賁海燕,郝永娟,霍建飛,姚玉榮,王萬立
(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,天津 300384)
草莓白粉病病原菌為真菌子囊菌亞門單囊殼屬羽衣草單囊殼菌(Sphaerotheca aphanis),為專性寄生菌。我國(guó)于1959 年首次在原沈陽農(nóng)學(xué)院溫室草莓上發(fā)現(xiàn)白粉病[1]。近年來國(guó)內(nèi)草莓白粉病害愈發(fā)嚴(yán)重,尤其是保護(hù)地草莓白粉病,從苗期到果實(shí)成熟期不間斷發(fā)生,特別是適宜采摘的‘紅顏’‘章姬’等品種對(duì)草莓白粉病較為敏感,設(shè)施栽培重茬連作棚架及土壤中病原菌積累,以及棚室通風(fēng)透光性差、種植密度大,棚內(nèi)適溫高濕等原因,致使草莓白粉病發(fā)病早且重,一般減產(chǎn)20%~30%,重則減產(chǎn)可達(dá)50%、甚至絕收,嚴(yán)重影響了草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。天津地區(qū)多為鹽堿地,草莓不耐鹽堿,管理不到位,植株生長(zhǎng)受阻很容易發(fā)生白粉病。目前,對(duì)草莓白粉病病原菌的研究報(bào)告較少[3-4],針對(duì)草莓白粉病菌生物學(xué)特性的研究更是鮮見報(bào)道,為進(jìn)一步明確草莓白粉病菌分生孢子生物學(xué)性狀,本研究在室內(nèi)對(duì)分生孢子在不同溫度、濕度、光照、碳源等條件下的萌發(fā)率、芽管長(zhǎng)度進(jìn)行研究,以期為草莓白粉病流行規(guī)律研究、藥劑篩選及病害防治提供理論依據(jù)。
供試草莓白粉病菌(Sphaerotheca aphanis(Wall.)Braun)為天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害室采自感病品種純化后活體保存的菌株。
1.2.1 pH 值對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響 在無菌條件下,用滅菌解剖刀切下約4 cm2的2%水瓊脂培養(yǎng)基塊,置于載玻片上。將草莓病果表面的新鮮白粉病菌用滅菌毛刷刷至pH 值分別為4、5、6、7、8、9、10 的無菌水溶液內(nèi),取10 μL 滴在水瓊脂塊表面,蓋上蓋玻片,將載玻片置于有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi),每組處理3 次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),分別在0、18、24、48 h 取出,并用光學(xué)顯微鏡觀察分生孢子的萌發(fā)情況:芽管長(zhǎng)度超過分生孢子短徑的1/2 記為萌發(fā),于20×10 倍顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)數(shù),每視野40~50 個(gè)分生孢子,隨機(jī)取5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)分生孢子的萌發(fā)率并測(cè)量芽管長(zhǎng)度。
0 h 為試驗(yàn)處理前初始孢子萌發(fā)率(以下同)。為準(zhǔn)確的表示各處理真實(shí)的孢子萌發(fā)情況,處理前需統(tǒng)計(jì)已萌發(fā)的孢子數(shù)量,即0 h 觀察記錄的初始孢子萌發(fā)數(shù)量,再分別用培養(yǎng)18、24、48 h 的孢子萌發(fā)率減去未處理的初始萌發(fā)率作為最終的萌發(fā)率結(jié)果。
1.2.2 碳源對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響 配制2%葡萄糖培養(yǎng)基(每100 mL 2%水瓊脂中加入2 g 葡萄糖)、2%蔗糖培養(yǎng)基(每100 mL 2%水瓊脂中加入2 g 蔗糖)、2%果糖培養(yǎng)基(每100 mL 2%水瓊脂中加入2 g 果糖)、2%淀粉培養(yǎng)基(每100 mL 2%水瓊脂中加入2 g 淀粉);用新鮮草莓果肉搗碎、紗布過濾,獲得草莓煮沸汁液備用。采用瓊脂培養(yǎng)法,在無菌條件下,將各處理培養(yǎng)基融化后,倒入滅菌培養(yǎng)皿中一薄層(厚度約為2~3 mm),待凝固后用滅菌解剖刀切下約4 cm2的培養(yǎng)基小塊,置于載玻片上,并將事先準(zhǔn)備的草莓白粉病果上的霉層直接蘸取到培養(yǎng)基表面上待用。
