高彤 李明桂 梁水明 范麗佳 王長麗

摘?要：目的：構(gòu)建、篩選并鑒定出重組GFP唾液乳桿菌CCFM6105。方法：利用GFP作為報告基因，從攜帶gWizGFP質(zhì)粒的大腸桿菌中提取質(zhì)粒，將gWizGFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至唾液乳桿菌CCFM6105中，構(gòu)建GFP唾液乳桿菌。結(jié)果：PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示約在750bp處出現(xiàn)明亮條帶，PCR反應(yīng)成功；在1800V電壓下的菌落熒光暗沉；在2400V電壓下的菌落熒光致密明亮；在2200V、2600V電壓下菌落熒光偏暗；各代重組菌的GFP表達良好且無明顯減弱。結(jié)論：本實驗成功構(gòu)建GFP唾液乳桿菌CCFM6105且GFP在唾液乳桿菌在穩(wěn)定遺傳中得到了穩(wěn)定的表達。

關(guān)鍵詞：唾液乳桿菌；綠色熒光蛋白；電轉(zhuǎn)化

Construction?of?GFP?Lactobacillus?Salivarius?CCFM6105

Gao?Tong1?Li?Minggui1?Liang?Shuiming1?Fan?Lijia1?Wang?Changli2*

1.Youjiang?Medical?College?for?nationalities，School?of?clinical?medicine?GuangxiBaise?533000；

2.Youjiang?Medical?College?for?nationalities，Medical?laboratory?College?GuangxiBaise?533000

Abstract：Objective：To?construct，screen?and?identify?recombinant?GFP?Lactobacillus?salivarius?CCFM6105.Methods：using?GFP?as?the?reporter?gene，the?plasmid?was?extracted?from?E.coli?carrying?gWiz?GFP?plasmid，and?the?gWiz?GFP?plasmid?was?electrotransformed?into?L.salivarius?CCFM6105?to?construct?L.salivarius?GFP.Results：The?electrophoresis?results?of?PCR?products?showed?that?a?bright?band?appeared?at?about?750bp，and?the?PCR?reaction?was successful；Colony?fluorescence?darkening?at?1800V?voltage；The?colony?fluorescence?was?dense?and?bright?at?2400V?voltage；The?colony?fluorescence?was?dark?at?2200V?and?2600V；The?expression?of?GFP?in?the?recombinant?strains?of?each?generation?was?good?without?obvious?weakening.Conclusion：In?this?experiment，GFP?in?L.salivarius?CCFM6105?was?successfully?constructed?and?GFP?in?L.salivarius?was?stably?expressed?in?the?stable?genetic.

Keywords：Lactobacillus?salivarius；Green?fluorescent?protein；Electroconversion

乳酸桿菌（Lactobacillus，Lac）是一類能利用糖類產(chǎn)生乳酸的細菌，且可與人或獸在體內(nèi)長期共存的一種微生物，其對腸道上皮細胞具有很強的黏附力，具有促進機體體液和細胞免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群、維持菌群微生態(tài)平衡的作用［13］。乳酸菌作為可食用益生菌，它的益生功能與其能否通過口服進入動物體內(nèi)及運動分布情況密不可分。目前，對乳酸桿菌的研究主要集中在宿主生理和微生物菌群變化上，尚缺乏對菌株進入腸道后分布、運動及其定植的系統(tǒng)的針對性研究。細菌質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，它可以將目標基因攜帶到受體細胞中，促進目標基因在受體中的表達［2］。綠色熒光蛋白（Green?fluorescent?protein，簡稱GFP）是一種實驗中常用的報告基因，分子量通常較小。因其能與多種蛋白質(zhì)端結(jié)合且不破壞原始蛋白、細胞上可穩(wěn)定表達、熒光強且易于檢測等一系列優(yōu)良特性，故GFP是一種理想實驗觀察效果極佳的熒光標記物［2］。國內(nèi)已有大量研究學(xué)者對GFP進行廣泛且多維度的實驗室應(yīng)用：薩初拉［4］等采用GFP作為報告基因為構(gòu)建植物乳桿菌高效特異表達載體；方來杉［5］等利用GFP作為標識研究乳桿菌在疫苗制備的用途等相關(guān)領(lǐng)域的研究，在GFP的標識下均取得了不錯的實驗觀察效果。因此，本研究將經(jīng)過GFP基因修飾的質(zhì)粒利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入Lac中，構(gòu)建GFP唾液乳桿菌，為研究唾液乳桿菌定植、動態(tài)監(jiān)測和口服免疫機制奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗菌種、主要試劑、培養(yǎng)基和儀器

