張嫄怡,李春鳴,張 霞,梁 娜

(1.肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室,廣東 肇慶 526020;2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科,貴州 遵義 563000;3.遵義醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因,在中國每年約有40萬新發(fā)病例,占全球病例的40 %[1]。盡管當(dāng)前胃癌的發(fā)病率和死亡率趨勢(shì)有所下降[2],但該病的預(yù)后仍然是所有實(shí)體器官腫瘤中最差的,主要是因?yàn)榇蠖鄶?shù)確診病例處于晚期,具有廣泛的轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)性[3]。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細(xì)胞失去上皮特征(如根尖-基底極性和細(xì)胞之間粘附)并獲得間充質(zhì)特征(如侵襲性、運(yùn)動(dòng)性和抗細(xì)胞死亡)的過程[4]。EMT的過程不僅可以由細(xì)胞內(nèi)致癌分子或致癌因子啟動(dòng),還可以由許多細(xì)胞外因子觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件,轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)為其中之一[5]。TGF-β屬于TGF超家族,TGF-β信號(hào)通路在多種腫瘤生物學(xué)行為中發(fā)揮關(guān)鍵作用,包括腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、分化、遷移、侵襲和黏附[6-7]。有研究表明,與健康對(duì)照組相比,TGF-β1在胃癌患者的黏膜、血清和組織中的表達(dá)增強(qiáng),TGF-β1水平升高能促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移,引發(fā)復(fù)發(fā)性胃癌[8]。TGF-β/Smad信號(hào)通路可以通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白 (E-cadherin)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT[9]。

