張志強(qiáng),魏毅強(qiáng),楊亞莉,張曉菲

1.新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科一病區(qū),新鄉(xiāng) 453000;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,鄭州 450000

肝癌是迄今為止已發(fā)現(xiàn)的腫瘤中異質(zhì)性極強(qiáng)的惡性疾病[1],主要危險(xiǎn)因素包括乙型肝炎/丙型肝炎病毒感染、飲酒、黃曲霉毒素B1和代謝紊亂等[2]。手術(shù)切除是治療肝癌的首選方式[3];在轉(zhuǎn)移性病例中,化療是有效選擇,但其在提高惡性腫瘤患者的生存率的同時(shí),往往伴隨著嚴(yán)重不良反應(yīng)[4-5]。山慈菇具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗血管生成等多種藥理活性[6],可用于抗癌[7]。山慈菇多糖為山慈菇的主要生物活性成分,可提高機(jī)體免疫、抑制H22肝癌小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。本研究擬通過構(gòu)建肝癌腹水荷瘤小鼠模型,探討山慈菇多糖的作用,并檢測(cè)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein,mTOR)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況,以闡明山慈菇多糖對(duì)模型小鼠癥狀的改善作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific有限公司;化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(FluorChem FC3)購自美國Protein Simple公司。

1.2 試藥

山慈菇多糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%,編號(hào)WKQ-0008303)購自四川省維克奇生物科技有限公司;環(huán)磷酰胺對(duì)照品(編號(hào)03121693)購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司;胎牛血清(編號(hào)12657-029)購自美國Invitrogen有限公司;Beclin1(編號(hào)PB9076)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)(編號(hào)BM0200)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 related X protein,Bax)(編號(hào)A00183)抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司;血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1,CD31,編號(hào)bs-0468R)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K,編號(hào)bs-6423R)、p-PI3K(編號(hào)bs-6417R)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;蛋白激酶B(protein kinase B,AKT,編號(hào)YT636)、p-AKT(編號(hào)YT637)抗體、mTOR(編號(hào)YT823)抗體購自北京百奧萊博科技有限公司;p-mTOR(編號(hào)sc-101738)抗體購自Santacruze公司;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF,編號(hào)AV202)抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株

6周齡C57BL/6小鼠55只,SPF級(jí)雄性近交系,購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,許可證號(hào)為SCXK(魯)2019-0003,小鼠體質(zhì)量為(20±5) g;腹水型肝癌H22細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培育與收集

H22細(xì)胞接種至RPMI 1640培養(yǎng)基(含100 mL·L-1胎牛血清及100 U·mL-1青-鏈霉素),于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集細(xì)胞并調(diào)整其密度為2×106個(gè)·mL-1,吹打均勻后于5只小鼠腹腔內(nèi)注射0.2 mL,7 d后抽取乳白色腹水,以1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,生理鹽水重懸并稀釋細(xì)胞至密度為1×106個(gè)·mL-1,備用。

2.2 造模、分組及給藥

小鼠于室溫(22±2) ℃,相對(duì)濕度為50%～70%環(huán)境下普通飼養(yǎng),12 h光照-黑暗交替,適應(yīng)1周后,隨機(jī)選取10只小鼠作為正常組,剩余40只小鼠用于構(gòu)建肝癌腹水荷瘤小鼠模型[9]。吸取稀釋后的H22細(xì)胞懸液0.2 mL,接種于右前腋皮下。小鼠放回籠內(nèi)并持續(xù)觀察,若接種部位觸摸有實(shí)體樣結(jié)節(jié)、腹部脹大即為建模成功,所有小鼠均成功建模。后隨機(jī)分為模型組、山慈菇多糖低劑量、高劑量組及環(huán)磷酰胺組,每組各10只。山慈菇多糖低劑量、高劑量組[10]及環(huán)磷酰胺組腹腔注射給藥量分別為200、400、20 mg·kg-1·d-1,正常組及模型組小鼠均腹腔注射等體積生理鹽水0.2 mL,1天1次,連續(xù)14 d。

