氣體二氧化氯對(duì)葡萄殺菌效果及品質(zhì)的影響

江 濤，程傳松，郭鳳婷，劉斌雄，陳登元，黃曉燕，李長(zhǎng)城，方 婷*

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

葡萄因其果粒飽滿、酸甜可口及汁液豐富而深受消費(fèi)者青睞[1]。作為一種具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值的水果，據(jù)統(tǒng)計(jì)，福建福安‘巨峰’葡萄種植面積高達(dá)4.5萬(wàn) 畝，年產(chǎn)量4.2萬(wàn) t，年產(chǎn)值達(dá)到2.9億 元，已然成為南方沿海最大的葡萄生產(chǎn)基地。當(dāng)前，在冷藏條件下，市售葡萄貨架期約為10 d，最佳食用期約為7 d[2]。然而，由于葡萄富含水分和營(yíng)養(yǎng)成分，采后極易遭受微生物侵染，導(dǎo)致果實(shí)腐敗變質(zhì)，甚至造成食源性疾病[3]。此外，葡萄生理代謝旺盛，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗較快，極易造成失水軟化和風(fēng)味劣變，大大降低葡萄品質(zhì)[4]。因此，采用適宜的保鮮技術(shù)處理葡萄以實(shí)現(xiàn)殺菌保鮮效果顯得尤為必要。

目前，殼聚糖、電解水以及ClO2等新型保鮮技術(shù)已被應(yīng)用于果蔬保鮮。殼聚糖可通過(guò)涂膜等方式施加于果蔬表面，但其抗菌效果不佳（無(wú)法均勻處理），導(dǎo)致保鮮效果參差不齊[5]。電解水法處理果蔬雖然有著不錯(cuò)的抗菌效果，但處理時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，且受環(huán)境因素等影響，無(wú)法靈活使用，效率較低[6]。ClO2有著強(qiáng)力的抗菌效力，已作為一種廣泛、高效且安全的殺菌劑應(yīng)用于果蔬清洗、殺菌保鮮等領(lǐng)域[7]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)經(jīng)ClO2氣體處理后，果蔬表面微生物可被滅活，從而減少果蔬微生物負(fù)荷，提升果蔬抗菌與抗病能力，實(shí)現(xiàn)一定的保鮮效果[8]。Sadeghi等[9]開發(fā)了一款自釋放ClO2薄片，并利用其處理番茄果實(shí)，結(jié)果表明該薄片能夠抑制番茄果實(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，且番茄果實(shí)品質(zhì)保持良好。Wang Lin等[10]使用5 mg/L ClO2氣體處理圣女果5 h，實(shí)現(xiàn)了完全滅活沙門氏菌且保持了圣女果感官品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Jin Riya等[11]應(yīng)用10 mg/m3ClO2氣體處理葡萄30 min，灰霉菌、青霉菌及鏈格孢霉減少超過(guò)4（lg（CFU/g）），且能夠抑制VC和還原糖含量消耗。

然而，氣體ClO2難以制備和控制。氣體ClO2通常采用亞氯酸鈉（NaClO2）與酸（鹽酸、硫酸及草酸等）反應(yīng)制備，因此會(huì)選用大型發(fā)生器或發(fā)生裝置，從而降低了處理的靈活性[12]。NaClO2與干冰反應(yīng)產(chǎn)生ClO2是一種間接反應(yīng)。利用過(guò)量干冰揮發(fā)釋放大量CO2，CO2溶于含有NaClO2溶液的吸收墊從而形成H2CO3，H2CO3可電離產(chǎn)生H+，進(jìn)一步與NaClO2反應(yīng)產(chǎn)生ClO2和其他無(wú)毒化合物（Na2CO3、NaCl和H2O）。由于ClO2極易溶于水，起始ClO2溶解于吸收墊中，當(dāng)溶液飽和后，ClO2迅速逸出。本研究利用NaClO2與干冰間接反應(yīng)開發(fā)一種氣體ClO2處理葡萄的方法，旨在評(píng)估氣體ClO2的殺菌效果。同時(shí)，測(cè)定氣體ClO2處理前后葡萄相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)，旨在評(píng)估氣體ClO2對(duì)其品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘巨峰’葡萄購(gòu)于福建省福安市象環(huán)村，挑選無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病害、顏色大小相似及成熟度一致的果實(shí)用于研究。