唾液乳桿菌（Lactobacillus?salivarius）CCFM6105、攜帶gWizGFP質(zhì)粒且具有卡那霉素抗性的大腸桿菌DH5α、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、PBS液、卡那霉素、限制性核酸內(nèi)切酶（BamH?I和Sal?I）、蔗糖、甘油、SMRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基。電轉(zhuǎn)化杯（規(guī)格0.2cm）、購自BioRad公司的電穿孔儀、LRH250型生化培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱和水浴鍋、冰盒、XS212型光學(xué)顯微鏡、PCR儀、TDL5型臺式離心機、共聚焦顯微鏡。

1.2?攜帶gWizGFP質(zhì)粒的大腸桿菌的活化和復(fù)壯

取攜帶在-80℃冰箱中g(shù)WizGFP質(zhì)粒的大腸桿菌甘油管（菌液∶甘油=1∶1）進行活化和復(fù)壯，取復(fù)壯后菌液于超凈工作臺內(nèi)轉(zhuǎn)接至100mL/250mL?LB培養(yǎng)基，37℃、160r/min震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取100μL原始菌液，對試管依次標記：試管1—6，稀釋濃度：10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。取100μL稀釋后菌懸液涂布在含Kanr培養(yǎng)皿（每個梯度3個），恒溫過夜培養(yǎng)。36h～48h后，挑選培養(yǎng)基內(nèi)長勢較好菌落數(shù)在30～300范圍內(nèi)的進行傳代培養(yǎng)。

1.3?提取大腸桿菌的gWizGFP質(zhì)粒

添加50μL/mg?LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，取OD600≥1.6狀態(tài)下的大腸桿菌菌液提取質(zhì)粒備用。試劑盒提取質(zhì)粒gWizGFP作為模板，GFPup和GFPdown為引物進行擴增，具體擴增程序參照楊明陽［6］、張瑩［7］等實驗內(nèi)容，應(yīng)用電泳檢測擴增產(chǎn)物。

設(shè)計引物、PCR擴增GFP基因片段、測序鑒定：登錄GenBank中查詢GFP基因（GFP）的開放閱讀框架（ORF）序列信息，分析（圖1）選取存在gWiz質(zhì)粒上啟動子后限制性核酸內(nèi)切酶（BamH?I和Sal?I），酶切位點插入引物兩端，添加保護序列。應(yīng)用primer5.0設(shè)計1對特異性引物進行驗證：

1.4?唾液乳桿菌感受態(tài)細胞的制備及電轉(zhuǎn)化實驗

感受態(tài)細胞的制備詳細參照方來杉［5］、張瑩［7］等實驗，電轉(zhuǎn)化實驗在其他條件不變的情況下電壓設(shè)置四個梯度（1800/2000/2400/2600V），確定唾液乳桿菌最適的轉(zhuǎn)化電壓。電轉(zhuǎn)化對陽性轉(zhuǎn)化子（在熒光顯微觀察有熒光的菌落則為陽性）進行計數(shù)，計算出四個電壓梯度下的轉(zhuǎn)化效率并分析。

1.5?檢測構(gòu)建的GFP唾液乳桿菌的純化度與穩(wěn)定度

通過稀釋法把菌液用NS進行稀釋，取10-1、l0-4、10-6稀釋度的菌液少許均勻涂在有抗體的MRS平板上。在37℃厭氧條件下培養(yǎng)36～48h，觀察并挑選長勢良好的轉(zhuǎn)化子繼續(xù)培養(yǎng)10代，純化篩選出穩(wěn)定表達綠色熒光的唾液乳桿菌。

2?結(jié)果

2.1?gWizGFP質(zhì)粒的大腸桿菌的活化與復(fù)壯結(jié)果

連續(xù)傳代結(jié)果表明：大腸桿菌從第1—4代培養(yǎng)基的生長速度稍慢，需要24～36h才能生長出明顯的菌落。隨著菌株繼代培養(yǎng)，生長速度顯著加快，第8代后約12～16h可見清晰的菌落。挑選生長良好的gWizGFP質(zhì)粒大腸桿菌進行液體震蕩培養(yǎng)，隨著時間的增長，通過圖2可以看出，培養(yǎng)基中菌落的生長規(guī)律表現(xiàn)為先上升后趨于平穩(wěn)，當OD值<6h時，出現(xiàn)一個生長期，緩慢增加；當6h<OD值<18h時，呈對數(shù)期快速增長，OD值>18h后增長速度逐漸達到平穩(wěn)期，菌落的活性逐漸恢復(fù)。

2.2?在大腸桿菌中GFP基因的遺傳與表達情況

如圖3所示，可在共聚焦顯微鏡下觀察到攜帶gWizGFP質(zhì)粒的大腸桿菌活化后的GFP能夠穩(wěn)定表達，表明大腸桿菌的活性得到很好的恢復(fù)。

2.3?GFP基因的擴增結(jié)果

如圖4所示，PCR反應(yīng)中出現(xiàn)了雙酶切質(zhì)粒、擴增驗證GFP條帶、另有一條清晰條帶在約5000bp處、一條約750bp處。750bp處出現(xiàn)與預(yù)期片段大小一致的明亮條帶，說明PCR反應(yīng)成功，測定PCR產(chǎn)物與T載體的結(jié)果與GeneBank中GFP序列達100%。

