秦桂芳,李 剛,張 鳳,鮮小菊,匡菊香,朱 蕾,肖世基,李思慧,劉 超,王 剛

(遵義醫(yī)科大學 藥學院,貴州 遵義 563099)

苦丁茶最早記于東漢,距今已有近2000多年的歷史,因其資源豐富、價格低廉,已成為我國一種常見的天然飲品[1],其種類主要包括大葉冬青和小葉苦丁茶。本研究所使用的苦丁茶為貴州余慶小葉苦丁茶。小葉苦丁茶是木犀科女貞屬植物粗壯女貞(Ligustrumrobustum)的葉,是我國傳統(tǒng)的植物代用茶和藥食同源植物,主要分布于我國貴州、云南、四川等地[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明,小葉苦丁茶有抗氧化、抗炎、抗衰老、降低血壓等作用[3-6]。另外,小葉苦丁茶中含有礦物質(zhì)、維生素、氨基酸等多種營養(yǎng)成分[7],近年來,越來越多學者關注到了小葉苦丁茶中的活性物質(zhì),有望將其開發(fā)成為保健藥品和食品加工的重要原料。

植物多糖是一種通過醛糖或酮糖鍵連接的天然高分子聚合物,其來源廣泛、藥理活性多樣、毒副作用小,在腫瘤生長、病毒繁殖、氧化平衡和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起著重要作用[8-11]。植物多糖提取方法較多,包括酶輔助提取、熱回流提取、超聲波提取、超音波提取、微波提取等方法。常規(guī)提取方法是熱回流提取[12],這種方法對溫度要求較高且比較耗時,會引起多糖降解并降低藥理活性[13]。因此,在選擇植物多糖合適的提取方法時,需同時考慮多糖的生物活性和提取率這2個重要參數(shù)。超聲提取法是一種通過超聲的空化作用、熱作用和機械作用的相互作用破壞植物細胞,使藥材中的有效成分快速溶出的方法。研究發(fā)現(xiàn),超聲提取法較傳統(tǒng)提取方法在提取速度及提取效率方面有所提升[14-15]。孫永杰等[16]采用3種不同的方法提取淫羊藿的多糖,結(jié)果表明,超聲法(4.5 %)較微波法(3.01 %)和水酶法(2.62 %)提取率更高。

小葉苦丁茶中含有多酚、黃酮、萜類、多糖等多種有效成分[17-18]。目前,關于小葉苦丁茶的研究主要集中在苯乙醇苷類化合物。有研究表明,小葉苦丁茶中分離出的苯乙醇苷類化合物可顯著抑制肝微粒體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成[19]。關于小葉苦丁茶多糖抗氧化活性的研究甚少,鑒于此,本研究在確定了對多糖提取率影響較大的幾個因素后,采用響應面優(yōu)化設計確定水提多糖的最佳提取工藝,并通過自由基清除實驗考察小葉苦丁茶多糖的抗氧化活性,為小葉苦丁茶后續(xù)在食品及醫(yī)藥領域的開發(fā)利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 余慶小葉苦丁茶(貴州省余慶縣綠野茶葉加工廠);葡萄糖(天津市科密歐化學試劑有限公司);苯酚、無水乙醇(成都市科隆化學品有限公司);濃硫酸[重慶川東化工(集團)有限公司];維生素C(成都瑞芬思生物技術有限公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、磷酸氫二鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);槲皮素(上海麥克林生化科技有限公司);磷酸二氫鈉、菲洛嗪(百靈威科技有限公司); FeCl2· 4H2O(國藥集團化學試劑有限公司);ABTS(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 儀器 超聲細胞破碎儀(浙江洛尚儀器有限公司);酶標儀(MICROPLATE公司);722可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司);油浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);低溫冷卻液循環(huán)泵(上海豫康科教儀器設備有限公司);循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);真空冷凍干燥機(寧波市雙嘉儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的建立 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。以C6H12O6· H2O為標準物質(zhì),配制成 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的C6H12O6· H2O標準溶液,移取上述溶液400 μL于試管中,再加入400 μL蒸餾水、400 μL 5 %苯酚溶液、2 mL濃硫酸混合均勻,反應30 min后在494 nm波長處測定反應溶液吸光度值,根據(jù)吸光度值建立的葡萄糖的標準曲線為:y=5.2518x + 0.0205(y為吸光度值,x為濃度),其中R2=0.9993。