KAI1位于人類染色體11p11.2上,與CD82 完全相同,屬于跨膜超4家族的成員,KAI1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并參與細(xì)胞復(fù)制中多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),比如細(xì)胞的融合、遷移、受精、分化和侵襲[10-11]。越來越多的研究表明KAI1表達(dá)的降低或丟失與胃癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)[12-13]。雖然過表達(dá)KAI1能顯著降低胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,但是KAI1在胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)所發(fā)揮的作用和潛在的機(jī)制尚不明朗。本研究通過觀察過表達(dá)KAI1對(duì)TGF-β1/Smad2信號(hào)通路及胃癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響,探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);慢病毒包裝(上海吉滿生物公司);胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);Trizol試劑盒,qPCR試劑盒(上海翊圣公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Immobilon公司);結(jié)晶紫(上海TCI公司);TGF-β1、E-cadherin抗體、Vimentin抗體(美國Abcam公司);CD82/KAI1抗體(美國Santa Cruz公司);超微量紫外線可見分光光度計(jì)(杭州遂真公司);熒光定量PCR儀(美國Bioer公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);Transwell小室(美國Corning公司);Tanon 4600系列全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)(上海Tanon公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中,含10 %胎牛血清,1 %青-鏈霉素混合液,置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞的分組和轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染PGMLV-CMV-H_CD82(KAI1)-PGK-Puro的KAI1組,轉(zhuǎn)染空病毒PGMLV-CMV- MCS-PGK-Puro的NC組,不轉(zhuǎn)染病毒的Control組。將3 組SGC-7901細(xì)胞按照2×105/細(xì)胞接種于24孔板,至細(xì)胞達(dá)50 %時(shí)開始轉(zhuǎn)染。用400 μL完全培養(yǎng)基按MOI=300稀釋病毒原液,將250 μL含有慢病毒稀釋液的培養(yǎng)基加到KAI1組和NC組細(xì)胞中進(jìn)行感染,感染16 h后更換為500 μL的完全培養(yǎng)基,再添加嘌呤霉素進(jìn)行篩選,篩選2次,每次2 d,通過qPCR和Western blot驗(yàn)證獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.2.3 篩選TGF-β1誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生EMT的最佳藥物濃度與時(shí)間 取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞接種于6孔板中,分別加入濃度為0、2、5、10、20 ng/mL的TGF-β1進(jìn)行培養(yǎng),觀察在6、12、24、48、72 h時(shí)細(xì)胞形態(tài)的變化。提取不同濃度、不同時(shí)間TGF-β1培養(yǎng)細(xì)胞的mRNA,用qPCR法檢測(cè)E-cadherin和Vimentin表達(dá)水平。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和E-cadherin、Vimentin表達(dá)水平確定發(fā)生EMT的最佳藥物濃度與時(shí)間。用最佳TGF-β1濃度和時(shí)間培養(yǎng)KAI1組、NC組和Control組細(xì)胞分別為KAI1+TGF-β1組,NC+TGF-β1組和TGF-β1組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 qPCR檢測(cè) 用Trizol液提取KAI1、NC 和Control 組總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,qPCR法檢測(cè)KAI1表達(dá)水平。用相同的方法分別提取濃度0、2、5、10、20 ng/mL的TGF-β1培養(yǎng)6、12、24、48、72 h時(shí)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,qPCR檢測(cè)E-cadherin和Vimentin表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件:95 ℃、10 min;95 ℃、30 s、60 ℃、30 s、72 ℃、1 min,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔct法計(jì)算KAI1表達(dá)水平。KAI1上游5'-GATCCTCATTGCCCAGGTGA-3'、下游5'-CCTCGCGACTGCTGTTGTAG-3',E-cadherin上游5'-GAAGGCGGTGGAG-AAGATGAT-3'、下游5'-CGGTCGAGGTCTGTACTGAGGTG-3',Vimentin上游5'-CGACTCCTGACCAAGACCAACA-3'、下游5'-CACATCGTTCCTCCACCACC-3'。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 收集KAI1、NC和Control組細(xì)胞,經(jīng)裂解、離心后收集總蛋白;用同樣的方法收集KAI1+TGF-β1組,NC+TGF-β1組和TGF-β1組總蛋白。使用BCA試劑盒檢測(cè)目標(biāo)蛋白濃度。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上,脫脂奶粉(5 %)用于封閉,用一抗(4 ℃,隔夜)孵育∶兔抗人KAI1(1∶1 000)、E-caherin(1∶10 000)、Vimentin(1∶5 000)、Smad2(1∶1 000)、p-Smad2(1∶1 000)單克隆抗體。加入二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h。孵育完成后用TBST溶液洗膜3次,使用Tanon 4600系列全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)顯影,Image J軟件分析蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 提前在6孔板上劃好3條平行線作為標(biāo)記。取對(duì)數(shù)生長期的KAI1+TGF-β1組,NC+TGF-β1組和TGF-β1組細(xì)胞調(diào)整密度至6×105個(gè)/mL,接種到6孔板中,靜置20 min后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)6孔板內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)90 %時(shí),用100 μL的無菌移液管畫出垂直于標(biāo)記線的劃痕,用Image J測(cè)量0、24 h劃痕寬度并計(jì)算劃痕愈合率。進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定平均值,比較各組細(xì)胞遷移率。

1.2.7 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 制備無血清的細(xì)胞懸液100 μL,調(diào)整密度為1×105ml/l加入Transwell小室上室,而下室加入含30 %胎牛血清的DMEM,將小室放入培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)24 h。將侵入的細(xì)胞用蘇木素染色。用PBS液洗掉多余染色,將Transwell小室倒置,取鏡下5個(gè)視野計(jì)數(shù),取平均值算出侵襲SGC-7901細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定株建立 攜帶KAI1的重組慢病毒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901后,Western blotting檢測(cè)3組細(xì)胞顯示KAI1組KAI1蛋白表達(dá)量(1.16±0.61)顯著高于NC組(0.38±0.20)和Control組(0.37±0.19),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1A)。此外qPCR檢測(cè)3 組細(xì)胞結(jié)果顯示KAI1組細(xì)胞中KAI1mRNA表達(dá)水平(11.66±1.03)明顯高于NC組(1.08±0.12)和Control組(1.00±0.12),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1B)。Western blotting和qPCR結(jié)果均提示KAI1組KAI1基因過表達(dá)。