試驗(yàn)設(shè)6 個(gè)處理,以只加蒸餾水的2%水瓊脂玻片為對(duì)照,各處理培養(yǎng)基蘸取白粉病菌霉層后分別進(jìn)行如下處理:①2%葡萄糖培養(yǎng)基滴加10 μL 蒸餾水;②2%蔗糖培養(yǎng)基滴加10 μL 蒸餾水;③2%果糖培養(yǎng)基滴加10 μL 蒸餾水;④2%淀粉培養(yǎng)基滴加10 μL 蒸餾水;⑤2%水瓊脂培養(yǎng)基滴加10 μL 草莓汁煮沸液;⑥2%水瓊脂培養(yǎng)基滴加10 μL 蒸餾水(CK),各處理完成后蓋上蓋玻片。每組處理3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同1.2.1,于0、18、24、48 h 取出鏡檢,隨機(jī)取5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率并測(cè)量芽管長(zhǎng)度。
1.2.3 不同光照條件對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響 取10 μL 白粉病菌孢子懸浮液(濃度為1×105個(gè)孢子·mL-1,pH 為7)接種于2%葡萄糖培養(yǎng)基玻片上,分別進(jìn)行24 h 黑暗、24 h 光照、12 h 黑暗-12 h 光照3 個(gè)處理,每處理3 次重復(fù),在溫度為25 ℃、相對(duì)濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)同1.2.2。
1.2.4 溫度對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響
(1)不同溫度對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響。取孢子濃度為1×105個(gè)孢子·mL-1的懸浮液10 μL,接種于2%葡萄糖培養(yǎng)基玻片上,分別置于5、15、20、25、30、35 ℃,相對(duì)濕度100%、全光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每處理3 次重復(fù),于0、18、24、48 h取出在顯微鏡下觀察,隨機(jī)取5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)率并測(cè)量芽管長(zhǎng)度。
(2)草莓白粉病菌分生孢子致死溫度測(cè)定。刷取發(fā)病草莓葉片上白粉病菌制成pH 為7、孢子濃度為1×105個(gè)孢子·mL-1的孢子懸浮液,分別置于35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45 ℃的水浴鍋中,懸浮液達(dá)目標(biāo)溫度后保持恒溫水浴10 min 后,取10 μL接種于2%葡萄糖培養(yǎng)基玻片上;對(duì)照不進(jìn)行水浴處理,在溫度為25 ℃、相對(duì)濕度100%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以上處理均重復(fù)4 次。分別在0、24 h 時(shí)取出,于20×10 倍顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)數(shù),芽管長(zhǎng)度超過分生孢子短徑的1/2 記為萌發(fā),每視野40~50 個(gè)分生孢子,隨機(jī)取5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。
1.2.5 濕度對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響利用飽和鹽溶液使干燥器的相對(duì)濕度分別控制在100%、92%、81%、67%、52%、34%、20%共7 個(gè)處理,將10 μL、孢子濃度1×105個(gè)孢子·mL-1的菌懸液接種于2%水瓊脂玻片上,置于不同相對(duì)濕度的干燥器中,密閉后25 ℃、全光照培養(yǎng),分別在0、18、24、48 h 取出鏡檢,每個(gè)處理3 次重復(fù)。萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)同1.2.2。
使用Excel 2010 和SPSS 22.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan’s multiple range test 進(jìn)行多組樣本間的差異顯著性分析。
由圖1 可知,草莓白粉病菌分生孢子在pH 值5~10 下均有不同程度萌發(fā)。當(dāng)培養(yǎng)18 h,在pH 值6~8 處理環(huán)境下,分生孢子整體萌發(fā)率高于其他處理;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各處理孢子萌發(fā)呈上升趨勢(shì)。培養(yǎng)48 h 后,pH 值為7 的孢子萌發(fā)率最高,值為44.7%,其次是pH 值為8 的處理值為26.4%,pH值為5 和10 處理的孢子萌發(fā)率最低,僅為2.2%~2.6%,而pH 值為4 處理,未見孢子萌發(fā)。