1.3.2 樣品制備及含量測定 小葉苦丁茶粉碎過篩后干燥至恒重;稱取20 g藥材,根據(jù)實驗設計工藝方案用水提取多糖。將多糖提取液濃縮至500 mL,加入2 000 mL 95 %乙醇,產(chǎn)生灰色絮狀沉淀,靜置12 h,即得小葉苦丁茶多糖粗提物。將多糖粗提物用蒸餾水重新溶解,以1∶4的比例加入Sevage試劑(三氯甲烷∶正丁醇=5∶1)。然后用力搖勻20 min,離心10 min(3 500 r/min),去除有機相和蛋白層,收集上清液[20]。用0.1 % 氫氧化鈉調(diào)節(jié)上清液至pH 8～9,加入H2O2后在40 ℃條件下反應10 min脫色。再用3 500 Da的透析袋透析72 h去除多酚、黃酮等小分子雜質(zhì),濃縮、冷凍干燥得小葉苦丁茶多糖提取物[21]。取經(jīng)上述處理后得到的精制多糖提取物適量按1.3.1的方法測定吸光度,根據(jù)建立的標準曲線計算多糖提取率。

1.3.3 方法學考察 根據(jù)文獻[22-24],開展了小葉苦丁茶提取物中多糖的含量測定方法研究。

1.3.3.1 精密度實驗 取10 mg凍干后的多糖提取物溶于10 mL蒸餾水中,精密量取0.4 mL的樣品溶液,按照1.3.1項下的操作,在同一條件下測定吸光度值,重復測定6次,算相對標準偏差值(relative standard deviation, RSD)。

1.3.3.2 穩(wěn)定性實驗 取10 mg凍干后的多糖提取物溶于10 mL蒸餾水中,精密量取0.4 mL的樣品溶液,按照1.3.1項下的操作,每0.5 h測一次吸光度值,連續(xù)測定6次,計算RSD值。

1.3.3.3 重復性實驗 制備6份1 mg/mL的樣品溶液,每份精密量取0.4 mL,按“1.3.1”項下分析方法測定吸光度,計算RSD值。

1.3.3.4 加樣回收率 制備1 mg/mL的樣品溶液9份,分別精密加入低、中、高 3 個質(zhì)量濃度 (80 %、100 %、120 %)的樣品溶液,每一質(zhì)量濃度3份,按“1.3.1”項下分析方法測定吸光度,計算回收率和RSD值。

1.3.4 多糖提取的單因素實驗 設置超聲時間、超聲功率、液固比3個因素,進行單因素考察。提取時間固定為40 min、提取溫度固定為25 ℃,液固比固定為30 mL/g后分別設置時間梯度為30、40、50、60、70 min,功率梯度為160、200、240、280、320 W, 液固比梯度為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g,考察3個因素對小葉苦丁茶多糖提取率的影響,確定響應面試驗的提取時間、提取溫度和液固比取值范圍。

1.3.5 響應面優(yōu)化設計 基于上述單因素實驗結(jié)果,挑選對多糖提取率有顯著影響的3個因素,即提取時間、提取功率、液固比,利用軟件Design-Expert 8設計如表1所示分析方案,矩陣組成17組隨機試驗以探究最佳提取條件。

表1 Box-behnken因素水平設計

1.3.6 多糖提取物體外抗氧化實驗 將采用最佳提取工藝提取的小葉苦丁茶多糖配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的多糖樣品溶液。

