張振鋒

摘要：丁型肝炎是由丁型肝炎病毒（HDV）與乙型肝炎病毒（HBV）合并感染或者HDV重疊感染HBV攜帶者引起的一種嚴重病毒性肝炎。由于長期重視不足，丁型肝炎的診斷目前還存在巨大空白。近年來，隨著相關研究的不斷深入，科研和醫(yī)療行業(yè)逐漸意識到丁型肝炎的危害。同時相關藥物研發(fā)的重大進展也為丁型肝炎的治療甚至治愈帶來了新的機遇。而這些進展將大大增加對丁型肝炎診斷的需求?？?HD抗體是丁型肝炎診斷的關鍵指標。本文就目前丁型肝炎抗體包括抗-HD總抗體、IgG和IgM的檢測方法進行了總結和比較分析，并對相關的重要問題進行了討論，以期加深對丁型肝炎抗體檢測現(xiàn)狀的了解，并為開發(fā)更好的丁型肝炎診斷工具提供參考。

關鍵詞：δ肝炎病毒; 丁型肝炎; 肝炎抗體; 診斷

基金項目：南方科技大學科研啟動經(jīng)費（Y011006113）

Detection methods for hepatitis D antibodies： A comparative analysis

ZHANG Zhenfeng. （School of Public Health and Emergency Management， Southern University of Science and Technology， Shenzhen， Guangdong 518055， China）

Corresponding author：

ZHANG Zhenfeng， zhangzf@sustech.edu.cn （ORCID：0000-0002-0013-3685）

Abstract：

Hepatitis D is a severe form of viral hepatitis caused by co-infection with hepatitis D virus （HDV） and hepatitis B virus （HBV） or superinfection of HDV in HBV carriers. There is still a huge gap in the diagnosis of hepatitis D due to insufficient emphasis on this disease for a long time. With the advances in related studies in recent years， the academia and the medical industry have gradually realized the harm of hepatitis D， and meanwhile， breakthroughs in drug development have also brought new opportunities for the treatment or even cure of hepatitis D. These advances greatly increase the demand for the diagnosis of hepatitis D. HDV antibodies are the key markers for the diagnosis of hepatitis D. This article summarizes and compares the detection methods for HDV antibodies including total HDV antibodies， IgG， and IgM and discusses related important issues， so as to understand the current status of the detection of HDV antibodies and provide a reference for developing better diagnostic tools for hepatitis D.

Key words：

Hepatitis Delta Virus; Hepatitis D; Hepatitis Antibodies; Diagnosis

Research funding：

Southern University of Science and Technology Scientific Research Startup Fund （Y011006113）

丁型肝炎是由丁型肝炎病毒（HDV）與乙型肝炎病毒（HBV）合并感染（兩種病毒同時感染人體）或者HDV感染已經(jīng)攜帶HBV的患者引起的病毒性肝臟疾病。相對于HBV單獨感染，HDV和HBV共同感染會顯著加快疾病向肝硬化和肝癌等重癥發(fā)展的進程，因此丁型肝炎被認為是最嚴重的病毒性肝炎［1］。盡管危害很大，但丁型肝炎的診斷相對于乙型肝炎而言進展非常緩慢。由于大量檢測空白的存在和感染呈現(xiàn)顯著的地域差異，關于HDV感染的總感染人數(shù)存在爭議［2］，部分Meta分析［3-5］估計全球有1 200萬～7 200萬HDV感染者。我國丁型肝炎診斷的數(shù)據(jù)也很少。近年來隨著相關研究的進展包括藥物研發(fā)的突破等，丁型肝炎的危害逐漸受到關注，為丁型肝炎的治愈帶來了曙光［6］。亞太肝病學會［7］和歐洲肝病學會［8］均建議對所有HBsAg陽性的個體進行丁型肝炎檢測，然而目前只有極少數(shù)人接受了相應的檢測，診斷缺口巨大，問題亟待解決。丁型肝炎的篩查通常首先檢測血清中的抗-HD抗體包括IgG和IgM，然后對陽性者再進行HDV RNA的驗證。除了篩查之外，抗-HD抗體尤其是IgM也是丁型肝炎疾病狀態(tài)的一項重要指標。因此有必要對抗-HD抗體檢測的方法進行認真分析。