1%蛋白胨水（peptone water，PW） 北京雙旋微生物制品廠；腦心浸萃液體培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI）、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）廣州環(huán)凱微生物有限公司；利福平（rifampicin，Rif）美國(guó)Sigma公司；NaClO2固體（純度80%） 上海麥克林生化科技有限公司；干冰 福州佰泉生物有限公司；TaKaRa裂解緩沖液（D304） 北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×TsingKE Master Mix（TSE003） 北京奧維森基因科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-92B氣浴振蕩器 上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司；St-16R高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；BagMixer400拍打勻漿器 法國(guó)Interscience公司；MS-600氣體ClO2檢測(cè)儀 深圳逸云天有限公司；Lc-388立式冷藏冰柜 寧波蘇凝制冷電器商行；YP10001B高精度電子天平 上海力辰科技有限公司；CR-20手持色差計(jì) 日本柯尼卡美能達(dá)公司；XTC-18質(zhì)構(gòu)分析儀 上海寶圣實(shí)業(yè)有限公司；HP-TD1糖度計(jì)成都科啟力利農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；LRClO2比色計(jì)廣州環(huán)凱微生物有限公司；3730XL測(cè)序儀、2720 thermal cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Applied Biosystem公司；5810R板式離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；JY04S-3C凝膠成像裝置、JY300C Power Supply電泳儀 濟(jì)南君意生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 優(yōu)勢(shì)菌分離與鑒定

取葡萄，用無(wú)菌手術(shù)刀切取葡萄表皮約10 g，放入無(wú)菌采樣袋，加入20 mL 1% PW，放入拍打器（約100 r/min）均質(zhì)2 min，使葡萄表面微生物盡可能被洗下，將葡萄均質(zhì)液用1% PW進(jìn)行10 倍體積梯度遞增稀釋，參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中的平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定葡萄表面菌落總數(shù)，并取適宜濃度的稀釋液100 μL涂布于TSA平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h。依據(jù)所觀察的菌落形態(tài)、大小及顏色不同挑取典型的菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至得到單一菌落并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量菌體溶于Takara裂解緩沖液中變性后離心取上清液作為模板（模板DNA），反應(yīng)條件為80 ℃、15 min。以通用引物27F和1492R作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行正反測(cè)序，擴(kuò)增引物序列分別為27F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇、1492R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇[10]。經(jīng)PCR儀擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和條件如表1所示。取2 μL擴(kuò)增液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物后，送至北京奧維森基因技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，并用ClustalX1.83和MEGA4軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 PCR擴(kuò)增體系組成及條件Table 1 Composition and conditions of polymerase chain reaction system

1.3.2 誘導(dǎo)與菌懸液制備

每一株優(yōu)勢(shì)菌依次接種并轉(zhuǎn)移到含有25、50、75 mg/L和100 mg/L Rif的BHI后，置于氣浴振蕩器，37 ℃振蕩培養(yǎng)（約100 r/min）過(guò)夜。每株優(yōu)勢(shì)菌成功誘導(dǎo)并耐藥穩(wěn)定后，將細(xì)菌培養(yǎng)物劃線于含有100 mg/L Rif的TSA平板上。兩株耐藥菌定期在TSA/Rif平板上劃線并保存于4 ℃生化培養(yǎng)箱。將每株耐藥菌使用無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落轉(zhuǎn)移至10 mL含有100 mg/L Rif的BHI中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，使其恢復(fù)生長(zhǎng)。之后，菌懸液4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄去上清液。用10 mL 1% PW重新懸浮菌細(xì)胞，再次重復(fù)上述離心過(guò)程，棄去上清液。重復(fù)洗菌步驟后，用5 mL 1% PW重新懸浮菌細(xì)胞，混勻備用。

