周吟毅,陳搖田,楊雪寒,王曉涵,齊潔玉,柴人杰,2,3,4,5

(1. 東南大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,附屬中大醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,生命健康高等研究院,江蘇省生物醫(yī)藥高新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210096;2. 南通大學(xué)神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南通 226001; 3. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,四川成都 610072;4. 中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100101;5. 首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100069)

1 內(nèi)耳干細(xì)胞

新生小鼠耳蝸中感覺上皮中含有干細(xì)胞，這些干細(xì)胞能在體外進(jìn)行自我更新，并分化成毛細(xì)胞。研究鑒定了內(nèi)耳聽覺上皮中的Lgr5、Axin2和Frizzled9陽(yáng)性內(nèi)耳干細(xì)胞。Lgr5是一種Wnt共受體，是包括腸道、肝臟和皮膚在內(nèi)的多種組織中公認(rèn)的祖細(xì)胞標(biāo)記物[6]。耳蝸中，Lgr5表達(dá)于小鼠耳蝸部分支持細(xì)胞中，包括第三排Dieters細(xì)胞、內(nèi)柱細(xì)胞、內(nèi)指細(xì)胞以及內(nèi)邊界細(xì)胞[7]。小鼠耳蝸中Axin2是Wnt信號(hào)通路中的β-catenin負(fù)調(diào)節(jié)子，表達(dá)于鼓階邊緣細(xì)胞中[8]。Frizzled9也是Wnt受體之一，表達(dá)于內(nèi)指細(xì)胞、內(nèi)邊界細(xì)胞和第三排Deiters細(xì)胞，被認(rèn)為是Lgr5陽(yáng)性內(nèi)耳干細(xì)胞中的一個(gè)亞群。在受到損傷的內(nèi)耳組織中，內(nèi)耳干細(xì)胞都可以再生具有各種特定毛細(xì)胞標(biāo)記物的毛細(xì)胞[9]。

2 毛細(xì)胞再生的信號(hào)調(diào)控

數(shù)十年來(lái)，許多調(diào)控內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程的重要作用基因被發(fā)現(xiàn)。Atoh1在毛細(xì)胞發(fā)育和分化中起正向調(diào)節(jié)作用。小鼠胚胎期缺乏Atoh1會(huì)誘發(fā)毛細(xì)胞和相關(guān)支持細(xì)胞的完全喪失。同時(shí)，多種信號(hào)通路，包括Wnt、Notch等已被發(fā)現(xiàn)通過(guò)控制各種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)參與調(diào)節(jié)內(nèi)耳發(fā)育。

2.1 Wnt信號(hào)通路Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及其再生中起到至關(guān)重要的作用，主要包括Wnt/β-catenin、Wnt/PCP和Wnt/calcium信號(hào)通路。從低等到高等哺乳動(dòng)物，Wnt信號(hào)通路表現(xiàn)出高度保守性。Wnt蛋白作為配體和細(xì)胞膜上的受體蛋白特異性結(jié)合，激發(fā)多個(gè)下游通道，向胞內(nèi)傳遞信號(hào)。Wnt/β-catenin參與哺乳動(dòng)物內(nèi)耳早期的聽泡和聽基板的分化[10]，Wnt信號(hào)分子主要在蝸管中發(fā)揮作用，靶基因主要位于聽泡背側(cè)，調(diào)節(jié)細(xì)胞極性和耳蝸管的延伸。此外，在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中限制Wnt表達(dá)也可以控制半規(guī)管的形成[11]，在耳蝸感覺前體和支持細(xì)胞中上調(diào)Wnt信號(hào)，可促進(jìn)毛細(xì)胞分化[12]，Wnt信號(hào)通路的激活也可以阻止耳毒性藥物引起的毛細(xì)胞壞死和脫落[13]。然而，只有少數(shù)增殖的Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成毛細(xì)胞[14]。這表明，盡管Wnt激活可以增加內(nèi)耳祖細(xì)胞，但Wnt激活本身并不能大量再生新的毛細(xì)胞。

