咳露口服液指紋圖譜的建立及6種成分的含量測(cè)定

賀敬霞,許 剛,黨艷妮,王曉梅,張 鑫,王 青,劉 峰*

1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院, 咸陽(yáng) 712042;2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司, 西安 710075

咳露口服液是由陜西步長(zhǎng)制藥有限公司研制的中藥大品種復(fù)方制劑,由黃芩、川貝母、枇杷葉、紫菀、甘草等8種中藥制成,具有化痰、止咳、平喘等功效,臨床效果良好,可用于治療支氣管肺炎、細(xì)菌性肺炎等引起的咳嗽、咳痰等[1-3]。其不良反應(yīng)小,安全性高,有效治愈率達(dá)98%[4]。既可發(fā)揮中樞神經(jīng)性止咳作用,又可發(fā)揮外周神經(jīng)性止咳作用。雙管齊下,雙效止咳。同時(shí)其含有多種成分,可作用于咳嗽反射各個(gè)環(huán)節(jié),多管齊下,多點(diǎn)作用,使止咳排痰作用更加全面[5]。咳露口服液作為中藥復(fù)方,藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的關(guān)鍵領(lǐng)域,是決定中藥安全性、有效性和質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。但中藥復(fù)方的復(fù)雜性和多樣性是中藥現(xiàn)代化研究的難點(diǎn)。鑒于此,關(guān)于化學(xué)組分,研究者提出多種中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究理論,如“組分結(jié)構(gòu)”理論、“基于成分敲除/敲入的中藥藥效物質(zhì)辨識(shí)與質(zhì)量控制模式”的研究理論、“等效成分群”理論[6-7]。這些理論的建立都需要進(jìn)行基礎(chǔ)組分研究。同時(shí)指紋圖譜的建立是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中質(zhì)量控制的重要方法之一。指紋圖譜結(jié)合多成分定量分析的中藥質(zhì)量控制新模式,解決了從整體上全面控制中藥質(zhì)量的方法學(xué)問(wèn)題。故進(jìn)行咳露口服液基本物質(zhì)基礎(chǔ)研究,并建立指紋圖譜方法,確保藥物安全有效,質(zhì)量可控。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H-class超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);KUDOU超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);MS430TS電子天平和XPE205電子天平均購(gòu)自梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Merck Milli-Q純水儀(默克化工技術(shù)上海有限公司)。

1.2 試藥

甲醇、乙腈[GR,塞默飛世爾科技(中國(guó))有限公司];甲醇(AR,國(guó)家化學(xué)集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、磷酸(AR,天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)。

漢黃芩苷(批號(hào)MUST-20111601,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.06%),甘草酸銨(批號(hào)MUST-21061007,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.06%),異甘草苷(批號(hào)MUST-21051501,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.31%),均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司;芹糖異甘草苷(批號(hào)PS012516,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%,成都普思生物科技有限公司);黃芩苷(批號(hào)110715-201720,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93.5%),黃芩素(批號(hào)1115-201720,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;咳露口服液(規(guī)格:180 mL·瓶-1,陜西步長(zhǎng)制藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)。梯度洗脫條件為0～5 min,2%～5%A;5～10 min,5%～10%A;10～15 min,10%～13%A;15～20 min,13%～20%A;20～35 min,20%～30%A;35～45 min,30%～40%A;45～50 min,40%～20%A;50～55 min,20%～2%A。柱溫為常溫;流速為0.2 mL·min-1;進(jìn)樣量為1 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為354、250 nm。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定芹糖異甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨對(duì)照品適量,加甲醇稀釋并定容至刻度,超聲助溶。配制質(zhì)量濃度分別為311 、369.433、1 122、541.858、780.120、886.587 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 取咳露口服液1 mL,置于5、50 mL量瓶中,加水稀釋并定容至刻度,搖勻,過(guò)0.22 μm濾膜,取續(xù)濾液,備用。

2.1.4方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.4.1精密度考察 取批次2(S2)咳露口服液,按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以13號(hào)峰(黃芩苷)為參照,測(cè)得共有峰保留時(shí)間RSD值為0.02%,共有峰相對(duì)峰面積的RSD值為0.67%～1.35%。表明儀器精密度良好。

2.1.4.2穩(wěn)定性考察 取批次2(S2)咳露口服液,按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件于 0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣,以13號(hào)峰(黃芩苷)為參照,測(cè)得共有峰保留時(shí)間RSD值為0.19%～0.26%,共有峰相對(duì)峰面積的RSD值為0.27%～2.27%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.3重復(fù)性考察 取批次2(S2)咳露口服液,按照2.1.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,以13號(hào)峰(黃芩苷)為參照,測(cè)得共有峰保留時(shí)間RSD值為0.13%～0.4%,共有峰相對(duì)峰面積的RSD值為1.07%～2.20%。表明方法重復(fù)性良好。

2.1.5不同批次指紋圖譜考察 按照2.1.3項(xiàng)下方法制備10批次樣品稀釋溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。導(dǎo)入“2012版中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”,以S1為參照?qǐng)D譜,用平均數(shù)時(shí)間窗寬度為0.1 min生成對(duì)照指紋圖譜,進(jìn)行不同批次色譜圖進(jìn)行自動(dòng)匹配。結(jié)果詳見(jiàn)圖1、圖2。由圖1可知,在250 nm處指認(rèn)出25個(gè)色譜峰。其中13號(hào)峰為黃芩苷、19號(hào)峰為漢黃芩苷、21號(hào)峰為黃芩素、23號(hào)峰為甘草酸銨。由圖2可知,在354 nm處指認(rèn)出19個(gè)色譜峰。11號(hào)峰為芹糖異甘草苷、12號(hào)峰為異甘草苷、13號(hào)峰為黃芩苷、17號(hào)峰為漢黃芩苷、19號(hào)峰為甘草酸銨。樣品相似度結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,以S1為參照色譜,在354 nm處各批次樣品間的相似度為0.991～1.000,同時(shí)在250 nm處各批次樣品相似度為0.990～1.000,均符合指紋圖譜質(zhì)量控制規(guī)定[8]。表明咳露口服液質(zhì)量穩(wěn)定,建立的UPLC法適用于咳露口服液的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制。