1.3.3 接種

使用移液槍轉(zhuǎn)移100 μL菌懸液點(diǎn)接于葡萄樣本（40 g）表面，在超凈工作臺(tái)干燥1 h，使菌細(xì)胞附著于樣本表面。葡萄樣本表面接種水平為6.0～7.7（lg（CFU/g））。

1.3.4 氣體ClO2處理

如圖1所示，將NaClO2固體溶于去離子水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%的NaClO2溶液，將其滴加于吸收墊，吸收墊內(nèi)部為吸收棉，外部為黏性表面。將吸收墊粘貼至帶有頂蓋的9 L圓柱形便攜式塑料桶（處理室）內(nèi)部，放入一個(gè)網(wǎng)格支架，葡萄樣本放置在支架上，投入過(guò)量干冰（釋放CO2），頂蓋立即密封。氣體ClO2生成包括兩步反應(yīng)，如式（1）、（2）所示。

圖1 氣體ClO2處理方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of gaseous ClO2 treatment method

處理期間，ClO2濃度由ClO2濃度檢測(cè)儀測(cè)定，單位為μL/L。由于ClO2濃度不穩(wěn)定，引入ClO2累積濃度[13]以評(píng)估氣體ClO2的殺菌效果，ClO2累積濃度由ClO2濃度對(duì)時(shí)間的積分計(jì)算所得，如公式（3）所示。處理溫度（25 ℃）和相對(duì)濕度（60%～70%）由溫濕度調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制并由溫濕度監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)。

式中：c為測(cè)定的ClO2濃度/（μL/L）；t為處理時(shí)間/h。

1.3.5 殺菌實(shí)驗(yàn)

按1.3.4節(jié)所述氣體ClO2處理方法殺滅接種細(xì)菌的葡萄果實(shí)。施加于吸收墊的NaClO2用量分別為112、224、336、448、560 mg和672 mg。干冰投入量為5 g。ClO2氣體處理葡萄樣本3 h后，從桶內(nèi)撤出。使用無(wú)菌手術(shù)刀切割樣本接種表面（約4 g），放入無(wú)菌采樣袋，加入20 mL 1% PW，經(jīng)勻漿器（約100 r/min）拍打2 min，利用已滅菌1% PW進(jìn)行適宜梯度稀釋后涂布于TSA/Rif平板，每個(gè)平板2 個(gè)平行。將涂布好的平板37 ℃培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)以氣體ClO2處理前后葡萄果實(shí)樣本菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值減少量（lg（CFU/g））表征殺菌效果。

1.3.6 貯藏實(shí)驗(yàn)

選取NaClO2用量112 mg與672 mg處理組分別為氣體ClO2低累積濃度處理組與高累積濃度處理組，記為S1與S2。無(wú)處理為對(duì)照組，記為S0。葡萄（共1.2 kg，每組約100 g）經(jīng)ClO2氣體處理3 h后，將S0、S1及S2裝入1 L食品級(jí)塑料保鮮盒，貯藏于4 ℃冷藏冰柜30 d。每5 d測(cè)定每組葡萄樣本的色澤參數(shù)、果實(shí)硬度、質(zhì)量損失率以及可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量。

色澤參數(shù)（L*、a*和b*）參照郝燕等[14]的方法，利用手持色差計(jì)測(cè)定。其中L*值表示亮度，a*、b*值分別表示紅綠度和黃藍(lán)度，a*值大于0為紅色，a*值小于0為綠色；b*值大于0為黃色，b*值小于0為藍(lán)色，其絕對(duì)值越大，顏色越深。