2.2 Notch信號(hào)通路Notch信號(hào)在脊椎和非脊椎動(dòng)物中廣泛存在并高度保守。Notch配體受體特異性結(jié)合以后，受體蛋白經(jīng)蛋白酶水解釋放出胞內(nèi)段，移位至核中與CSL、MAML蛋白家族結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物，解除轉(zhuǎn)錄抑制，驅(qū)動(dòng)下游Atoh1等轉(zhuǎn)錄表達(dá)。內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中，Notch信號(hào)通路在支持細(xì)胞和毛細(xì)胞的分化方面不可或缺，如參與耳蝸感覺前體細(xì)胞等形成[15]。Wnt和Notch通路在毛細(xì)胞再生過(guò)程中以拮抗的方式進(jìn)行遺傳相互作用。Notch通路的抑制可以活化Wnt/β-catenin信號(hào)，促進(jìn)支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞[16]。然而，Notch抑制誘導(dǎo)的支持細(xì)胞分化為毛細(xì)胞，是以支持細(xì)胞減少為代價(jià)的[17～19]。支持細(xì)胞的缺失又會(huì)導(dǎo)致包括新分化的毛細(xì)胞的死亡[14]。因此，單純的Notch抑制也是長(zhǎng)期毛細(xì)胞再生的理想解決方案。先讓支持細(xì)胞增殖，然后讓增殖的支持細(xì)胞分化為毛細(xì)胞可能是促進(jìn)有絲分裂毛細(xì)胞再生的最佳途徑。

2.3 Atoh1信號(hào)堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子Atohl是內(nèi)耳毛細(xì)胞分化所必需的關(guān)鍵因子,它通過(guò)作用于下游靶基因從而啟動(dòng)內(nèi)耳毛細(xì)胞的分化。Atoh1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致耳蝸非感覺區(qū)毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的形成[20]或異位毛細(xì)胞的形成[21]。Atoh1由Notch信號(hào)通路下游基因Hes1、Hes5介導(dǎo)，調(diào)控毛細(xì)胞和支持細(xì)胞產(chǎn)生。抑制Hes1、Hes5能促進(jìn)Atoh1的表達(dá)，從而促進(jìn)支持細(xì)胞分化為毛細(xì)胞。盡管有這些有希望的發(fā)現(xiàn)，但Atoh1在動(dòng)物中的強(qiáng)制表達(dá)顯示出毛細(xì)胞的再生效率和功能成熟度的巨大差異，并且再生效率隨著年齡的增長(zhǎng)而進(jìn)一步降低[22]。因此單純的Atoh1不足以再生具有生理功能的成熟的毛細(xì)胞，可能需要其它轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)。

2.4 其他信號(hào)分子Fox蛋白家族是具有翼狀螺旋的轉(zhuǎn)錄因子，與染色質(zhì)結(jié)合參與其結(jié)構(gòu)重組。FoxG1是家族中的成員，在哺乳動(dòng)物、果蠅、線蟲中高度同源，參與腦、內(nèi)耳等多種組織的增殖分化，在早期神經(jīng)發(fā)育、線粒體能量代謝和生物合成中具有重要的調(diào)節(jié)作用。FoxG1與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)緊緊聯(lián)系。FoxG1缺失會(huì)對(duì)多個(gè)信號(hào)通路的表達(dá)產(chǎn)生影響，主要表現(xiàn)為細(xì)胞分化能力的增強(qiáng)和增殖能力的抑制。FoxG1可以直接或間接地對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性進(jìn)行抑制。內(nèi)耳干細(xì)胞中敲除FoxG1后誘發(fā)其向毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[23]。

Lin28是一種進(jìn)化上保守的RNA結(jié)合蛋白，作為胚胎干細(xì)胞自我更新的調(diào)節(jié)因子高度表達(dá)[24]。研究證明，由Lin28B蛋白和let-7 miRNA組成的通路通過(guò)增強(qiáng)mTOR信號(hào)通路活性調(diào)節(jié)P5期小鼠耳蝸外植體中新毛細(xì)胞的產(chǎn)生，Lin28B促進(jìn)新毛細(xì)胞產(chǎn)生，let-7 miRNAs抑制其產(chǎn)生，兩者是抑制彼此表達(dá)的拮抗劑[25]。此外，LIN28B和卵泡抑素Follistatin共激活增強(qiáng)了新生小鼠的自發(fā)耳蝸毛細(xì)胞再生[26]。