1 HDV抗原的特征和抗體的診斷意義

HDV的基因組為單鏈環(huán)形反義RNA，僅約1 680個核苷酸（圖１）。HDV的基因組僅有一個開放閱讀框編碼195個氨基酸的丁型肝炎小抗原（small hepatitis delta antigen， S-HDAg）。在病毒復制過程中，部分病毒基因組的開放閱讀框的終止密碼子UAG可以被人體的RNA編輯酶ADAR1（adenosine deaminase acting on RNA 1）修飾變成色氨酸密碼子UGG，進而導致表達的蛋白延長19個氨基酸，該蛋白被稱為丁型肝炎大抗原（large hepatitis delta antigen， L-HDAg）。S-HDAg是病毒基因組復制所必需的，而L-HDAg通過與HBV的囊膜蛋白相互作用介導病毒粒子的組裝和釋放［9-10］。目前發(fā)現(xiàn)的HDV共分為8個基因型，其中 Ⅰ 型HDV（HDV1）為全球分布，其他基因型都呈現(xiàn)明顯的地域分布，我國主要流行的基因型為HDV1［11-12］。

丁型肝炎可大致分為急性感染期和慢性感染期兩個階段。HDV和HBV合并感染情況下，兩種病毒在急性感染之后通常均被清除，只有少數(shù)（＜5%）會發(fā)展成為慢性感染。然而，HDV重疊感染HBV陽性患者發(fā)展成為慢性感染的概率很高（＞90%）［13-14］。人體被HDV感染后主要產(chǎn)生抗-HD IgM和抗-HD IgG兩類抗體。同時，由于HBV復制產(chǎn)生了表面抗原、核心抗原等HBV抗原，人體也可能相應地產(chǎn)生對應的各種HBV抗體。感染各個階段人體血液中各種HDV和HBV抗體的狀態(tài)匯總于表1。HDV進入人體后通常有數(shù)周甚至更長的潛伏期，然后開始大量復制?？?HD IgM大約在HDV大量復制2周后出現(xiàn)并快速升高。在急性感染期，患者血液中抗-HD IgM含量較高；急性感染后期，隨著HDV被清除或轉為慢性感染，抗-HD IgM水平通常會快速下降，因此抗-HD IgM常被作為急性感染的指標。盡管如此，抗-HD IgM在部分慢性感染者中也能檢測到，通常與病毒活躍程度和肝損傷呈正相關［15-17］。因此，判定HDV急性感染不能僅依賴于抗-HD IgM，還應該結合其他指標，如抗-HBc IgM、抗-HD IgG、肝損傷指標丙氨酸氨基轉移酶等?？?HD IgG出現(xiàn)晚于抗-HD IgM數(shù)周，在血液中的濃度可以達到很高水平，而且持續(xù)時間很長。因此，抗-HD IgG常被作為HDV感染已經(jīng)度過急性期的指標。然而，抗-HD IgG在病毒被清除之后仍能維持很長時間，故僅抗-HD IgG陽性無法確定是現(xiàn)癥感染還是既往感染已經(jīng)清除病毒，需要利用HDV RNA以明確。丁型肝炎的初步篩查需要同時檢測抗-HD IgM和抗-HD IgG，因此利用抗-HD總抗體最為合適。但在臨床中也常分別檢測抗-HD IgM和抗-HD IgG用于丁型肝炎的篩查。

2 HDV抗體檢測的主要方法

到目前為止，國內(nèi)外已經(jīng)有數(shù)家企業(yè)和研發(fā)機構開發(fā)出了HDV抗體檢測產(chǎn)品，其中大部分為酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒，此外還包括早期產(chǎn)品放射免疫分析（radioimmunoassay， RIA）試劑、新一代產(chǎn)品化學發(fā)光免疫分析（chemiluminescent immunoassay， CLIA）試劑盒，以及尚未上市的膠體金檢測試紙條和免疫熒光微陣列等。HDV抗體檢測的主要方法匯總于表2，具體如下。