果實(shí)硬度參照Z(yǔ)hou Siyuan等[15]的方法，由質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)定，用直徑為2 mm的探針以1 mm/s的速率穿透葡萄樣品頂部中心10 mm后得到的數(shù)值表示，單位為g。

質(zhì)量損失率參照張昭等[16]的方法。采用直接稱量法，由高精度電子天平稱量。按式（4）計(jì)算質(zhì)量損失率。

TSS含量測(cè)定參照顏廷才等[17]的方法。將葡萄榨汁，搖勻，取部分汁液利用HP-TD1糖度計(jì)測(cè)定TSS含量，單位為°Brix。

ClO2殘留量測(cè)定參照秦惠等[18]的方法。葡萄樣本經(jīng)氣體ClO2處理3 h后，放入一個(gè)無(wú)菌采樣袋，添加200 mL去離子水并反復(fù)用手揉捏振蕩5 min。從采樣袋取10 mL溶液，經(jīng)ClO2比色計(jì)測(cè)定ClO2殘留量，單位為mg/L，經(jīng)公式（5）計(jì)算將單位轉(zhuǎn)換為mg/kg。30 d貯藏期內(nèi)，每5 d測(cè)定每組葡萄樣本的ClO2殘留量。

式中：ρ為測(cè)定的ClO2殘留質(zhì)量濃度/（mg/L）；V為去離子水稀釋體積/L；m為葡萄樣本質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS軟件中Duncan法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；采用Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)菌分析結(jié)果

成功提取2 株優(yōu)勢(shì)菌基因組DNA，將其作為模板，以27F和1492R為引物，進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2所示，2 株優(yōu)勢(shì)菌在1 500 bp處出現(xiàn)單一清晰的熒光條帶且無(wú)拖尾現(xiàn)象，滿足實(shí)驗(yàn)需求，通過(guò)對(duì)目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，以備后續(xù)測(cè)序使用。將所測(cè)定的優(yōu)勢(shì)菌基因序列與GenBank內(nèi)已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，選取BLAST結(jié)果中得分較高菌的16S rDNA序列，使用MEGA5.2.1軟件根據(jù)Neighbor-Joining進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，分離所得到的菌株1與大腸桿菌科的2 個(gè)菌屬埃希氏菌（Escherichia）和志賀氏菌（Shigella）的遺傳距離較近，且與菌株E.coli相似度達(dá)到99.3%。張俊杰等[19]從夏黑葡萄表面也分離出埃希氏菌屬-志賀氏菌屬。本研究分離所得到的菌株2與考克氏菌（Kocuria）的遺傳距離較近，且與菌株Kocuria indica相似度達(dá)到99.3%。張家晨[20]也從葡萄表面分離出考克氏菌。因此，可以確定從葡萄表面分離得到的2 株優(yōu)勢(shì)菌為大腸桿菌和考克氏菌。后續(xù)將分離得到的優(yōu)勢(shì)菌接種到葡萄表面，以測(cè)定所應(yīng)用技術(shù)的殺菌效力。

圖2 葡萄優(yōu)勢(shì)菌16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖譜Fig.2 Electrophoresis of PCR-amplified 16S rRNA sequence from dominant bacteria in grapes

圖3 以16S rDNA基因序列為分子標(biāo)記的2 株優(yōu)勢(shì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of two dominant bacteria based on their 16S rDNA sequences