2.3 樣品采集與處理

各組小鼠末次給藥結(jié)束后,觀察并稱定質(zhì)量;抽取小鼠腹水并記錄腹水體積;眼眶靜脈叢取血,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)RBC和WBC總數(shù);脫頸致死后,迅速解剖剝離瘤體,清理并擦拭表面液體后稱定質(zhì)量;清理并擦拭脾臟、胸腺表面液體后稱定質(zhì)量;瘤體一部分保存于40 g·L-1多聚甲醛中,一部分置于液氮中保存,備用。

2.4 小鼠抑瘤率計(jì)算

用抑瘤率評(píng)估藥物抗腫瘤活性,抑瘤率(%)=(模型組小鼠平均瘤質(zhì)量-治療組小鼠平均瘤質(zhì)量)/模型組小鼠平均瘤質(zhì)量×100%。

2.5 小鼠臟器指數(shù)計(jì)算

通過胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)評(píng)估治療對(duì)免疫器官功能的影響。脾臟指數(shù)(mg·g-1)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量;胸腺指數(shù)(mg·g-1)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.6 腫瘤組織病理學(xué)染色

正常小鼠肝臟及造模小鼠腫瘤組織經(jīng)多聚甲醛過夜固定,常規(guī)石蠟包埋,并制備為4 μm厚度組織切片,二甲苯、乙醇脫蠟至水,蘇木素染液染核3 min,伊紅染液染色30 s,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,晾干后中性樹膠封片,鏡下觀察并采集圖片。

2.7 TUNEL染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)

組織切片經(jīng)二甲苯洗滌,梯度乙醇脫水,無DNase蛋白酶K溶液處理20 min,TUNEL反應(yīng)液反應(yīng)1 h,顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。見細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中有棕色顆粒,即呈染色陽性,細(xì)胞凋亡指數(shù)=(TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

2.8 免疫組化檢測(cè)血管生成

組織切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟、水合,用過氧化氫溶液淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性,抗原修復(fù),山羊血清封閉,將切片與CD31抗體(1∶500稀釋)于4 ℃孵育過夜,后于二抗溶液中孵育1 h,DAB顯色,蘇木精復(fù)染細(xì)胞核,乙醇脫水,Image-Pro Plus 軟件觀察并計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞,評(píng)估血管生成情況。

2.9 檢測(cè)瘤組織mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

取液氮中肝臟及腫瘤組織,稱取100 mg并碾碎裂解,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清。統(tǒng)一蛋白質(zhì)量濃度并加熱變性,用SDS-PAGE凝膠電泳分散蛋白(壓縮膠60 V,20 min;分離膠120 V,65 min),轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜(200 mA,2 h);PVDF膜于脫脂乳中封閉2 h后直接與稀釋后一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜;次日換液洗膜,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶8 000稀釋)孵育2 h,洗膜,ECL發(fā)光液反應(yīng)顯影,用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照記錄。用Image J軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白Beclin1、Bcl-2、Bax及VEGF蛋白相與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量,以p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR比值評(píng)價(jià)蛋白活性。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠體征及體質(zhì)量

正常組小鼠飲食活動(dòng)及精神狀態(tài)正常,被毛光滑,皮膚、黏膜顏色未見異常;模型組小鼠反應(yīng)遲緩,食物及飲水減少,腹脹、機(jī)體消瘦,皮膚暗沉,被毛無光澤,小便發(fā)黃;治療組小鼠較模型組癥狀有所改善。體質(zhì)量比較結(jié)果顯示,5組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠治療后體質(zhì)量比較

3.2 小鼠腹水形成情況

抽取模型小鼠腹水,見模型組小鼠黏稠血性腹水,3個(gè)給藥組小鼠腹水均呈不同程度的血色渾濁。模型組、山慈菇低劑量、高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腹水體積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,山慈菇多糖低劑量、高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腹水體積減少(P<0.05);與山慈菇多糖低劑量組比較,高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腹水體積減少(P<0.05),環(huán)磷酰胺組小鼠腹水體積最少(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腹水體積比較

