蘇 艷,孫 倩,張雅蘭,李曉琳

(保定市第二醫(yī)院 1.心血管內(nèi)一科,2.特需診療科,河北 保定 071051)

ST段抬高型心肌梗死(STEMI)其臨床特征為有典型的缺血性胸痛,持續(xù)超過(guò)20 min,血清心肌壞死標(biāo)記物濃度升高并有動(dòng)態(tài)演變,心電圖具有典型的ST段抬高[1-2]。STEMI的先兆癥狀主要包括心絞痛發(fā)作較以往頻繁、程度較劇、持續(xù)較久、硝酸甘油療效差,其誘發(fā)因素及發(fā)病分子機(jī)制尚不明確[3-4]。有研究表明通過(guò)對(duì)STEMI患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)炎癥的評(píng)估,證實(shí)多種炎癥因子的釋放與STEMI具有顯著的相關(guān)性[5],另有針對(duì)199名STEMI患者的臨床隊(duì)列研究,通過(guò)使用炎癥因子IL-6受體的抑制劑治療,證實(shí)IL-6受體抑制劑可以顯著的提高患者心肌挽救率[6]。PTX3是一種可溶性識(shí)別分子,在炎癥因子和外源刺激下由多種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、活化的內(nèi)皮細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及其他組織細(xì)胞產(chǎn)生[7-8],與心衰及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的易損性密切相關(guān),在破裂的冠狀動(dòng)脈斑塊中也檢測(cè)到PTX3的高表達(dá),可見(jiàn)PTX3是參與心肌損傷過(guò)程的重要分子[9-10],但其在STEMI患者中的表達(dá)水平尚不明確,同時(shí)PTX3是否可以影響炎癥因子的分泌同時(shí)參與心肌細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而影響臨床心肌挽救率尚不明確。因此,本研究將通過(guò)STEMI患者探究外周血PTX3的表達(dá)水平,分析患者血清中炎癥因子的表達(dá)水平,同時(shí)通過(guò)人心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)PTX3,探究PTX3是否通過(guò)影響炎癥因子釋放干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡,為PTX3在STEMI中的作用及其分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源 人心肌細(xì)胞細(xì)胞系HCM購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(上海);2020年1月-2022 年1月在保定市第二醫(yī)院獲得的臨床資料完整的STEMI患者93例以及183例健康對(duì)照,年齡(56.45±8.40)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管分會(huì)制定的急性心肌梗死診斷和治療指南提出的STEMI的診斷標(biāo)準(zhǔn);②發(fā)病時(shí)間小于12 h。排除標(biāo)準(zhǔn):①心源性休克;②既往有出血性腦卒中或中重度肝病的患者;③大出血活動(dòng)期患者;④6個(gè)月內(nèi)有重大手術(shù)或外傷、腦血管疾病者;⑤凝血疾病和血小板減少癥者。本篩查研究中所有參與者均簽署知情同意書(shū)并通過(guò)保定市第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.1.2 試劑和設(shè)備 DMEM(Gibco,貨號(hào):11995040),FBS(Gibco貨號(hào): 16000-044),P/S(Gibco,貨號(hào)15140-022);細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管、EP管等試驗(yàn)耗材購(gòu)于美國(guó)Corning公司;PTX3質(zhì)粒及NC質(zhì)粒等購(gòu)于廣州Ribobio公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成;330全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于上海科華卓越有限公司,FACSVia流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 所有患者及健康對(duì)照用抗凝管采集5 mL外周血,室溫靜置30 min,3 500 r/min 離心10 min,分離血清,檢測(cè)血清TC、TG、HDL-C、Non-HDL-C、Tnl admission、Tnl max、AOPP、TOS、PAB、SH、TAS、SOD 各指標(biāo)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HCM細(xì)胞培養(yǎng)條件:5%,CO2;37 ℃,培養(yǎng)密度:1×106cells/培養(yǎng)皿;換液及傳代:每隔1 d更換培養(yǎng)液,2～3 d傳代,傳代比例為1∶3～4。轉(zhuǎn)染條件:按照Lipofectamine TM 3000說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒和PTX3質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染6～8 h后更換完全培養(yǎng)基,5 % CO2,37 ℃培養(yǎng)。