2.2 氣體ClO2的生成

圖4A為112～672 mg NaClO2與5 g干冰反應(yīng)3 h所測(cè)得的ClO2濃度；圖4B為所計(jì)算的ClO2累積濃度。由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，每個(gè)NaClO2用量梯度所產(chǎn)生ClO2濃度和累積濃度逐步上升。反應(yīng)3 h時(shí)，112、224、336、448、560、672 mg NaClO2與5 g干冰反應(yīng)所測(cè)得的ClO2濃度分別為86、134、172、223、300、389 μL/L，所計(jì)算的ClO2累積濃度分別為131、228、266、378、481、599 μL/（L·h）。顯然，隨著NaClO2用量增加，ClO2濃度與累積濃度呈現(xiàn)線性上升趨勢(shì)（圖5）。之前的研究表明，氣體ClO2處理依賴于大型發(fā)生器或處理器，無(wú)法靈活處理且操作難度較大[21]。相較之下，本研究所用方法適用于各種便攜式處理容器，無(wú)需大型發(fā)生器且干冰與NaClO2易獲取，可隨時(shí)隨地制備氣體ClO2，從而提升了氣體ClO2處理的靈活性。本研究所開發(fā)的氣體ClO2處理方法具有安全、靈活便捷、操作簡(jiǎn)單及成本較低的特點(diǎn)。然而，由于氣體ClO2濃度難以控制且具有漂白性，高濃度氣體ClO2將導(dǎo)致樣本漂白從而影響感官品質(zhì)。為此，通過(guò)投入過(guò)量干冰以促進(jìn)反應(yīng)式（1）產(chǎn)生H+后，應(yīng)控制施加的NaClO2用量以控制ClO2濃度與累積濃度防止樣本漂白。

圖4 NaClO2用量對(duì)ClO2濃度（A）與累積濃度（B）的影響Fig.4 Effect of NaClO2 dosage on concentration (A) and cumulative concentration (B) of ClO2

圖5 ClO2濃度和累積濃度與NaClO2用量的關(guān)系Fig.5 Relationship between ClO2 concentration and accumulative concentration with the amount of NaClO2

2.3 氣體ClO2的殺菌效果

由圖6可知，隨著NaClO2用量梯度上升（112～672 mg），ClO2累積濃度增加（131～599 μL/（L·h）），兩株優(yōu)勢(shì)菌對(duì)數(shù)值減少量總體呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05）。當(dāng)氣體ClO2累積濃度從131 μL/（L·h）提升至599 μL/（L·h）時(shí)，葡萄表皮上Escherichia菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值減少量從1.6（lg（CFU/g））提升至3.5（lg（CFU/g）），Kocuria菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值減少量從1.0（lg（CFU/g））提升至4.5（lg（CFU/g））。同時(shí)，當(dāng)ClO2累積濃度從378 μL/（L·h）提升至599 μL/（L·h）時(shí)，Kocuria菌落總數(shù)對(duì)數(shù)減少量明顯高于Escherichia，表明Kocuria更易受到ClO2氣體的影響而失活。Chai等[13]利用NaClO2與HCl或FeCl3反應(yīng)產(chǎn)生的氣體ClO2處理接種于番茄的沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌及大腸桿菌。結(jié)果表明，大腸桿菌比沙門氏菌與單核細(xì)胞增生李斯特菌更易受到ClO2氣體的影響而失活，這可能歸因于接種細(xì)菌的不同生理狀態(tài)、活性以及環(huán)境適應(yīng)性等。Zhou Siyuan等[22]利用番茄呼吸釋放的CO2和H2O與NaClO2反應(yīng)產(chǎn)生ClO2氣體處理接種沙門氏菌的番茄果實(shí)24 h，實(shí)現(xiàn)了每果約減少5（lg（CFU））沙門氏菌，相較之下，本研究所應(yīng)用的氣體ClO2處理方法在較短時(shí)間（3 h）內(nèi)即可有效滅活果實(shí)表面的細(xì)菌，更適合處理果蔬。研究表明，氣體ClO2具有極強(qiáng)的氧化性與穿透性，可以穿透微生物細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜并氧化氨基酸，使微生物失活[23]。因此，利用該氣體ClO2處理方法，設(shè)置適宜的處理時(shí)間和濃度，可有效滅活葡萄表面微生物，減少微生物負(fù)荷，防止果實(shí)腐敗。