2.1 ELISA檢測法

ELISA包括免疫分析系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)。免疫分析系統(tǒng)是將酶（如辣根過氧化物酶）作為標志物，直接標記在抗原或抗體上，經(jīng)過抗原與抗體反應形成抗原-抗體復合物；信號檢測系統(tǒng)是在免疫反應結束后，加入底物（如3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺）進行酶促反應產(chǎn)生可見的顏色變化。通過酶標儀測定樣品與對照的顏色差異，并根據(jù)測定結果進行定性判斷或結合標準品計算待檢測物的濃度。ELISA是目前最常用的抗體檢測方法。根據(jù)抗體類型和實驗目的的不同，ELISA檢測抗體的方法又被分為間接法、競爭法、捕獲法等多種類型。在實驗操作上主要包括酶標板包被、樣品孵育、酶標記、加入底物顯色以及信號檢測等步驟。

2.1.1 抗-HD IgM ELISA檢測 目前商品化檢測抗-HD IgM的ELISA試劑盒主要采用間接法和捕獲法兩種。間接法ELISA采用HDV抗原包被酶標板，然后與樣品孵育捕獲抗-HD IgM，最后用酶偶聯(lián)的抗人IgM抗體進行信號檢測。但該方法的樣品中可能含有大量的抗-HD IgG也能夠與HDV抗原結合，此競爭性結合可能會導致抗-HD IgM的檢測結果不準確。因此，采用間接法ELISA檢測抗-HD IgM時通常需要對樣本進行稀釋或者采用吸附法預先去除IgG。與間接法ELISA不同，捕獲法ELISA用抗人IgM μ鏈抗體包被酶標板，首先捕獲血清中的所有IgM，然后再先后加入HDV抗原和酶偶聯(lián)的抗HDV特異性抗體用于信號檢測。捕獲法ELISA排除了抗-HD IgG的干擾，結果更加可靠。因此，捕獲法ELISA是目前檢測抗-HD IgM最常用的方法。

2.1.2 抗-HD IgG檢測 抗-HD IgG的ELISA檢測試劑盒是目前市場上供應最多的丁型肝炎抗體檢測產(chǎn)品。其檢測方法基本上全部為間接法ELISA，主要包括：采用HDV抗原包被酶標板，然后與樣品孵育捕獲抗-HD IgG，最后用酶偶聯(lián)的抗人IgG抗體進行信號檢測。雖然該方法理論上也存在抗-HD IgM競爭性與HDV抗原結合的問題，但通常情況下抗-HD IgG陽性的血清中，該抗體的濃度遠高于抗-HD IgM。因此抗-HD IgM的干擾造成的影響不大。

2.1.3 抗-HD總抗體檢測 相對于抗-HD IgM和抗-HD IgG而言，抗-HD總抗體更加適合于丁型肝炎的初步篩查。盡管如此，目前市場上抗-HD總抗體檢測試劑盒很少?？?HD總抗體的ELISA檢測方法主要分為競爭法和雙抗原夾心法兩種。競爭法ELISA的主要步驟包括：采用HDV抗原包被酶標板，然后與樣品孵育捕獲抗-HD IgM和抗-HD IgG，最后加入酶偶聯(lián)的抗HDV多克隆抗體，結合尚未被樣品中的抗體占據(jù)的HDV抗原并進行信號檢測。雙抗原夾心法ELISA也采用HDV抗原包被酶標板并與樣品孵育捕獲抗-HD總抗體，最后用酶偶聯(lián)的HDV抗原進行標記和信號檢測。相對于上述抗-HD IgM和抗-HD IgG的ELISA檢測，抗-HD總抗體的兩種檢測方法均較為復雜，這可能是目前市場上抗-HD總抗體檢測試劑盒較少的一個原因。