3.3 小鼠外周血RBC、WBC總數(shù)

計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,5組小鼠外周血RBC、WBC總數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠RBC總數(shù)減少,WBC總數(shù)增加(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)給藥組小鼠RBC總數(shù)增加,WBC總數(shù)減少(P<0.05);與山慈菇多糖低劑量組比較,高劑量組及環(huán)磷酰胺組RBC總數(shù)增加,WBC總數(shù)減少(P<0.05),環(huán)磷酰胺組小鼠RBC總數(shù)最高,WBC總數(shù)最低(P<0.05)。見表3。

表3 RBC、WBC總數(shù)比較

3.4 小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率

結(jié)果顯示,4組模型小鼠腫瘤質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,3個(gè)給藥組小鼠腫瘤質(zhì)量降低(P<0.05);與山慈菇多糖低劑量組比較,高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤質(zhì)量降低(P<0.05),環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤質(zhì)量最低(P<0.05)。經(jīng)抑瘤率計(jì)算,結(jié)果顯示山慈菇多糖低劑量組抑瘤率最低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

3.5 小鼠脾臟、胸腺指數(shù)

結(jié)果顯示,5組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均降低(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)給藥組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均升高(P<0.05);與山慈菇多糖低劑量組比較,高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均升高(P<0.05),環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)最高(P<0.05)。見表5。

表5 各組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較

3.6 小鼠腫瘤組織學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示,與正常組肝組織比較,模型組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,生長(zhǎng)良好,異型性高,血管豐富;與模型組比較,3個(gè)給藥組小鼠腫瘤細(xì)胞皺縮、破碎、凋亡,排列不規(guī)則,壞死區(qū)域逐漸擴(kuò)大。見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;C.山慈菇多糖低劑量組;D.山慈菇多糖高劑量組;E.環(huán)磷酰胺組。

3.7 小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)

TUNEL染色結(jié)果顯示,3個(gè)給藥組小鼠腫瘤組織見有明顯凋亡陽性細(xì)胞。計(jì)量結(jié)果顯示,4組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,3個(gè)給藥組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05);與山慈菇多糖低劑量組比較,山慈菇多糖低劑量、高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05),環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)最高(P<0.05)。見圖2、表6。

表6 腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

注:A.正常組;B.模型組;C.山慈菇多糖低劑量組;D.山慈菇多糖高劑量組;E.環(huán)磷酰胺組。

3.8 小鼠腫瘤組織血管生成情況

免疫組化結(jié)果顯示,各組小鼠肝臟、腫瘤組織中CD31陽性血管數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組腫瘤組織中CD31陽性血管數(shù)增多(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)給藥組小鼠腫瘤組織中CD31陽性血管數(shù)減少(P<0.05);與山慈菇多糖低劑量組比較,山慈菇多糖高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤組織中CD31陽性血管數(shù)減少(P<0.05),環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤組織中CD31陽性血管數(shù)最少(P<0.05)。見表7、圖3。

表7 各組小鼠CD31陽性血管數(shù)比較

注:A.正常組;B.模型組;C.山慈菇多糖低劑量組;D.山慈菇多糖高劑量;E.環(huán)磷酰胺組。

3.9 mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示,5組大鼠組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、Beclin1、Bcl-2、Bax及VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、Bcl-2及VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高,Beclin1及Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)給藥組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、Bcl-2及VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低,Beclin1及Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05);與山慈菇多糖低劑量組比較,多糖高劑量組及環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、Bcl-2及VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低,Beclin1及Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05),環(huán)磷酰胺組改變最明顯(P<0.05)。見圖4、表8。