圖6 氣體ClO2對(duì)葡萄優(yōu)勢(shì)菌的殺菌效果Fig.6 Effect of ClO2 gas on inactivation of dominant bacteria from grapes

2.4 氣體ClO2對(duì)葡萄品質(zhì)的影響

果蔬色澤是最直接的感官評(píng)價(jià)指標(biāo)。由表2可知，氣體ClO2處理葡萄3 h后，S0、S1及S2組a*、b*與L*值并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但S1與S2組L*值較S0組略有增加，這可能歸因于ClO2具有漂白性?？傮w而言，氣體ClO2對(duì)葡萄色澤并無(wú)影響或影響較小。Mahmoud等[24]應(yīng)用一種氣體ClO2發(fā)生器制備0.5～5.0 mg/L氣體ClO2以處理生菜，導(dǎo)致生菜L*值隨ClO2濃度增加而增加，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。此外，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，葡萄果實(shí)a*與L*值呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，這可能是由于葡萄褐變所致[25]。

表2 氣體ClO2處理下葡萄的色澤參數(shù)隨貯藏時(shí)間的變化Table 2 Changes in color parameters of grapes treated with ClO2 gas during storage

在葡萄貯藏過(guò)程中，由于果實(shí)細(xì)胞壁降解與結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致果實(shí)硬度下降，出現(xiàn)軟化現(xiàn)象，降低果實(shí)貯藏品質(zhì)。由圖7A可知，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，葡萄硬度逐漸降低，S2組降低最為緩慢，直至30 d貯藏結(jié)束，S0、S1及S2組果實(shí)硬度分別為141、191 g及298 g。貯藏至15 d后，S2組果實(shí)硬度明顯高于S0與S1組。池致超[26]以‘巨峰’葡萄為實(shí)驗(yàn)材料，評(píng)估氣體ClO2的保鮮效果，其中高濃度（30 mg/m3）氣體ClO2作用葡萄30 min抑制了葡萄硬度降低，本研究結(jié)果與之相似。ClO2氣體可能通過(guò)抑制淀粉水解酶和果膠降解酶活性抑制細(xì)胞壁降解與結(jié)構(gòu)變化，從而抑制果實(shí)軟化[27]。此外，低累積濃度ClO2處理葡萄3 h對(duì)硬度影響不顯著，表明抑制果實(shí)軟化可能取決于氣體ClO2濃度與作用時(shí)間。

由于葡萄貯藏時(shí)呼吸作用和蒸騰作用使水分喪失，可能導(dǎo)致果實(shí)表皮皺縮，影響果實(shí)感官品質(zhì)[28]。由圖7B可知，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，葡萄質(zhì)量損失率逐漸上升，但S2組上升最為緩慢，直至30 d貯藏結(jié)束，S0、S1及S2組果實(shí)質(zhì)量損失率分別為5.15%、5.05%及3.96%。當(dāng)貯藏25 d后，S2組果實(shí)質(zhì)量損失率明顯低于S0與S1組。研究表明，氣體ClO2可抑制乙烯生成，促進(jìn)氣孔關(guān)閉，降低呼吸作用和蒸騰作用，防止水分的喪失，從而保持果實(shí)質(zhì)量[29]。顯然，本研究中經(jīng)高濃度氣體ClO2處理葡萄，其質(zhì)量損失率明顯降低，品質(zhì)趨于良好。