1.2.3 qPCR檢測(cè)PTX3、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平 通過(guò)qPCR檢測(cè)細(xì)胞中的PTX3、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平。將適量的細(xì)胞加入1 mL TRIZOL法提取總RNA,后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s, 55 ℃退火15 s,共40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。每個(gè)樣品重復(fù)3次檢測(cè),利用2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量,用內(nèi)參β-actin對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)化處理。

表1 引物序列

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后, 800 r/min 4 ℃離心5 min收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,800 r/min 4 ℃離心5 min。收集細(xì)胞加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。嚴(yán)格按照試劑盒要求加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution,輕輕混勻;反應(yīng)條件為:避光、室溫10～15 min;加入400 μL 1×Binding Buffer,混勻后放置于冰上;樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 如表2所示,與對(duì)照組相比,STEMI組患者的收縮壓和舒張壓、血糖、TG濃度高于對(duì)照組,而TC和HDL-C濃度低于對(duì)照組。氧化應(yīng)激參數(shù)中STEMI組的PAB值較高,而STEMI患者的AOPP濃度低于對(duì)照組。STEMI患者的抗氧化酶SOD顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表2 STEMI患者和對(duì)照組的一般資料比較

2.2 兩組患者PTX3 mRNA表達(dá)水平的比較 通過(guò)qPCR檢測(cè)兩組患者外周血PTX3 mRNA表達(dá)水平,圖1結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,STEMI組患者PTX3 mRNA表達(dá)水平顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 兩組患者PTX3表達(dá)水平比較

2.3 兩組患者血清炎癥因子表達(dá)水平的比較 兩組患者外周血血清炎癥因子表達(dá)水平,如表3所示。結(jié)果表明,與對(duì)照組患者相比,STEMI組患者外周血炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 兩組患者外周血炎癥因子水平比較

2.4 轉(zhuǎn)染PTX3對(duì)人心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 通過(guò)qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染PTX3對(duì)炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響,結(jié)果表明與對(duì)照組和NC組相比,試驗(yàn)組細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),NC組和對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表4)。

表4 轉(zhuǎn)染PTX3對(duì)人心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

2.5 轉(zhuǎn)染PTX3對(duì)人心肌細(xì)胞凋亡表達(dá)的影響 通過(guò)流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染PTX3對(duì)人心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響,如圖2所示,結(jié)果表明與對(duì)照組和NC組比較,試驗(yàn)組細(xì)胞凋亡比例顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),NC組和對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*:與對(duì)照組比較, P<0.01。圖2 轉(zhuǎn)染PTX3對(duì)人心肌細(xì)胞凋亡表達(dá)的影響

3 討論

ST段抬高型心肌梗死由于心臟的供應(yīng)血管有急性血栓形成,導(dǎo)致相應(yīng)的區(qū)域出現(xiàn)透壁性心肌梗死[11]。STEMI容易造成患者心律失常、室壁瘤,甚至心臟破裂,導(dǎo)致患者猝死,因此應(yīng)盡早的給予溶栓或者應(yīng)用PCI進(jìn)行治療,救治及時(shí)大多數(shù)患者都能獲得較好的臨床預(yù)后,如果患者發(fā)病時(shí)間過(guò)長(zhǎng),錯(cuò)過(guò)最佳救治時(shí)間不能逆轉(zhuǎn)心臟損傷,會(huì)造成患者后期活動(dòng)耐量下降、呼吸困難、生活質(zhì)量下降的不良癥狀[12-13]。