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力測定 參照宋佳敏等[25]的試驗方法并作適當修改,以測定多糖提取物對DPPH自由基的清除能力。以槲皮素、維生素C為對照品。準確稱取3.94 mg DPPH粉末于50 mL棕色容量瓶中,加無水乙醇溶解,定容,搖勻,即得到0.2 mmol/L的DPPH溶液,避光保存?zhèn)溆?。在試管中加? mL不同濃度的樣品溶液和對照品溶液后加入2 mL DPPH溶液,充分搖勻,暗處反應30 min后,用無水乙醇調(diào)零,在波長為517 nm處測定吸光度,樣品與DPPH溶液反應后吸光度計為(Ax),溶液與DPPH溶液反應后測得的吸光度計為(A0)。每個濃度平行測定3次,取平均值,同時計算每個樣品清除自由基的IC50值(IC50為半抑制濃度,濃度越低表示抗氧化效果越好)。

DPPH清除率 (%) = (A0-Ax/A0) × 100%

1.3.6.2 ABTS自由基的清除能力 參照He等[26]的試驗方法并作適當修改,以測定多糖提取物對ABTS自由基的清除能力。以槲皮素、維生素C為對照品。精密稱取38.4 mg ABTS粉末于10 mL的棕色容量瓶中,用蒸餾水溶解,定容,搖勻,即得7 mmol/L的ABTS儲備液。精密稱取6.623 mg 過硫酸鉀粉末,用蒸餾水溶解后定容至10 mL,即得2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液。將ABTS儲備液與過硫酸鉀溶液等體積混合,暗處反應16 h后,用約20倍體積的磷酸緩沖液稀釋,使其在波長為734 nm處的吸光度在0.7 ± 0.02,即得ABTS+母液。分別量取2 mL不同濃度的樣品溶液和對照品溶液與2 mL ABTS+母液在暗處反應6 min,在波長為734 nm下測定樣品的吸光度(Ax),以無水乙醇代替樣品溶液為空白對照(A0),每個濃度平行測定3次,取平均值,同時計算每個樣品清除自由基的IC50值。

ABTS清除率(%) = (A0-Ax/A0) × 100 %

1.3.6.3 金屬離子螯合測定 參照鄭義等[27]的試驗方法并作適當修改,以測定多糖提取物對金屬離子的螯合能力。以槲皮素、維生素C為對照品。精密稱取2.46 mg菲啰嗪于50 mL的棕色容量瓶中,用蒸餾水溶解,定容,搖勻,即得0.1 mmol/L的菲啰嗪溶液。精密稱取12.7 mg氯化亞鐵粉末于50 mL的棕色容量瓶中,用蒸餾水溶解,定容,搖勻,即得2 mmol/L的氯化亞鐵溶液。分別取1 mL 樣品及對照品溶液加入到1.7 mL蒸餾水中,再與0.5 mL氯化亞鐵溶液和1 mL菲啰嗪溶液均勻混合,靜置反應10 min后,用無水乙醇調(diào)零,在波長為562 nm處測定吸光度,樣品與ABTS反應的吸光度值計為(Ax),無水乙醇與ABTS反應后吸光度計為(A0),每個濃度平行測定3次,取平均值,同時計算每個樣品清除自由基的IC50值。

螯合率 (%) = (A0-Ax/A0) × 100%

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖標準曲線的建立 葡萄糖在濃度為0.02～0.12 mg/mL呈直線關系,如圖1所示。以最小二乘法計算其回歸方程為:y=5.251 8x+0.020 5,相關系數(shù)R2=0.999 3具有顯著相關性。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 方法學考察 方法學驗證結(jié)果表明,精密度實驗RSD值為1.04 %<2 % (n=6), 表明該方法精密度良好;穩(wěn)定性實驗RSD值為1.47 %<2 %(n=6),表明樣品穩(wěn)定;重復性實驗RSD值為1.32 %<2 %(n=6),表明該方法可重復;加樣回收率實驗的高、中、低各個水平的回收率的平均回收率為97.86 %,RSD值為1.16 %;該方法回收率較好。

2.3 多糖提取的單因素實驗結(jié)果 從圖2A可看出小葉苦丁茶多糖提取率與超聲時間密切相關。超聲時間在30～40 min,多糖提取率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢,超聲時間在40 min后,多糖的提取率在不斷下降,由此可判定提取時間為40 min時提取率最高,此時提取率為14.54 %?？紤]到小葉苦丁茶多糖的得率和能源節(jié)約2個方面因素,初步確定最佳超聲時間在40 min。