*:與Control和NC組比較,P<0.05。圖1 KAI1基因在3 組細(xì)胞中表達(dá)情況

2.2 TGF-β1培養(yǎng)人胃癌SGC-7901發(fā)生EMT最佳時(shí)間和濃度 分別用不同濃度、不同時(shí)間的TGF-β1培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)TGF-β1濃度達(dá)到10 ng/mL,培養(yǎng)24 h后可見細(xì)胞形態(tài)從橢圓形或多角形明顯轉(zhuǎn)化為具有凸起結(jié)構(gòu)的成纖維細(xì)胞的形狀,出現(xiàn)類似于在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和分裂中的片狀偽足(圖2A)。增加TGF-β1濃度,延長培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞形態(tài)改變不明顯。此外,qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著TGF-β1培養(yǎng)濃度的增加,時(shí)間的延長,E-cadherin蛋白表達(dá)逐漸減少,Vimentin蛋白表達(dá)逐漸增加。當(dāng)TGF-β1濃度為10 ng/mL、培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)E-cadherin和Vimentin變化最明顯,增大濃度、延長時(shí)間改變并不明顯(圖2B)。因此,后續(xù)將 TGF-β1培養(yǎng)人胃癌SGC-7901發(fā)生EMT的濃度定為10 ng/mL,時(shí)間定為24 h。

A:10 ng/mL的TGF-β1培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞24 h時(shí)細(xì)胞形態(tài)的改變(×100);B:qPCR法檢測(cè)不同濃度TGF-β1培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞24 h時(shí)E-cadherin和Vimentin的mRNA表達(dá)情況。圖2 TGF-β1培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞的形態(tài)及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

2.3 TGF-β1誘導(dǎo)后各組人胃癌SGC-7901形態(tài)學(xué)改變 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)NC+TGF-β1組和TGF-β1組細(xì)胞形態(tài)改變明顯,而KAI1+TGF-β1組細(xì)胞形態(tài)沒有出現(xiàn)明顯的偽足等結(jié)構(gòu)(圖3)。

a:NC+TGF-β1;b:TGF-β1; c:KAI1+TGF-β1。 圖3 各組細(xì)胞EMT樣形態(tài)學(xué)比較(×100)

2.4 TGF-β1誘導(dǎo)各組人胃癌SGC-7901發(fā)生侵襲和遷移細(xì)胞數(shù) 劃痕操作后繼續(xù)培養(yǎng)3 組細(xì)胞24 h,通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)KAI1+TGF-β1組劃痕的寬度較NC+TGF-β1和TGF-β1組大(圖4A);計(jì)算各組細(xì)胞遷移率,發(fā)現(xiàn)KAI1+TGF-β1組遷移率(0.49±0.08)小于NC+TGF-β1(0.84±0.06)和TGF-β1組(0.77±0.19),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4B)。通過Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KAI1+TGF-β1組侵襲細(xì)胞數(shù)量(24.33±1.53)明顯少于NC+TGF-β1(47.00±11.27)和TGF-β1組(55.33±12.06),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5)。

*:與NC+TGF-β1和TGF-β1組比較,P<0.05;×100。圖4 細(xì)胞劃痕檢測(cè)各組細(xì)胞遷移情況

*:與NC+TGF-β1和TGF-β1組比較,P<0.05;×100。圖5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況

2.5 TGF-β1誘導(dǎo)后各組人胃癌SGC-7901中E-cadherin、Vimentin、Smad2和p-Smad2蛋白表達(dá)水平KAI1+TGF-β1組E-cadherin蛋白表達(dá)水平(0.90±0.16)明顯高于NC+TGF-β1組(0.55±0.07)和TGF-β1組(0.57±0.04);KAI1+TGF-β1組Vimentin蛋白表達(dá)水平(0.76±0.07)明顯低于NC+TGF-β1組(1.20±0.08)和TGF-β1組(1.10±0.17),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KAI1+TGF-β1組Smad2蛋白表達(dá)水平(0.75±0.13)和p-Smad2蛋白表達(dá)水平(0.36±0.10)明顯低于NC+TGF-β1(1.37±0.32)、(0.96±0.29)和TGF-β1組(1.25±0.20)、(0.77±0.12),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)。