炎癥因子釋放對(duì)STEMI病理生理學(xué)中起著重要干預(yù)作用[14],研究表明STEMI患者的炎癥生物標(biāo)志物IL-6、IL-1β和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平顯著升高,IL-6、IL-1β和MDA之間以及STEMI患者TIMI評(píng)分與IL-1β之間存在正相關(guān)關(guān)系[15],也有研究證實(shí)系統(tǒng)免疫炎癥指數(shù)可以作為預(yù)測(cè)ST段抬高型心肌梗死患者引發(fā)的腎病的炎癥標(biāo)志物[16],本研究通過(guò)臨床STEMI患者及健康者血清,發(fā)現(xiàn)STEMI患者炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α顯著高表達(dá),這與當(dāng)前心肌梗死研究結(jié)果相一致,提示炎癥因子大量釋放可能是STEMI發(fā)病的結(jié)果之一;同時(shí),本研究通過(guò)qPCR證實(shí)了PTX3在STEMI患者中顯著高表達(dá)。有研究表明,PTX3在炎癥、止血反應(yīng)、組織修復(fù)和纖維化消退的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能,這種可溶性模式識(shí)別分子屬于體液固有免疫系統(tǒng)的重要分子,通常由吞噬細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在炎癥部位迅速產(chǎn)生,在感染或組織器官損傷中發(fā)揮作用[17]。這提示在STEMI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,PTX3可能通過(guò)影響炎癥因子干預(yù)心肌損傷的修復(fù)及心肌細(xì)胞功能。有研究通過(guò)小鼠及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTX3參與了多種類型細(xì)胞的增殖、分化、凋亡,并且這些過(guò)程伴隨著炎癥因子的調(diào)控,PTX3通過(guò)JNK信號(hào)通路促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞心臟分化,PTX3增強(qiáng)了JNK的磷酸化,促進(jìn)了Nkx2 Mef2c、Tbx5、dHand和αMHC的轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮了小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用[18];PTX3調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)炎癥期間棕色脂肪細(xì)胞中miR-21的表達(dá)和分泌[19],內(nèi)皮功能障礙中神經(jīng)肽Y升高促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和平滑肌泡沫細(xì)胞形成是通過(guò)PTX3的調(diào)控發(fā)生的,并且這些過(guò)程伴隨著增加炎癥細(xì)胞的趨化性而放大血管炎癥,觸發(fā)平滑肌泡沫細(xì)胞的形成[20]。以上研究均證實(shí)了,在不同類型的細(xì)胞及不同的組織中,PTX3均會(huì)影響炎癥因子釋放,從而發(fā)揮特定的生物學(xué)功能。作者在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)STEMI患者中PTX3表達(dá)增高,進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探究了PTX3和炎癥因子與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。本研究探究過(guò)表達(dá)PTX3對(duì)心肌細(xì)胞的影響,qPCR結(jié)果提示過(guò)表達(dá)PTX3后心肌細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL6和TNF-α顯著上升,這提示PTX3具有調(diào)控炎癥因子釋放的功能,與臨床結(jié)果發(fā)現(xiàn)的患者外周血炎癥因子及氧化應(yīng)激分子的增加結(jié)果相一致;同時(shí)本研究通過(guò)流式細(xì)胞分析探究炎癥因子釋放是否會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響,結(jié)果表明過(guò)表達(dá)PTX3會(huì)引發(fā)心肌細(xì)胞存活率降低,而早期凋亡和晚期凋亡水平均顯著增加,這與當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道的STEMI患者存在不可逆的心肌細(xì)胞損傷相一致。由此推測(cè),PTX3可能通過(guò)促進(jìn)炎癥因子釋放,引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致了心肌組織的不可逆損傷。

綜上,STEMI患者中PTX3表達(dá)水平顯著升高,炎癥因子分泌增加,表明PTX3可能通過(guò)促進(jìn)炎癥因子的分泌誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡,引發(fā)心肌損傷。本研究可以進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探究PTX3對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子CyclinD1和CDK1等信號(hào)通路的調(diào)控,完善PTX3對(duì)細(xì)胞凋亡影響的分子機(jī)制,為臨床研究提供理論基礎(chǔ)。