紅花除蟲菊和甘野菊的花粉采集與貯藏

雒新艷，劉 英，王利紅，張俊麗，李芳，王 輝，盧 潔

（1.濰坊職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261000；2.山東省林木種苗和花卉站，濟(jì)南 250014）

紅花除蟲菊［Pyrethrum coccineum（Willd.）Worosch.］和甘野菊［Dendranthema lavandulifoliumvar.seticuspe（Maxim.）Shih］是盆栽菊的近緣種質(zhì)，抗逆性良好，可用于盆菊栽培品種的改良，但兩者的自然花期均早于盆菊，若要開(kāi)展雜交工作，可以選擇將野生近緣種質(zhì)的花粉貯藏或者通過(guò)遮光處理把盆菊的花期提前，2 種方法均可實(shí)現(xiàn)雜交的目標(biāo)。研究表明，經(jīng)過(guò)花期調(diào)控的植物，因其花期和果期處于不適宜的季節(jié)，所產(chǎn)生的花粉通?；温矢?，萌發(fā)率大幅下降，受精后的胚在發(fā)育中也常會(huì)出現(xiàn)敗育現(xiàn)象［1］。因此，花期不遇的最佳解決方法是花粉貯藏，但是不同植物花序類型不同，開(kāi)花進(jìn)程和持續(xù)時(shí)間不同，合適的采集時(shí)機(jī)也不同。不同植物花粉的結(jié)構(gòu)和生理需求不同，適宜的儲(chǔ)存條件也不相同［2］。

本研究通過(guò)檢測(cè)不同開(kāi)花天數(shù)和采集時(shí)間的花粉萌發(fā)率，確定2 個(gè)野生菊花種質(zhì)適宜的花粉采集時(shí)機(jī)；通過(guò)檢測(cè)不同貯藏條件和時(shí)間的花粉萌發(fā)率，確定二者花粉合適的貯藏條件與時(shí)間，為盆菊野生種質(zhì)參與遠(yuǎn)緣雜交奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2 個(gè)二倍體野生近緣種質(zhì)：紅花除蟲菊（2n=2x=18）和甘野菊（2n=2x=18）。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集 在花序總苞片打開(kāi)之前，先對(duì)花序進(jìn)行套袋，主要是預(yù)防昆蟲串粉，與其他花粉交叉混染。紅花除蟲菊和甘野菊的管狀花自外向內(nèi)逐步開(kāi)放，從最外層出現(xiàn)花粉到全部筒狀花凋萎，大約需要7 d。在此期間，每隔1 d 采集1 次當(dāng)天的新鮮花粉，經(jīng)過(guò)萌發(fā)率檢測(cè)確定最佳采粉日。之后，在最佳采粉日當(dāng)天7：00 到17：00，每2 h 取1 次花粉，用毛筆輕輕將花粉刷入硫酸紙袋內(nèi)，為避免不同單株的花粉差異，將同一種植物不同單株的花粉混合均勻。

1.2.2 花粉貯藏 研究表明，低溫和低含水量可以降低花粉細(xì)胞的代謝水平和水分子的活動(dòng)能力［3］，且貯藏時(shí)間也是影響花粉活性的重要因素，因此對(duì)所有的花粉都進(jìn)行24 h 的干燥處理，然后對(duì)比溫度和時(shí)間對(duì)花粉貯藏效果的影響。設(shè)置以下貯藏環(huán)境：A，室溫硫酸紙袋保存；B，室溫離心管密封；C，4 ℃硫酸紙袋保存；D，4 ℃離心管密封；E，-20 ℃硫酸紙袋保存；F，-20 ℃離心管密封，分別對(duì)比不同環(huán)境內(nèi)花粉貯藏30、60 d 和90 d 后的萌發(fā)率情況。

1.2.3 花粉萌發(fā)率測(cè)定 離體萌發(fā)是檢測(cè)花粉萌發(fā)率有效的方法［4、5］，采用改良ME3培養(yǎng)基+250 g/L PEG 1 500 溶液+150 g/L 蔗糖。ME3培養(yǎng)基［6］的成分為MgSO4·7H2O 370 mg/L、KNO3950 mg/L、KH2PO485 mg/L、CaCl2·2H2O 880 mg/L、NH4NO3412.5 mg/L、KCl 175 mg/L、H3BO350 mg/L、Na2EDTA 7.45 mg/L、FeSO4·7H2O 0.025 mg/L、KI 0.83 mg/L、NaMoO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、VitB11.0 mg/L、VitB61.0 mg/L。

用膠頭滴管吸取加熱融化后的培養(yǎng)基，快而穩(wěn)地滴入雙凹載玻片的凹槽內(nèi)，然后使用毛筆將花粉均勻地播在培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱內(nèi)避光保濕培養(yǎng)4 h（設(shè)置溫度為25 ℃）。取出載玻片后，在電子顯微鏡下統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)情況，以花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑作為花粉萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)種質(zhì)材料隨機(jī)選擇3個(gè)頭狀花序的花粉，每個(gè)花序取5 個(gè)視野，共15 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的花粉數(shù)除以總花粉數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel v16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花粉出現(xiàn)時(shí)間的花粉萌發(fā)率檢測(cè)結(jié)果

當(dāng)紅花除蟲菊和甘野菊中心的筒狀花開(kāi)始出現(xiàn)花粉時(shí)，每隔1 d 采集花粉，其萌發(fā)率見(jiàn)圖1。由圖1可知，在7 d 花粉期內(nèi)，2 個(gè)野生菊花種質(zhì)的花粉萌發(fā)率大體呈先升后降的變化趨勢(shì)；甘野菊的花粉萌發(fā)率略高于紅花除蟲菊。