2.2 其他檢測方法

2.2.1 RIA檢測法 與ELISA類似， RIA也包括免疫分析系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)，兩者的主要區(qū)別在于RIA是以放射性同位素為標志物，以同位素的放射性強度作為檢測信號。RIA檢測法建立于1960年，其檢測靈敏度和準確性都很高。RIA曾是檢測HDV抗體的主要方法，這些方法大多數(shù)建立于1980—1990年［18-19］，例如Abbott公司的丁型肝炎抗體檢測試劑盒［20］。但由于同位素對人體危害較大，檢測過程復雜耗時，后來逐漸被ELISA替代［21-23］?；诠P者的檢索，目前市場上已經(jīng)沒有商品化的HDV抗體RIA檢測試劑盒供應。然而這不排除仍有少數(shù)檢測機構和實驗室在使用自制的RIA檢測試劑進行HDV抗體檢測。

2.2.2 CLIA檢測法 CLIA同樣也包括免疫分析和信號檢測兩個系統(tǒng)。其免疫分析系統(tǒng)與ELISA和RIA類似，但CLIA的信號檢測系統(tǒng)中采用的是魯米諾等發(fā)光底物。底物經(jīng)氧化或酶促反應后會發(fā)射光子，發(fā)光強度利用發(fā)光信號測量儀器進行檢測。根據(jù)化學發(fā)光標志物與發(fā)光強度的關系，進行定性或定量分析。由于CLIA的檢測靈敏度遠高于ELISA，很多ELISA產(chǎn)品正在被CLIA產(chǎn)品替代，在HDV抗體檢測領域亦是如此。上述HDV抗體ELISA檢測試劑盒理論上均可開發(fā)出對應的CLIA檢測試劑盒。但是，由于化學發(fā)光診斷技術起步較晚，而且產(chǎn)品一般是試劑和儀器一體化的封閉系統(tǒng)，因此技術壁壘較高，產(chǎn)品的更新?lián)Q代無法在短時間內(nèi)實現(xiàn)。基于筆者所掌握的信息，目前市場上只有Diasorin和Dia.Pro Diagnostic Bioprobes Srl兩家企業(yè)提供HDV抗體CLIA檢測產(chǎn)品［24］，而且均為基于競爭法的總抗體檢測試劑盒。兩家均為長期從事丁型肝炎檢測試劑生產(chǎn)和研發(fā)的意大利企業(yè)。意大利在丁型肝炎診斷領域的領先發(fā)展可能與該國的HDV感染率較高（相對于其他歐洲發(fā)達國家）以及HDV的發(fā)現(xiàn)者意大利科學家Rizzetto博士的推動有關。Diasorin公司在推出抗-HD總抗體CLIA檢測產(chǎn)品之后，已經(jīng)停售相應的ELISA產(chǎn)品。而Dia.Pro Diagnostic Bioprobes Srl公司則目前還同時提供ELISA和CLIA產(chǎn)品。