TSS含量是評(píng)價(jià)果蔬新鮮度及風(fēng)味的重要指標(biāo)。由圖7C可知，貯藏期間，葡萄TSS含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。貯藏至第5天，S0、S1及S2組TSS含量分別為16.6、15.7 °Brix及15.8 °Brix，比貯藏前略有增加，這可能是由于果實(shí)采收較早，在貯藏過(guò)程中其內(nèi)部淀粉等有機(jī)物質(zhì)仍可轉(zhuǎn)化為還原糖等可溶性物質(zhì)，而后由于自身呼吸作用使果實(shí)內(nèi)部可溶性物質(zhì)消耗。此外，第5天時(shí)S0組TSS含量明顯高于S1與S2組，表明氣體ClO2可能抑制葡萄果實(shí)內(nèi)部有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化。貯藏20 d后，S2組TSS含量明顯高于S0與S1組，這可能是由于氣體ClO2抑制果實(shí)乙烯釋放和呼吸作用，從而抑制可溶性物質(zhì)的消耗。晉日亞[30]使用實(shí)驗(yàn)室裝置產(chǎn)生高純度ClO2氣體處理葡萄，結(jié)果表明，大于30 mL/m3ClO2氣體處理葡萄后，貯藏期間TSS含量得以有效保持，本研究結(jié)果與之相似。此外，許萍等[31]開發(fā)一款作用于葡萄的固體ClO2保鮮劑，其能顯著抑制TSS含量的降低，有助于保持葡萄品質(zhì)。

圖7 氣體ClO2處理葡萄貯藏期內(nèi)品質(zhì)的影響Fig.7 Effect of ClO2 gas on the quality of grapes during storage

2.5 ClO2殘留量

ClO2氣體處理水果后其表面易產(chǎn)生ClO2殘留，而高濃度ClO2殘留會(huì)危害人體健康[32]。由圖8可知，氣體ClO2處理葡萄3 h后，S1和S2組初始?xì)埩舴謩e為0.19 mg/kg和0.31 mg/kg，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)殘留量逐漸降低。Trinetta等[33]應(yīng)用0.1～0.5 mg/L ClO2氣體處理不同水果，并評(píng)估不同水果表面ClO2殘留情況。結(jié)果表明，不同水果表面ClO2殘留量（番茄（0.09 mg/kg）、柑橘（0.08 mg/kg）及蘋果（0.28 mg/kg））普遍低于0.5 mg/kg，本研究結(jié)果與其相似。參照GB 5009.244—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二氧化氯的測(cè)定》要求ClO2處理水果和蔬菜，其表面殘留量不得高于2 mg/kg，顯然本研究結(jié)果遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，進(jìn)一步提升了該方法商品化應(yīng)用潛質(zhì)。在30 d貯藏期內(nèi)，S2組殘留量明顯高于S1組，表明ClO2累積濃度增加，果實(shí)表面殘留也將增加。此外，ClO2殘留隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)略有降低，這也與Trinetta等[33]的研究結(jié)果相似。

圖8 葡萄貯藏期ClO2殘留量Fig.8 Residual ClO2 on grapes during storage

3 結(jié) 論

本研究證明利用NaClO2與干冰間接反應(yīng)制備ClO2氣體的可行性，所開發(fā)的氣體ClO2處理方法對(duì)葡萄具有良好的殺菌效果且有助于提升葡萄品質(zhì)。當(dāng)ClO2累積濃度從131 μL/（L·h）提升至599 μL/（L·h），Escherichia菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值減少量從1.6（lg（CFU/g））升至3.5（lg（CFU/g）），Kocuria菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值減少量從1.0（lg（CFU/g））升至4.5（lg（CFU/g））。此外，經(jīng)氣體ClO2處理葡萄后，其色澤并無(wú)明顯變化，貯藏期內(nèi)果實(shí)軟化、質(zhì)量損失及TSS含量損失得以有效抑制，且表面ClO2殘留水平較低。未來(lái)的研究可進(jìn)一步調(diào)整處理溫度，在冷藏期間緩慢釋放ClO2氣體處理果蔬或者擴(kuò)大處理容器體積和反應(yīng)物用量，批量處理果蔬。此外，可進(jìn)一步開展感官評(píng)定，并增加其他品質(zhì)指標(biāo)如可滴定酸、抗壞血酸含量等的測(cè)定，以提升該處理方法的應(yīng)用性。