Hippo信號(hào)通路參與內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷和自我修復(fù)過(guò)程。調(diào)控Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白Mst1/2可以促進(jìn)Hippo信號(hào)通路效應(yīng)因子YAP1的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生[27]。

3 多基因協(xié)同調(diào)控毛細(xì)胞再生

毛細(xì)胞再生的經(jīng)典調(diào)控信號(hào)通路如Wnt、Notch、Atoh1、Hippo/Yap等信號(hào)之間存在豐富的通訊網(wǎng)絡(luò)。如Wnt激活與Notch抑制的協(xié)同調(diào)控可以促進(jìn)出生后小鼠耳蝸的毛細(xì)胞再生[28, 29]。而Notch 通路抑制與Hippo通路抑制協(xié)同作用促進(jìn)毛細(xì)胞再生[27],特別是在促進(jìn)支持細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞方面。在新生Lgr5陽(yáng)性祖細(xì)胞中共同激活Wnt和Atoh1可以提高毛細(xì)胞生成的效率[30]；在Sox2陽(yáng)性支持細(xì)胞中抑制Notch、激活Wnt和Atoh1，使得內(nèi)耳的感覺和非感覺區(qū)域誘導(dǎo)了毛細(xì)胞的異位生成[29]。然而，這些新生成的毛細(xì)胞部分沒有表達(dá)終末分化標(biāo)志物(內(nèi)毛細(xì)胞的vGlut3和外毛細(xì)胞的Prestin)，也沒有顯示成熟耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特性，這表明這些新的毛細(xì)胞仍然不成熟且無(wú)功能。

在耳蝸發(fā)育過(guò)程中，毛細(xì)胞的形成和成熟受到多種信號(hào)和轉(zhuǎn)錄因子的時(shí)空調(diào)控。Atohl作為正性調(diào)控基因，可通過(guò)調(diào)控促進(jìn)胚胎晚期毛細(xì)胞的發(fā)育成熟的轉(zhuǎn)錄因子Pou4f3或其他基因來(lái)掌控毛細(xì)胞的命運(yùn)和發(fā)育[31]。Pou4f3位于Gfil上游，控制著Gfil蛋白在毛細(xì)胞中的表達(dá)[32]。聯(lián)合調(diào)控Gfi1、Pou4f3和Atoh1，發(fā)現(xiàn)多基因的聯(lián)合調(diào)控能夠顯著提高毛細(xì)胞再生的效率[22],表達(dá)耳蝸內(nèi)成熟毛細(xì)胞的標(biāo)志物vGlut3或者Prestin，電生理的研究結(jié)果顯示新生內(nèi)毛細(xì)胞模擬了耳蝸固有內(nèi)毛細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程[7]。Ikzf2是在耳蝸外毛細(xì)胞特異表達(dá)的一個(gè)基因，其功能突變導(dǎo)致外毛細(xì)胞發(fā)育障礙[33]。Atoh1和Ikzf2在內(nèi)耳干細(xì)胞中的共同過(guò)表達(dá)可以使出生后一個(gè)月小鼠耳蝸內(nèi)新生的毛細(xì)胞獲得比擬出生后1天小鼠外毛細(xì)胞的狀態(tài)[34]。Tbx2是一個(gè)在內(nèi)毛細(xì)胞，而不在外毛細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)控內(nèi)毛細(xì)胞正常分化的核心基因，缺失Tbx2后內(nèi)毛細(xì)胞將不能進(jìn)行正常分化，反而轉(zhuǎn)變?yōu)橥饷?xì)胞[35]。Tbx2和Atoh1聯(lián)用產(chǎn)生的新生vGlut3陽(yáng)性內(nèi)毛細(xì)胞無(wú)論在數(shù)量上，還是在分化程度上，都較之前單獨(dú)Atoh1過(guò)表達(dá)有顯著的提高。