2.2.3 膠體金試紙條 ELISA和CLIA利用酶標板等多孔板可以同時檢測多個樣本，但是這兩種方法對檢測設備有較高要求，需要在實驗室中完成。試紙條檢測則不需要大型儀器，并且檢測時間短，非常適合在偏遠和不發(fā)達的地區(qū)進行現(xiàn)場檢測或者在樣品數(shù)量比較少的情況下進行快速檢測。德國海德堡大學Urban教授團隊在2021年首次報道了HDV抗體檢測試紙條［25］。該試紙條的設計采用的是經(jīng)典的膠體金標記方法：首先將純化的重組HDV抗原（檢測條帶）和抗-羊抗體（對照條帶）分別噴涂固定在膜上，在膜的前方放置吸附有膠體金標記的羊抗人IgG的濾紙條。加入樣本（稀釋的血清）之后，樣本通過膠體金濾紙與金標記抗體一起流向檢測膜。如果樣品中含有HDV特異性抗體，那么抗體與金標記二抗將在HDV抗原處富集形成可見的條帶，多余的金標記二抗進一步流經(jīng)抗-羊抗體時被捕獲形成對照條帶。以ELISA檢測結果作為對照，該檢測試紙條可以檢測出94.6%陽性樣本，具有相當高的陽性樣本檢出率。而且，試紙條未檢測出的假陰性樣本其ELISA檢測信號也很弱，這些樣本很可能來自已經(jīng)清除HDV的患者。Urban教授團隊與?？∑娼淌趫F隊合作，利用該試紙條對我國和德國共5千多份樣本進行了檢測，發(fā)現(xiàn)丁型肝炎存在顯著的熱點分布［26］。目前該試紙條尚未上市。2.2.4 微陣列定量檢測 微陣列檢測方法具有所需實驗材料少、靈敏，以及易于實現(xiàn)高通量檢測等優(yōu)點。在HDV抗體檢測方面，上海交通大學的陳曉華團隊與美國斯坦福大學Glenn團隊合作，在2017年報道了一種基于熒光的高通量定量微陣列抗體捕獲（quantitative microarray antibody capture，Q-MAC）技術［27］。其原理是將重組HDV抗原以圓點形式固定在金膜上制作成微陣列，加入樣本之后HDV抗原捕獲抗體，然后再加入IRDye800熒光標記驢抗人IgG二抗，最后利用Licor Odyssey掃描儀進行熒光信號檢測。平行比較實驗顯示，該方法的檢測靈敏度遠高于ELISA和免疫印跡，而且可以實現(xiàn)抗體定量。雖然該方法僅檢測了抗-HD IgG，但用同樣的策略開發(fā)出抗-HD IgM和抗-HD總抗體應該也具有可行性。與上述抗-HD IgG檢測試紙條一樣，目前Q-MAC產(chǎn)品也尚未上市。

3 丁型肝炎抗體檢測面臨的幾個重要問題

3.1 不同HDV基因型的序列差異對抗體檢測的影響 如上所述，HDV共有8個基因型。由于HDV1為全球分布，影響最廣，所以幾乎所有的HDV抗體檢測產(chǎn)品都利用HDV1的抗原來捕獲抗體［18，28］（抗-HD IgG檢測試紙條除外，見下文）。關于不同HDV基因型的抗原與抗體交叉反應能力的研究很少。從生物信息學方面而言，HDV不同基因型的基因組序列差異可以達到40%［11-12］，然而HDV抗原的蛋白質序列水平差異要小很多。Wang等［29］利用針對HDV1型的患者血清和單克隆抗體能夠檢測所有HDV基因型的抗原，包括免疫熒光和免疫印跡試驗，并且信號強度沒有明顯區(qū)別。這說明HDV不同基因型的抗原表位可能相當保守。盡管如此，該研究使用的抗體很可能是過量的，不排除當使用更低濃度的抗體時可以觀察到因交叉反應能力差異造成的信號強度不同。上述膠體金試紙條檢測方法使用了一種所謂的“保守”HDV抗原，即首先對8個基因型的HDV抗原序列進行比對，獲得保守序列，然后通過人工合成的方式獲得該“保守”抗原的編碼DNA［25］。該試紙條可以成功檢測到多種HDV基因型感染的患者血清中的抗體。但其主要是定性分析，準確測定該“保守”抗原與不同基因型HDV抗體的交叉反應能力則需要更多的平行比較試驗。除了利用完整的HDV抗原之外，部分檢測試劑利用含有HDV抗原表位的肽段來進行抗體檢測［30］。這種檢測方法可能對基因變異更加敏感，需要充分考慮抗原表位的保守性，并且通常需要同時采用多個表位的肽段來避免假陰性的出現(xiàn)?？傊?，不同HDV基因型的抗原與抗體之間具有較強的交叉反應能力，但是抗原的序列差異對不同HDV基因型的抗體檢測，尤其定量檢測的確切影響還有待更深入的研究。