圖1 不同花粉出現(xiàn)時(shí)間對(duì)紅花除蟲菊和甘野菊花粉萌發(fā)率的影響

花粉期第一天，2 個(gè)野生菊花種質(zhì)外層管狀花的雄蕊花藥開(kāi)裂，出現(xiàn)少量花粉，其萌發(fā)率較低；第三天，兩者中層大量管狀花的花藥開(kāi)裂，產(chǎn)生花粉，其萌發(fā)率也迅速升至最高值，甘野菊的最高花粉萌發(fā)率為68.2%，紅花除蟲菊的最高花粉萌發(fā)率為65.2%；花粉期第五天，兩者的花粉萌發(fā)率都開(kāi)始下降；到第七天，紅花除蟲菊和甘野菊花粉的萌發(fā)率降至最低，分別為25.48%和35.16%。

2.2 不同采集時(shí)間的花粉萌發(fā)率檢測(cè)結(jié)果

由圖2 可知，紅花除蟲菊和甘野菊花粉萌發(fā)率1 d 內(nèi)的變化情況，兩者都是單峰曲線，表明不同時(shí)刻的花粉萌發(fā)率差異較大。紅花除蟲菊和甘野菊的花粉萌發(fā)率最高值都出現(xiàn)在11：00，分別達(dá)到69.2%和72.14%；9：00 時(shí)，兩者的花粉萌發(fā)率均為40%左右；11：00 之后，兩者的萌發(fā)率都逐漸下降，在13：00時(shí)，紅花除蟲菊的花粉萌發(fā)率降至56.40%，降幅大于甘野菊；到15：00 時(shí)，兩者的花粉萌發(fā)率進(jìn)一步降低，紅花除蟲菊的花粉萌發(fā)率略高于甘野菊；到17：00 時(shí)，2 個(gè)野生菊花種質(zhì)的花粉萌發(fā)率降到最低，分別為6.79%和12.09%，已不適合用于授粉。

圖2 不同采粉時(shí)間對(duì)紅花除蟲菊和甘野菊花粉萌發(fā)率的影響

2.3 不同貯藏條件下花粉萌發(fā)率檢測(cè)結(jié)果

在6 個(gè)貯藏處理中分別保存30、60、90 d 后，檢測(cè)2 個(gè)野生菊花種質(zhì)的花粉萌發(fā)率，具體結(jié)果見(jiàn)表1。甘野菊新鮮花粉的萌發(fā)率（58.94%）高于紅花除蟲菊（55.78%），所有貯藏方式貯藏后的花粉萌發(fā)率普遍低于紅花除蟲菊，表明甘野菊花粉的貯藏效果不如紅花除蟲菊。

由表1 可知，2 個(gè)野生菊花種質(zhì)花粉在-20 ℃貯藏條件下效果最好，萌發(fā)率均高于室溫和4 ℃貯藏的萌發(fā)率，30 d 后的萌發(fā)率仍超過(guò)新鮮花粉的50%，60 d 后的萌發(fā)率仍超過(guò)新鮮花粉的20%，90 d 后的萌發(fā)率依舊高于新鮮花粉的10%，滿足授粉的基本需求，可以應(yīng)用于雜交授粉。其中，離心管密封保存的萌發(fā)率略高于硫酸紙袋保存的萌發(fā)率，但兩者相差不大，這可能是因?yàn)樵诘蜏貤l件下，花粉呼吸微弱，氧氣的需求較低。

表1 不同貯藏條件下紅花除蟲菊和甘野菊的花粉萌發(fā)率

在室溫和4 ℃貯藏條件下，硫酸紙袋保存的效果大部分好于離心管密封，可能是由于花粉呼吸較為旺盛，維持正常生命活動(dòng)需要氧氣的參與。

3 討論

3.1 花粉采集時(shí)機(jī)的篩選

通過(guò)檢測(cè)不同花粉期和采集時(shí)刻的花粉萌發(fā)率發(fā)現(xiàn)，當(dāng)紅花除蟲菊和甘野菊中心管狀花開(kāi)始出現(xiàn)花粉后的第三天，所采集花粉萌發(fā)率最高；1 d 中，11：00所采集花粉的萌發(fā)率最高。因此，于晴天11：00時(shí)，采自單個(gè)花序花粉期第三天的花粉是最理想的授粉材料。實(shí)際工作中，為了便于人員和工作安排，花粉采集可在10：00～13：00 進(jìn)行，所得花粉的萌發(fā)率都較高。

3.2 花粉貯藏條件

前人研究表明，低溫和低含水量可以降低花粉細(xì)胞的代謝水平和水分子的活動(dòng)能力［7］，且貯藏時(shí)間也是影響花粉活性的重要因素。菊科植物的花粉屬于三核型花粉，其外壁較薄，對(duì)不良條件抵抗力較差，容易失活［8、9］。為解決花期不遇問(wèn)題，本研究對(duì)野生種的花粉貯藏條件進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)溫度是花粉貯藏的關(guān)鍵因素，-20 ℃是長(zhǎng)期保存的最佳貯藏溫度，90 d 后花粉的萌發(fā)率仍高于10%，基本可以用于雜交；若短期貯藏（1 個(gè)月內(nèi)），可選擇4 ℃硫酸紙袋保存或離心管密封，其中，4 ℃硫酸紙袋保存的效果較好。

本試驗(yàn)未使用新鮮花粉作為試驗(yàn)材料，主要是因?yàn)楹扛叩幕ǚ墼谑覝睾? ℃環(huán)境內(nèi)呼吸和消耗快，容易較快地失去活力；而在-20 ℃環(huán)境中，會(huì)導(dǎo)致組織結(jié)冰，使結(jié)構(gòu)遭到破壞［10］。