小鼠耳蝸在出生后的成熟發(fā)育過(guò)程中，支持細(xì)胞再生毛細(xì)胞的能力大幅下降。p27Kip1缺失與異位Atoh1表達(dá)的結(jié)合克服了這種年齡相關(guān)性的干細(xì)胞可塑性下降，使成熟小鼠和噪聲損傷后的小鼠支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞。p27kip1缺失，上調(diào)了隨年齡增長(zhǎng)從內(nèi)耳干細(xì)胞中丟失的Atoh1的輔因子Gata3。Gata3和Pou4f3促進(jìn)成熟耳蝸中Atoh1介導(dǎo)的毛細(xì)胞再生，Pou4f3的單獨(dú)激活、Gata3與Atoh1的共同激活、Pou4f3與Atoh1的共同激活可以促進(jìn)成年小鼠支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞。這表明p27kip1、Gata3和Pou4f3是Atoh1介導(dǎo)的毛細(xì)胞再生的共同治療靶點(diǎn)[36]。此外，Lin28b和Follistatin的短暫共激活能夠?qū)⒊墒於佒С旨?xì)胞重新編程為祖細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)其再生能力，二者通過(guò)上調(diào)TGF-β增強(qiáng)了新生小鼠的耳蝸毛細(xì)胞的自發(fā)性再生[26]。機(jī)制上，耳蝸單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳組學(xué)分析顯示，隨著小鼠耳蝸出生后發(fā)育，毛細(xì)胞基因位點(diǎn)在內(nèi)耳干細(xì)胞中的表觀遺傳性下降[22],表明需要通過(guò)額外的毛細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和支持細(xì)胞中毛細(xì)胞位點(diǎn)的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子在重新編程期間降低支持細(xì)胞基因，從而產(chǎn)生功能性的毛細(xì)胞。

4 毛細(xì)胞再生療法

4.1 小分子藥物Frequency Therapeutics開發(fā)了一種新藥FX-322，旨在通過(guò)重編程祖細(xì)胞來(lái)激活人體先天毛細(xì)胞再生潛力的療法來(lái)恢復(fù)噪聲誘發(fā)或突發(fā)感音神經(jīng)性相關(guān)的聽力損失。該研究的主要結(jié)果測(cè)量是語(yǔ)音感知，這是一種衡量聲音清晰度和理解語(yǔ)音的測(cè)試聽力損失。單劑量FX-322的臨床研究表明，語(yǔ)言感知測(cè)量的聽力有所改善[37]。FX-322是第一個(gè)在感音神經(jīng)性聽力損失的臨床試驗(yàn)中顯示出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和臨床意義的聽力改善的候選產(chǎn)品，目前處于二期臨床試驗(yàn)階段。除了FX-322上的臨床工作，F(xiàn)requency正在開發(fā)一種新的臨床前候選藥物FX-345，通過(guò)毛細(xì)胞再生來(lái)治療感覺神經(jīng)性聽力損失。FX-345可以以不同的劑量水平治療不同的感音神經(jīng)性聽力損失患者群體。

南京大學(xué)的萬(wàn)國(guó)強(qiáng)團(tuán)隊(duì)優(yōu)化、表征并利用小鼠耳蝸類器官平臺(tái)，對(duì)一千多種FDA批準(zhǔn)的小分子藥物進(jìn)行了高通量篩選，發(fā)現(xiàn)腫瘤治療藥物瑞戈菲尼能夠顯著促進(jìn)耳蝸類器官中毛細(xì)胞的分化。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)瑞戈菲尼在小鼠離體耳蝸組織中同樣高效促進(jìn)毛細(xì)胞的再生和成熟，而這一過(guò)程是由VEGFR-MEK-TGFB1信號(hào)軸介導(dǎo)，并不依賴于Notch這一經(jīng)典的毛細(xì)胞再生通路[38]。盡管有一些有希望的發(fā)現(xiàn)，功能性毛細(xì)胞再生恢復(fù)聽覺功能暫時(shí)仍不能有效實(shí)現(xiàn)。