圖1 pH 值對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響
由圖2 可知,酸堿環(huán)境對(duì)孢子芽管長(zhǎng)度的影響存在差異,其中pH 值為7 和8 環(huán)境培養(yǎng)18 h 的芽管長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于其他處理,且各處理芽管長(zhǎng)度與培養(yǎng)時(shí)間呈正比。當(dāng)培養(yǎng)48 h 時(shí),pH 值為7 處理的芽管長(zhǎng)度最長(zhǎng)達(dá)484.25 μm,且偏堿性環(huán)境下更有利于芽管伸長(zhǎng)。以上結(jié)果表明,pH 值為6~8 的環(huán)境條件下更有利于草莓白粉病菌分生孢子的萌發(fā)及芽管的生長(zhǎng),最適pH 值為7。
圖2 pH 值對(duì)草莓白粉病菌芽管伸長(zhǎng)的影響
由不同碳源條件培養(yǎng)草莓白粉病菌分生孢子的試驗(yàn)結(jié)果(圖3、圖4)可知,各處理的孢子萌發(fā)率、芽管長(zhǎng)度與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)。各處理對(duì)孢子萌發(fā)的影響存在顯著差異(圖3)。培養(yǎng)18 h 后,草莓汁煮沸液的萌發(fā)率最高,其次是2%葡萄糖培養(yǎng)處理,顯著高于2%淀粉培養(yǎng)基和2%果糖培養(yǎng)基的萌發(fā)率;隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)萌發(fā)率上升,當(dāng)培養(yǎng)48 h,2%葡萄糖培養(yǎng)基處理的萌發(fā)率最高達(dá)47.96%,此時(shí)草莓汁煮沸液和2%蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)處理的孢子萌發(fā)率也能達(dá)到39.07%和36.53%,明顯高于水瓊脂對(duì)照處理的萌發(fā)率,而2%果糖和2%淀粉處理對(duì)孢子萌發(fā)抑制作用顯著,低于對(duì)照處理的萌發(fā)率。
圖3 不同碳源條件對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響
由圖4 可知,各處理芽管萌發(fā)長(zhǎng)度與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)。培養(yǎng)18 h 后,以蔗糖為碳源處理的孢子芽管長(zhǎng)度最長(zhǎng),平均值達(dá)(260.9±6.4)μm;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),以葡萄糖為碳源處理的芽管長(zhǎng)度迅速增長(zhǎng),培養(yǎng)24、48 h 的芽管平均長(zhǎng)度分別為(350.8±9.6)μm 和(500.7±10.1)μm,蔗糖處理次之,顯著長(zhǎng)于對(duì)照處理及其他處理;以草莓果汁、果糖、淀粉為碳源的處理對(duì)芽管伸長(zhǎng)有一定抑制作用,與對(duì)照處理相比,芽管生長(zhǎng)緩慢,培養(yǎng)48 h 的芽管平均長(zhǎng)度分別為(191.0±2.4)μm、(167.0±4.9)μm 和(140.6±6.0)μm,與對(duì)照處理相比,芽管長(zhǎng)度短了(160.1~210.4)μm。由此可見,草莓白粉病菌分生孢子在以葡萄糖為碳源的條件下有較強(qiáng)的適應(yīng)性。
圖4 不同碳源條件對(duì)草莓白粉病菌芽管萌發(fā)的影響
將結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析,結(jié)果表明不同光照條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響存在顯著差異。由圖5 可知,連續(xù)24 h 光照處理的孢子萌發(fā)率顯著高于連續(xù)24 h 黑暗處理的萌發(fā)率,光照處理組的萌發(fā)率可達(dá)44.40%;24 h 黑暗處理的孢子萌發(fā)率顯著高于12 h黑暗-12 h 光照處理的萌發(fā)率。由圖6 可知,24 h 光照處理與24 h 黑暗處理的孢子芽管長(zhǎng)度差異不顯著,但顯著長(zhǎng)于12 h 黑暗-12 h 光照處理組。
圖5 光照對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的影響
圖6 光照對(duì)草莓白粉病菌孢子芽管長(zhǎng)度的影響
