nèi)miR-21 的表達(dá)顯著下調(diào)，最終明顯抑制了荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤生長。此研究直觀證明了“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)可以有效提高癌癥的治療效率。Han等[33]則將抗miR-221 寡核苷酸導(dǎo)入外泌體中，再添加到HCT116 細(xì)胞中培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)CRC 細(xì)胞增殖受到了明顯抑制。隨后其在皮下HCT116荷瘤小鼠中繼續(xù)使用抗miR-221 寡核苷酸-外泌體治療驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)治療小鼠的腫瘤體積增長明顯慢于對照組。因此，外泌體-miRNA 運(yùn)載體系靶向治療CRC 效果顯著，有望成為治療CRC 及改善腫瘤耐藥的新興療法。然而，“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)導(dǎo)入的外源性miRNA 是否會(huì)引起宿主原有游離miRNA 種群的波動(dòng)仍未可知。同時(shí)，外源性miRNA 與游離miRNA之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系還可能會(huì)加劇CRC 微環(huán)境的復(fù)雜性。因此，基于“外泌體-miRNA”遞送系統(tǒng)的治療模式尚存空白，后續(xù)研究應(yīng)注重探討外源性刺激與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)之間的動(dòng)態(tài)平衡。

4 小結(jié)

越來越多的證據(jù)表明，外泌體miRNA 與CRC 的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程密切相關(guān)，因此可能作為CRC 診斷、評估預(yù)后的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[6，34]。在此基礎(chǔ)上，本文綜述了外泌體miRNA 作為診斷并判斷CRC 臨床分期及其預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，并為CRC 治療提供了相關(guān)優(yōu)化方案，以期在臨床早日普及基于外泌體miRNA 的CRC 診療模式。雖然目前大量關(guān)于外泌體miRNA 診療CRC 的實(shí)驗(yàn)研究都表明了其臨床可行性[35-36]，但仍有必要進(jìn)行一些大型的前瞻性研究，以探索最佳的敏感性和特異性。此外，優(yōu)化外源性miRNA 與體內(nèi)游離miRNA 之間的動(dòng)態(tài)平衡也應(yīng)成為臨床治療原則之一。