多糖提取率的高低與液固比密切相關,充足的溶劑是樣品充分浸沒和溶質(zhì)溶出的保證。從圖2B可看出,液固比在10 ～ 30 mL/g,多糖提取率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢,液固比在大于30 mL/g時,多糖的提取率在不斷下降,由此可判定液固比為30 mL/g時提取率最高,此時提取率為14.59 %。綜合各方面因素,初步確定最佳提取液固比在30 mL/g。

從圖2C可看出小葉苦丁茶多糖得率與超聲功率密切相關。超聲功率在160～240 W,多糖提取率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢,超聲功率大于240 W時,多糖的提取率在不斷下降,由此可判定提取功率為240 W時提取率最高,此時提取率為14.64 %?？紤]到小葉苦丁茶多糖的得率和能源節(jié)約2個方面因素,初步確定最佳超聲功率在240 W。

圖2 超聲時間、液固比、功率對提取率的影響

2.4 響應面優(yōu)化設計

Box-Behnken實驗結(jié)果如表2,提取率(W)數(shù)據(jù)使用 Design-Expert 11軟件進行線性回歸方程擬合,得到小葉苦丁茶多糖提取率(W)響應面模型的二次多元線性回歸方程:W=0.15+2.261E-003A+7.735E-004B+1.964E-003C+1.904E-003AB+4.760E-004AC+1.547E-0.03BC-0.014A2-4.677E-003 B2-0.015C2

表2 Box-Behnken實驗結(jié)果

W響應值二次回歸模型方差分析:由表3響應面模型的方差分析與顯著性檢驗可知,該模型相關系數(shù)R2= 0.994 7,說明該模型方程線性關系良好,具有較好的響應值;模型F值為147.05,P<0.000 1,可知該模型顯著,失擬項P=0.194 9(P>0.05)差異不顯著,表明其無統(tǒng)計學意義,從而說明該模型可以對小葉苦丁茶提取物中的多糖提取率(W)進行準確的分析及預測。由表3可知影響實驗響應值綜合評分的F值分別為F(A)=25.30、F(B)=2.96、F(C)=19.08,由此可知對多糖提取率影響因素的大小依次為液固比、提取功率、提取時間;各影響因素的交互作用間的顯著程度依次為AB、BC、AC。

表3 回歸方程方差分析

根據(jù)Design-Expert 11軟件繪制所得二維輪廓圖(圖3)和3D響應曲面(圖4)如下。從等高線圖可看出,3個二維輪廓圖均呈橢圓形,說明3個因素中任意兩個的交互作用對小葉苦丁多糖提取率的影響顯著。響應面結(jié)果用Design Expert軟件優(yōu)化后可知,小葉苦丁茶多糖提取的最佳工藝條件為提取時間41 min,提取功率240 W,液固比31 mL/g,此時最佳提取率為15.20 %。為驗證BBD實驗的可靠性,采用上述最優(yōu)提取條件進行小葉苦丁茶多糖提取,通過6次平行測定,測得小葉苦丁茶多糖的得率分別為15.16 %、15.19 %、15.17 %、15.20 %、15.19 %、15.18 %,該得率與模型預測最大值15.20 %接近,兩者相對誤差小于1 %,說明本響應面試驗優(yōu)化小葉苦丁茶多糖的提取工藝是可行的。