*:與NC+TGF-β1和TGF-β1組比較,P<0.05。圖6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、Smad2和p-Smad2蛋白表達(dá)水平

3 討論

胃癌早期時(shí)癥狀隱匿,大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已為晚期階段[14]。臨床病理學(xué)研究表明KAI1在胃癌組織中低表達(dá),并與胃癌腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期相關(guān)[15]。還有研究表明KAI1可以抑制胃癌的遷移,其表達(dá)下降與胃癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。KAI1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用尚不明確。本研究通過轉(zhuǎn)染KAI1,觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT及TGF-β1/Smad2信號(hào)通路的影響,進(jìn)一步探討KAI1相關(guān)分子機(jī)制。

EMT可導(dǎo)致上皮細(xì)胞發(fā)生多種生物化學(xué)改變,例如粘附連接蛋白E-cadherin、ZO-1等上皮標(biāo)記物的丟失,獲得侵襲性間充質(zhì)表型,如N-cadherin、Vimentin[4]。E-cadherin是一種跨膜糖蛋白,在維持細(xì)胞間粘附中起重要作用,作為EMT最重要的標(biāo)志物之一,可在正常組織和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn),E-cadherin的下調(diào)使細(xì)胞間粘附連接和極性降低,有助于腫瘤細(xì)胞侵入周圍組織[17]。Vimentin是一種Ⅲ型中間絲蛋白,它在EMT過程中起著重要作用,是發(fā)生EMT的癌細(xì)胞遷移所必需的[18]。TGF-β1在各種上皮來源的細(xì)胞中充當(dāng)有效的EMT驅(qū)動(dòng)因子,包括胃癌細(xì)胞,可以通過Smad介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)激活TGF-β1誘導(dǎo)的EMT[19]。本研究中發(fā)現(xiàn),人胃癌SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過TGF-β1直接處理后,細(xì)胞形態(tài)由橢圓形或多角形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?出現(xiàn)EMT表型,qPCR提示Vimentin mRNA表達(dá)升高,E-cadherin mRNA表達(dá)明顯降低?；谏鲜龈淖?本實(shí)驗(yàn)利用光鏡觀察發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KAI1可以減弱TGF-β1導(dǎo)致的胃癌細(xì)胞形態(tài)改變,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞并沒有出現(xiàn)明顯的偽足等結(jié)構(gòu);同時(shí)細(xì)胞劃痕和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察到過表達(dá)KAI1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞發(fā)生的侵襲和遷移。另外,與對(duì)照組相比,過表達(dá)KAI1逆轉(zhuǎn)了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),E-cadherin表達(dá)明顯增多,Vimentin表達(dá)明顯減少;表明KAI1 可以通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT,從而抑制EMT相關(guān)的胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

KAI1能通過多種信號(hào)通路參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,例如通過下調(diào)Wnt通路和上調(diào)Hippo通路抑制癌細(xì)胞的EMT[20];并通過逆轉(zhuǎn)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),從而抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[21]。TGF-β/Smad信號(hào)通路的異常與多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切,活化的TGF-β調(diào)節(jié)激活Smad蛋白磷酸化,影響細(xì)胞核中基因的轉(zhuǎn)錄,最終促成TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程[22]。在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT的表型和轉(zhuǎn)移[7,23]。

綜上所述,本研究用Western blot檢測(cè)Smad2蛋白和磷酸化Smad2蛋白p-Smad2,發(fā)現(xiàn)KAI1可以降低TGF-β1誘導(dǎo)的人胃癌SGC-7901細(xì)胞Smad2和p-Smad2蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果說明,在TGF-β1/Smad2促使胃癌細(xì)胞EMT的發(fā)生過程中,過表達(dá)KAI1抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制與抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路激活、調(diào)節(jié)EMT相關(guān)因子,從而抑制胃癌細(xì)胞EMT有關(guān)。