注:13.黃芩苷;19.漢黃芩苷;21.黃芩素;23.甘草酸銨。

注:11.芹糖異苷草苷;12.異甘草苷;13.黃芩苷;17.漢黃芩苷;19.甘草酸銨。

2.2 含量測(cè)定

色譜條件同2.1.1項(xiàng)下條件,檢測(cè)波長(zhǎng)。芹糖異甘草苷、異甘草苷為354 nm,黃芩苷、漢黃芩苷、甘草素、甘草酸銨為250 nm。色譜圖見(jiàn)圖3。

注:1.芹糖異甘草苷;2.異甘草苷;3.黃芩苷;4.漢黃芩苷;5.黃芩素;6.甘草酸銨。

2.2.1方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取各對(duì)照品溶液適量,置于量瓶中,加甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,得系列線性對(duì)照品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,以峰面積y為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度x(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6種指標(biāo)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.2.1.2精密度考察 精密吸取各對(duì)照品適量,混合,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算芹糖異甘草苷、黃芩苷、異甘草苷、漢黃芩苷、甘草酸銨、黃芩素6種成分峰面積的RSD值分別為0.90%、0.73%、1.25%、0.67%、1.35%、1.10%。表明儀器精密度良好。

2.2.1.3穩(wěn)定性考察 取咳露口服液(批號(hào)210226),按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件,分別于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣,測(cè)定芹糖異甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨峰面積,計(jì)算得樣品溶液RSD值分別為0.54%、1.31%、0.63%、0.71%、2.64%、1.52%,均小于3%,表明樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.1.4重復(fù)性考察 稱(chēng)取同一批次(批號(hào)210226)咳露口服液,按照2.1.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,依次測(cè)得6種成分峰面積,得RSD值分別為2.06%、2.48%、2.33%、2.56%、2.40%、2.29%,均小于3%,該方法重復(fù)性良好。

2.2.1.5加樣回收率考察 取同一批已知含量的咳露口服液(批號(hào)210226)2.5 mL 6份,分別精密加入各對(duì)照品溶液,按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,測(cè)得各對(duì)照品的平均加樣回收率范圍為98%～103%,其RSD(n=6)<3%,詳見(jiàn)表3,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 對(duì)照品加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2不同批次咳露口服液含量測(cè)定 按照2.1.3項(xiàng)下方法制備10批次樣品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,并測(cè)定咳露口服液中6種成分含量。見(jiàn)表4。由表4可知,10批次咳露口服液各成分含量范圍為芹糖異甘草苷25.057～29.65 μg·mL-1,異甘草苷26.404～32.072 μg·mL-1,黃芩苷824.457～1 291.929 μg·mL-1,漢黃芩苷319.541～557.251 μg·mL-1,黃芩素4.243～15.839 μg·mL-1,甘草酸銨250.566～479.037 μg·mL- 1。

表4 10批咳露口服液的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件篩選

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)甲酸水、磷酸水及不同pH磷酸氫二鉀流動(dòng)相溶液進(jìn)行篩選,甲酸水對(duì)比磷酸水,在相同條件下,色譜峰較磷酸水少,且峰形、分離度差。用磷酸氫二鉀溶液,隨著pH值的增大色譜峰分離較好,pH雖在C18色譜柱酸堿范圍內(nèi),但柱效發(fā)生較大變化,且大大降低了色譜柱的使用壽命,通過(guò)對(duì)比最終選用磷酸水進(jìn)行咳露口服液的分離研究。通過(guò)UPLC全波長(zhǎng)掃描,各有效色譜峰在230、280、250、354 nm等波長(zhǎng)處部分峰的靈敏度及吸收較好,為使該色譜方法更有效地進(jìn)行指認(rèn)峰的測(cè)定,綜合考慮選用250、354 nm進(jìn)行波長(zhǎng)檢測(cè)。同時(shí)在26 min前色譜圖峰形較多,而目前咳露口服液已確定已知成分較少,后期可進(jìn)一步進(jìn)行咳露口服液的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

3.2 樣品處理及含量測(cè)定

前期對(duì)咳露口服液進(jìn)行24、48、72 h,體積分?jǐn)?shù)為20%～80%乙醇的醇沉溶液考察,結(jié)果顯示不同體積分?jǐn)?shù)乙醇及醇沉?xí)r間對(duì)色譜峰的數(shù)量、含量及色譜柱柱效等未產(chǎn)生較大的變化,表明咳露口服液中含有的糖分較少,對(duì)色譜柱及有效成分結(jié)果影響較小[9]。同時(shí)通過(guò)10批次樣品溶液的含量測(cè)定,在咳露口服液中,其成分含量最高為漢黃芩苷,其次為黃芩苷、甘草酸銨。本研究結(jié)果表明建立的指紋圖譜方法穩(wěn)定,建立的色譜方法可用于已指認(rèn)出的成分含量測(cè)定。2種方法的結(jié)合可共同用于咳露口服液的質(zhì)量控制。