圖3 影響多糖提取率的響應面影響因素之間相互作用的二維輪廓

圖4 響應面影響因素之間的交互作用對多糖提取率的三維曲面

2.5 多糖提取物體外抗氧化實驗 DPPH自由基極其穩(wěn)定,其甲醇溶液呈紫色,抗氧化劑可以通過供氫體將DPPH自由基還原成黃色的二苯肼,導致其在最大波長處的吸光度發(fā)生變化,因此,DPPH自由基清除率通常用于評估該物質(zhì)的抗氧化活性。圖5為多糖提取物及對照品對DPPH自由基的清除率曲線。從圖中可以看出,隨著多糖提取物濃度的增加,其對DPPH自由基的清除率也呈現(xiàn)出不斷上升趨勢,在濃度為0.12 mg/mL時達到平衡,此時清除率最大,最大值為83.56 %,對應的IC50值為47.22 μg/mL。而此時維生素與槲皮素的清除率分別為94.13 %、88.06 %,說明多糖提取物對DPPH自由基清除效果明顯,多糖提取物有明顯的DPPH自由基清除能力。

圖5 小葉苦丁茶多糖提取物對DPPH自由基的清除率

圖6為多糖提取物及對照品對ABTS自由基的清除率曲線。從圖中可以看出,隨著多糖提取物濃度的增加,其對ABTS自由基的清除率也呈現(xiàn)出不斷上升趨勢,在濃度為0.12 mg/mL時達到平衡,此時清除率最大,最大值為81.31 %,對應的IC50值為12.74 μg/mL。其對ABTS自由基的清除率最終保持在80 % 以上,表明多糖提取物具有一定的清除 ABTS 自由基能力,具有較好的體外抗氧化活性。

圖6 小葉苦丁茶多糖提取物對ABTS自由基的清除率

圖7為小葉苦丁茶多糖提取物及對照品對金屬離子的螯合率曲線。由圖可知,在0.2～1.2 mg/mL,多糖提取物對金屬離子的螯合能力不斷增強,在0.12 mg/mL時清除率達到最大,最大值47.49 %,其IC50值為125.54 μg/mL。

圖7 小葉苦丁茶多糖提取物對金屬離子的螯合能力

3 討論

目前,用于評價天然藥物抗氧化活性的方法較多,主要分為體內(nèi)抗氧化活性和體外抗氧化活性研究。相比于體內(nèi)抗氧化研究,體外抗氧化測試操作簡單,成本較低,適用于多種樣品同時分析。但是,體外抗氧化法無法模擬人體的真實生理環(huán)境,且都只測定了抗氧化能力中的某一方面,故無法模擬生理條件下的多種抗氧化途徑。另外,對于復雜樣品,抗氧化物質(zhì)的抗氧化效果無法用單一的機制解釋[28]。

超聲提取法利用超聲波的空化效應、熱效應及機械效應,使多糖分子的運動速度加快,溶劑的穿透力增強,進而增大了多糖提取率。應用此方法提取小葉苦丁茶多糖,具有效率高、節(jié)約時間的優(yōu)點。但是,超聲時間過長,超聲功率過大時,多糖的分子鍵會被超聲波的剪切作用破壞,多糖的提取率會下降[29-30]。此外,適當?shù)囊汗瘫葘τ诙嗵翘崛÷室埠苤匾６嗵菍儆谒苄猿煞?當水被用作溶劑時,多糖分子將繼續(xù)擴散到水中。隨著溶劑用量的增加,多糖的溶解度達到平衡。過高的液固比會使得雜質(zhì)增加,不利于多糖的溶出,從而降低多糖的提取率[31-32]。后期課題組將深入研究,分離純化多糖提取物,以期得到若干高純度的均一多糖,并評價它們的抗氧化活性。本研究將為天然抗氧化劑的篩選以及小葉苦丁茶這一藥食兩用植物的綜合利用提供依據(jù)。

本研究以貴州余慶小葉苦丁茶為原料,利用超聲法對小葉苦丁茶多糖進行提取,通過單因素和響應面實驗優(yōu)化試驗得到其最佳提取工藝為:提取時間41 min,提取功率240 W,液固比31 mL/g。在此條件下,多糖的提取率為15.20 %,相比其他傳統(tǒng)提取方法提取率明顯增加[33]。通過體外抗氧化實驗發(fā)現(xiàn),其對DPPH、ABTS自由基的清除能力以及金屬離子的螯合率均隨小葉苦丁茶多糖提取物濃度的增加而上升,這表明其具有一定的抗氧化活性,有開發(fā)成天然抗氧化劑的潛能。