3.2 HDV抗體的定量檢測 以上提到的HDV抗體檢測產(chǎn)品，除了基于熒光的微陣列檢測外，幾乎全部只能用于定性檢測。這可能是由于目前丁型肝炎抗體檢測的主要目的是篩查，而定性檢測試劑已經(jīng)能夠滿足篩查的需求。盡管如此，抗體定量檢測的重要性仍不容忽視。如前所述，除了急性感染期外，抗-HD IgM在部分慢性丁型肝炎患者血清中也能檢測到，而且抗體濃度與疾病的嚴重程度相關。因此，抗-HD IgM的定量檢測具有重要意義。另一方面，隨著丁型肝炎治療的展開，抗體的定量檢測對監(jiān)控病情和藥物治療效果很可能也是非常必要的。研究者們或許能夠從乙型肝炎抗體檢測的發(fā)展歷程中學習到經(jīng)驗，例如 “乙肝五項”中的抗體檢測經(jīng)歷了從定性到定量檢測的過程。HDV抗體檢測可能也會經(jīng)歷類似的過程。

3.3 標準品與檢測試劑的評估 由于目前HDV抗體檢測產(chǎn)品主要用于定性檢測，所以僅包含陰性對照和陽性對照，不包含標準品。已有多項研究［20-24，31］對不同的丁型肝炎抗體檢測試劑進了平行比較，結果發(fā)現(xiàn)這些試劑盒在檢測靈敏度等方面存在很大的差異。缺乏統(tǒng)一的標準品導致不同檢測產(chǎn)品和方法之間的比較和評價存在很大困難。HDV現(xiàn)癥感染時，HDV抗體的水平通常比較高，抗體定性檢測結果的一致性很高［17-18］。但是無法排除某些感染者體內(nèi)抗體水平較低，或者藥物治療導致抗體水平降低等情況。在這些情況下，檢測產(chǎn)品的靈敏度和特異度對結果的判斷可能會有很大的影響。另一方面，隨著HDV抗體定量檢測需求的增加，標準品和評價指標的重要性會越來越大。世界衛(wèi)生組織在2013年建立了第一份HDV基因組RNA的標準品［32］，該標準品取自HDV1型患者血清，HDV的效價制訂為575 000 IU/mL。該標準品為HDV基因組RNA的定量提供了統(tǒng)一的參考。然而目前尚沒有一套完整的丁型肝炎抗體標準品。建立一套完整統(tǒng)一的丁型肝炎抗體標準品，將有利于抗體定量檢測產(chǎn)品的開發(fā)和評估，而且有利于對不同研究所獲得的數(shù)據(jù)進行橫向比較，因此具有重要意義。

4 展望

HDV抗體檢測對丁型肝炎的診斷至關重要?？?HD總抗體、抗-HD IgG、抗-HD IgM分別具有不同的臨床診斷意義，均應該受到重視。雖然目前相關的檢測手段都有了一定的發(fā)展，而且市場上有應用的產(chǎn)品供應，但是仍存在很多重要的不足之處，包括：缺乏對不同HDV基因型的抗體檢測能力的測定；總抗體檢測產(chǎn)品較少，難以滿足大規(guī)模篩選的需求；定量檢測產(chǎn)品缺乏；基于CLIA等高靈敏度檢測方法的產(chǎn)品有待開發(fā)；缺乏統(tǒng)一的標準品、操作指南和評價指標等。此外，作為丁型肝炎的另一項關鍵指標，HDV RNA的檢測也存在很多問題［32-33］。近年來隨著對丁型肝炎認識的深入，科研和醫(yī)療產(chǎn)業(yè)機構都在不斷推動丁型肝炎檢測試劑的開發(fā)和應用。新型冠狀病毒肺炎暴發(fā)以來，病毒診斷行業(yè)在技術和產(chǎn)業(yè)規(guī)模方面取得了重大的發(fā)展。這些發(fā)展必然會對丁型肝炎診斷產(chǎn)品的開發(fā)和升級起到巨大的推動作用。丁型肝炎領域的相關專家和從業(yè)人員應加大教育宣傳，達成共識，針對以上亟待解決的問題，推動丁型肝炎檢測的產(chǎn)品開發(fā)、升級和應用，并最終為丁型肝炎的防治提供支持。

利益沖突聲明：作者聲明不存在利益沖突。

致謝：衷心感謝莊輝院士對文稿寫作的指導。

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收稿日期：

2023-02-20；錄用日期：2023-03-20

本文編輯：葛俊