2.4.1 不同溫度對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響 由不同溫度對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響的試驗(yàn)結(jié)果(圖7)可知,不同培養(yǎng)溫度對(duì)孢子萌發(fā)有顯著影響。培養(yǎng)18 h 后,25 ℃培養(yǎng)條件下,孢子萌發(fā)率為20.41%,顯著高于其他處理;10、15、35 ℃條件下,對(duì)孢子萌發(fā)抑制作用明顯,萌發(fā)率為1.26%~2.15%;5 ℃條件下,未見孢子萌發(fā)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),15~30 ℃培養(yǎng)處理的孢子萌發(fā)數(shù)量逐漸增多,其中25 ℃培養(yǎng)處理的孢子萌發(fā)率增幅最大,培養(yǎng)48 h 的孢子萌發(fā)率達(dá)44.13%,其次是20、30 ℃培養(yǎng)處理,萌發(fā)率分別為28.42%、20.7%;而5、10、35 ℃培養(yǎng)處理的孢子萌發(fā)受限,萌發(fā)率在3.14%以下。
圖7 溫度對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)的影響
不同溫度條件下,草莓白粉病菌的芽管長(zhǎng)度明顯不同。整個(gè)培養(yǎng)過程中,25、30 ℃條件下,芽管長(zhǎng)度較長(zhǎng),培養(yǎng)48 h 的芽管長(zhǎng)度分別為481.18、472.98 μm,顯著長(zhǎng)于其他溫度處理;其次是20 ℃條件下,培養(yǎng)48 h的芽管長(zhǎng)度為410.27 μm;而5~15 ℃及35 ℃條件下芽管伸長(zhǎng)受到抑制,培養(yǎng)48 h 的芽管長(zhǎng)度在274.64 μm 以下。
圖8 溫度對(duì)草莓白粉病菌芽管長(zhǎng)度的影響
2.4.2 草莓白粉病菌分生孢子致死溫度的測(cè)定從表1 結(jié)果能夠看出,35、36 ℃培養(yǎng)處理24 h 的孢子萌發(fā)率已經(jīng)很低,萌發(fā)率僅為2.79%~3.16%;隨著溫度升高,萌發(fā)率降低,當(dāng)溫度為41 ℃時(shí)萌發(fā)率幾乎接近于零,但仍有2 次重復(fù)的顯微鏡觀察視野中有零星萌發(fā)的孢子,而42 ℃及以上溫度處理,孢子未見萌發(fā),完全受到抑制。以上結(jié)果說明,42 ℃為草莓白粉病菌致死溫度的臨界溫度。
表1 不同溫度處理對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響
由試驗(yàn)結(jié)果(圖9)可知,不同相對(duì)濕度處理對(duì)草莓白粉病菌分生孢子的萌發(fā)有顯著影響,且各處理之間的差異較大。培養(yǎng)18 h 后,相對(duì)濕度為92%的處理萌發(fā)率最高達(dá)22.04%,與相對(duì)濕度為100%處理的萌發(fā)率相當(dāng),顯著高于其他處理;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)萌發(fā)率整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。培養(yǎng)48 h 后,相對(duì)濕度為92%、100%的處理萌發(fā)率分別達(dá)37.35%、40.88%,而相對(duì)濕度為20%~67%的處理萌發(fā)率為5.11%~15.80%,對(duì)白粉菌孢子的萌發(fā)抑制作用明顯。
圖9 濕度對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)率的影響
不同濕度環(huán)境下草莓白粉病菌的芽管長(zhǎng)度顯著不同(圖10),整個(gè)培養(yǎng)過程中相對(duì)濕度92%~100%的芽長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于其他處理,培養(yǎng)18 h 的芽管長(zhǎng)度分別為386.93、397.74 μm;隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,芽管逐漸伸長(zhǎng),其中相對(duì)含水量81%~100%的芽管增長(zhǎng)幅較大,培養(yǎng)48 h 芽管長(zhǎng)度為408.75~437.99 μm,其次是相對(duì)濕度52%~67%,而相對(duì)濕度20%~34%的芽管伸長(zhǎng)顯著受到抑制,長(zhǎng)度分別為283.99、289.60 μm。
圖10 濕度對(duì)草莓白粉病菌芽管長(zhǎng)度的影響