2.4?唾液乳桿菌的電轉(zhuǎn)化結(jié)果

圖5所示，唾液乳桿菌在其他條件不變的情況下，在1800V電壓下的菌落熒光暗沉；在2400V電壓下的菌落熒光致密明亮；在2200V、2600V電壓下菌落熒光偏暗。由圖6可看出，故電轉(zhuǎn)化效率在2400V時最高，表明該電壓為本實驗電轉(zhuǎn)化實驗的四個電壓中最適轉(zhuǎn)化電壓。

2.5?轉(zhuǎn)化子的熒光蛋白表達情況

把1—8代的轉(zhuǎn)化子液體震蕩培養(yǎng)，取OD=0.6的菌液稀釋10-2倍，將稀釋后的菌液滴在3個玻片上進行熒光檢測，把每個在顯微鏡下玻片的視野均等劃分為25塊，每個視野隨機取1塊，計算3塊視野的取樣平均值繪圖（圖7）比較發(fā)現(xiàn)，1—8代轉(zhuǎn)化子在共聚焦顯微鏡下GFP表達良好，表明在菌株的繁衍過程中GFP的表達未出現(xiàn)明顯的漸弱或丟失，工程菌株構(gòu)建成功。

3?討論

唾液乳桿菌是一種細胞壁較厚的革蘭氏陽性菌，外源DNA轉(zhuǎn)移到唾液乳桿菌的效率低下［8］。利用電轉(zhuǎn)化法可以提高外源DNA轉(zhuǎn)移到唾液乳桿菌細胞轉(zhuǎn)化效率，并且相對穩(wěn)定［9］。細胞膜表面在電擊時會形成臨時孔隙，外來分子可經(jīng)孔隙進入受體細胞，若電壓過低，在細胞膜上難以形成適配的孔隙，外來分子難以轉(zhuǎn)入；電壓過高，細胞膜上形成的孔隙因增大而造成細胞膜通透性增加，外來分子更易進入細胞；而超過細胞的承受力的電壓則直接導(dǎo)致細胞破裂死亡［1011］，所以適當?shù)碾妷捍碳ぶ陵P(guān)重要。目前，大多數(shù)實驗者使用1600V到7kV的電壓，唾液乳桿菌一般在2400V～3200V電壓下，可以取得較好的轉(zhuǎn)化率［8］。近年來，通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)化方法，各類細菌的電轉(zhuǎn)化所需電壓存在明顯差異。韋云瑩等［12］利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌的電轉(zhuǎn)化條件，其中電壓強度為15kV/cm；在10kV/cm時，乳酸乳球菌NZ9000的電轉(zhuǎn)化效率達到最佳［13］。乳酸菌種類繁多，有研究發(fā)現(xiàn)在同樣的參數(shù)下，不同乳酸菌的最佳電轉(zhuǎn)化效率亦不盡相同，譬如唾液乳桿菌AR809與AR612相比，轉(zhuǎn)化效率差異明顯［9］，不同菌種的轉(zhuǎn)化能力差異或與菌株的特異性有關(guān)；同時乳酸菌的電轉(zhuǎn)化效率亦受質(zhì)粒濃度的影響，在一定濃度范圍內(nèi)質(zhì)粒濃度提高，電轉(zhuǎn)化效率亦相對應(yīng)地提高，當轉(zhuǎn)化效率超過一定范圍后會有不同程度的降低［1213］。綜上，乳桿菌的電轉(zhuǎn)化需要依據(jù)具體的菌株設(shè)立有效的轉(zhuǎn)化方法，除上述因素外，影響電轉(zhuǎn)化效率的因素還包括細菌的生理狀態(tài)、復(fù)蘇時間、質(zhì)粒大小等。

本研究構(gòu)建出了攜帶gWizGFP基因的唾液乳桿菌，結(jié)果表明重組的菌株在遺傳8代仍能穩(wěn)定表達，但重組菌進入機體后是否會影響細菌本身的復(fù)制以及GFP的表達都還未可知，有待深入實驗考究。

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基金項目：廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目（2020KY13007）；自治區(qū)教育廳2021年和2022年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S202110599090、S202210599042）；右江民族醫(yī)學(xué)院2021年度校級科研課題（yy2021sk063）；2021年右江民族醫(yī)學(xué)院“新啟航”青年骨干項目

作者簡介：高彤（2000—?），女，廣西桂林人，本科在讀，研究方向：臨床醫(yī)學(xué)。

*通訊作者：王長麗（1992—?），女，廣西南寧人，研究生，講師，研究方向：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、微生物資源挖掘與利用。