4.2 AAV介導(dǎo)的干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)基因遞送的理想載體需要將目的核酸片段準(zhǔn)確遞送至內(nèi)耳和靶細(xì)胞并高效表達(dá)。此外，載體還需要轉(zhuǎn)染效率高，強(qiáng)度和時(shí)間可控，安全性高等指標(biāo)要求。2005年，研究者首次使用腺病毒載體將Atoh1基因轉(zhuǎn)染到內(nèi)耳，發(fā)現(xiàn)Atoh1可以通過(guò)編碼HLH轉(zhuǎn)錄因子和與毛細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的關(guān)鍵因素來(lái)實(shí)現(xiàn)耳聾后的部分聽力恢復(fù)和改善[39]。然而，腺病毒的不能長(zhǎng)期表達(dá)和潛在的免疫毒性反應(yīng)限制了其在臨床上的應(yīng)用。Clinicaltrials.gov上顯示的正在進(jìn)行的臨床實(shí)驗(yàn)中，最常用的體內(nèi)基因治療載體是重組腺相關(guān)病毒AAV(recombined adeno-associated viruse, rAAV)。AAV載體介導(dǎo)的基因治療已在美國(guó)獲批，可用于治療罕見的遺傳性眼病。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些理想的可在內(nèi)耳轉(zhuǎn)染的AAV載體。基于AAV衣殼的原始序列制作了可高效靶向耳蝸毛細(xì)胞載體AAV2/Anc80L65,解決了傳統(tǒng)AAVs感染外毛細(xì)胞效率低的問題[40]。隨后又發(fā)現(xiàn)具更高感染效力的AAV2.7m8[14]，不僅優(yōu)先靶向耳蝸毛細(xì)胞，還可以有效感染Lgr5陽(yáng)性支持細(xì)胞。Tan等通過(guò)插入多肽DGTLAVPFK構(gòu)建了AAV-DJ的突變體AAV- inner ear(AAV-ie)，通過(guò)產(chǎn)生跨膜結(jié)構(gòu)提高感染效率[41]，AV-ie可以有效感染耳蝸毛細(xì)胞和前庭毛細(xì)胞。此外，研究發(fā)現(xiàn)AAV-ie不會(huì)影響毛細(xì)胞和聽覺系統(tǒng)的功能，其在糾正遺傳性聽力損傷和毛細(xì)胞再生治療方面具有重要的潛力。AAV-ie是能夠?qū)⑼庠碅toh1遞送至內(nèi)耳干細(xì)胞中，體內(nèi)實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳干細(xì)胞向毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)化等[41]。然而，AAV-ie對(duì)支持細(xì)胞的非特異靶向性限制了其在功能性毛細(xì)胞再生中的應(yīng)用，相同滴度下AAV-ie可以以幾乎100%的比例轉(zhuǎn)導(dǎo)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元。因此，開發(fā)高效特異靶向支持細(xì)胞的AAV對(duì)基于支持細(xì)胞，即內(nèi)耳干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)研究至關(guān)重要。

5 結(jié)論與展望

耳蝸毛細(xì)胞的受損和缺失，是造成感音神經(jīng)性聾的核心原因之一。成年哺乳動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，其受損缺失后不能自發(fā)再生得到補(bǔ)充。治療感音神經(jīng)性聾最理想的方法是通過(guò)干細(xì)胞使毛細(xì)胞再生，從而使耳蝸結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)，從而在根本上恢復(fù)聽力。因此，如何激活并調(diào)控干細(xì)胞，使其有效增殖分化，再生為功能性毛細(xì)胞，是聽覺損傷修復(fù)的關(guān)鍵之處。對(duì)于損傷后內(nèi)耳干細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控解碼和臨床上適用的治療方式的開發(fā)，將極大地推進(jìn)通過(guò)干細(xì)胞修復(fù)聽覺損傷重建聽覺功能從基礎(chǔ)研究走向臨床轉(zhuǎn)化。