草莓白粉病是設(shè)施草莓栽培的主要病害,草莓白粉病病原菌為Sphaerotheca aphanis,楊俊譽(yù)等[2]通過DNA 分子檢測(cè),證實(shí)S.aphanis 與P.aphanis 的同源性為100%;Pei 等[5]首次報(bào)道華中地區(qū)的草莓白粉病菌為Golovinomyces orontii。本研究采用的白粉病菌是由草莓果實(shí)上采集保存而來,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為羽衣草單囊殼菌Sphaerotheca aphanis。國(guó)內(nèi)關(guān)于草莓白粉病菌的報(bào)道多見于發(fā)生情況與防治技術(shù)方面,如王偉群等[3]、王璐等[4]報(bào)道了田間草莓白粉病發(fā)生的影響,而目前未見其生物學(xué)特性方面的研究[6]。本研究擬通過對(duì)草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)條件的摸索,為草莓白粉病的物理和化學(xué)防治提供新思路。接種初期孢子能否萌發(fā)對(duì)接種成功有著至關(guān)重要的作用,對(duì)品種抗病性鑒定、室內(nèi)藥劑篩選均有影響[7-9]。草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的條件中,溫度與其他單囊殼白粉菌基本相似[10-12],分生孢子萌發(fā)最適溫度為25 ℃,溫度過高或過低均會(huì)導(dǎo)致分生孢子萌發(fā)率下降,筆者在研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度低于10 ℃或高于35 ℃以上,草莓白粉病菌孢子活性受到抑制,萌發(fā)率大幅降低,芽管伸長(zhǎng)也受到限制,當(dāng)溫度高于42 ℃處理10 min,孢子停止萌發(fā)。因此,在草莓白粉病預(yù)防中,在晴朗天氣持續(xù)進(jìn)行高溫悶棚,使棚室溫度達(dá)到42 ℃以上孢子致死高溫,可抑制白粉病菌分生孢子的萌發(fā),從而控制白粉病的發(fā)生。相對(duì)濕度為81%~100%的高濕環(huán)境有利于草莓白粉病菌孢子的萌發(fā)和芽管的伸長(zhǎng),濕度越大越有利于孢子萌發(fā)侵染,而低濕度環(huán)境對(duì)孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)抑制作用明顯。環(huán)境pH值也是影響白粉病菌孢子萌發(fā)的重要因素,通常白粉病菌分生孢子的酸堿度適應(yīng)范圍較廣。苦瓜白粉病分生孢子萌發(fā)最適pH 值為5~9[13]、煙草白粉病病原菌在pH 值5~8 內(nèi)的萌發(fā)率較高[14],番茄白粉病病原新番茄粉孢菌在pH 值為3~12 的條件下分生孢子萌發(fā)率較高[15]。本研究發(fā)現(xiàn),草莓白粉病菌分生孢子在pH 值為6~8 的環(huán)境下萌發(fā)率相對(duì)較高,且弱堿環(huán)境的孢子萌發(fā)率高于酸性環(huán)境的萌發(fā)率。當(dāng)pH 值為7 時(shí),最適合孢子萌發(fā)及芽管伸長(zhǎng)。因此,噴施中性水,使草莓植株處于中性環(huán)境條件,更有利于草莓白粉病菌的擴(kuò)繁、傳播,以及病原菌活體保存。而pH 值在5 以下或pH 值為9 以上的酸堿環(huán)境對(duì)草莓白粉病菌孢子萌發(fā)抑制作用明顯。白粉病菌對(duì)光照敏感性差異較大,苦瓜白粉病菌分生孢子萌發(fā)最適條件是全黑暗[13],煙草白粉病菌受光照時(shí)長(zhǎng)的影響差異不大[14-16]。完全光照條件下,更有利于草莓白粉病菌的孢子萌發(fā),萌發(fā)率顯著高于完全黑暗及黑暗-12 h 光照處理的萌發(fā)率,而孢子芽管長(zhǎng)度受完全光照或完全黑暗處理的影響差異不顯著。在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用方面,草莓白粉病菌更喜歡利用葡萄糖促進(jìn)其孢子萌發(fā)及芽管伸長(zhǎng),而在以果糖和淀粉為碳源的條件下草莓白粉病菌的適應(yīng)性較差。
草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)的最適溫度、致死溫度分別為25 ℃、42 ℃,喜高濕、中性環(huán)境,喜葡萄糖,光照有利于草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)。因此,生產(chǎn)中可降低棚室內(nèi)相對(duì)濕度,保持葉片、果實(shí)表面無水滴等防治草莓白粉病。生產(chǎn)空閑期間,選擇晴朗的高溫天氣進(jìn)行高溫悶棚,關(guān)閉通風(fēng)口充分密閉棚室,使土壤及棚室內(nèi)環(huán)境溫度達(dá)到病原菌致死高溫,充分切斷內(nèi)部傳染源,從而達(dá)到物理預(yù)防和控制的目的[17-18]。