注:A.正常組;B.模型組;C.山慈菇多糖低劑量組;D.山慈菇多糖高劑量組;E.環(huán)磷酰胺組。

表8 各組小鼠腫瘤組織中mTOR通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平

4 討論

本研究用H22細(xì)胞腹水接種成功構(gòu)建肝癌腹水荷瘤小鼠模型,經(jīng)山慈菇多糖低劑量、高劑量治療,結(jié)果顯示,山慈菇多糖可降低腫瘤體質(zhì)量,山慈菇多糖低劑量、高劑量抑瘤率分別為25.31%、45.57%,并可促進(jìn)腫瘤組織中心細(xì)胞壞死,提示山慈菇多糖可有效抑制腫瘤生長(zhǎng),延緩癌癥發(fā)展。

免疫系統(tǒng)在阻止腫瘤發(fā)展并抑制已形成腫瘤方面發(fā)揮重要作用,在免疫缺陷背景下癌癥的增殖和轉(zhuǎn)移更容易發(fā)生[11]。脾臟和胸腺指數(shù)反映了機(jī)體的免疫功能,指數(shù)增加表明免疫增強(qiáng)[12]。本研究結(jié)果顯示,模型組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)降低,且血液中WBC總數(shù)升高,提示機(jī)體免疫功能低下;而經(jīng)山慈菇多糖低劑量、高劑量治療后,臟器指數(shù)增加,WBC總數(shù)減少,提示山慈菇多糖具有抗腫瘤活性的免疫調(diào)節(jié)特性;惡性腹水治療對(duì)于改善腹部惡性腫瘤的預(yù)后具有重要意義,本研究表明,模型組小鼠血性腹水量多,血液中RBC總數(shù)減少,提示機(jī)體貧血;經(jīng)山慈菇多糖低、高劑量治療后,出血性腹水減少,RBC總數(shù)增加,提示山慈菇多糖可改善機(jī)體機(jī)能,減少腹水形成,抑制不良病理進(jìn)展。

轉(zhuǎn)移是癌癥發(fā)展的重要標(biāo)志,涉及多種因素,如腫瘤血管生成、炎癥性腫瘤微環(huán)境的發(fā)展和程序性細(xì)胞死亡的缺陷[13]。轉(zhuǎn)移過程的成功依賴于惡性細(xì)胞逃避凋亡的能力[14],而細(xì)胞凋亡可通過殺死錯(cuò)位細(xì)胞阻止轉(zhuǎn)移[15]。自噬在癌癥轉(zhuǎn)移中的作用復(fù)雜,可通過過度地自我消化和凋亡激活直接或間接誘導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡,從而抑制腫瘤進(jìn)展[16];自噬缺陷增加氧化應(yīng)激、DNA損傷和基因組不穩(wěn)定性,從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展[17]。CD31用于評(píng)估腫瘤血管生成,VEGF是一種重要的促血管生成因子,Bcl-2為抗細(xì)胞凋亡因子,Bax與Bcl-2作用相反,通過Bax過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[18],Beclin1為自噬標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示,山慈菇多糖可顯著減少CD31陽性血管數(shù),降低Bcl-2及VEGF蛋白表達(dá),促進(jìn)Bax及Beclin1蛋白表達(dá),提示山慈菇多糖可能通過減少血管生成、促進(jìn)自噬及凋亡,從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。研究表明,自噬激活可抗血管生成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[19],而mTOR是自噬負(fù)調(diào)控和抗腫瘤藥物的藥理學(xué)靶點(diǎn),PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示,模型組小鼠PI3K/AKT/mTOR活性升高,山慈菇多糖可顯著降低PI3K/AKT/mTOR活性,提示山慈菇多糖的抗腫瘤作用可能與抑制PI3K/AKT/mTOR激活、誘導(dǎo)自噬發(fā)生,進(jìn)而抑制血管生成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述,山慈菇多糖可抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫,延緩癌癥發(fā)展,有效改善模型小鼠病理癥狀,其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR通路激活有關(guān)。