王 靜，肖秋肖，肖紅琴，康寧芳，鞏仔鵬，鄭 林，王愛民，李勇軍，黃 勇，李月婷*

(1. 貴州醫(yī)科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2. 貴州醫(yī)科大學 藥學院，貴州 貴陽 550004；3. 貴州醫(yī)科大學 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

0 引言

【研究意義】山慈菇又名毛慈菇，為蘭科植物杜鵑蘭[Cremastraappendiculata(D. Don) Makino]、獨蒜蘭[Pleionebulbocodioides(Franch) Rolfe]和云南獨蒜蘭[PleioneyunnanensisRolfe]的干燥假鱗莖[1]，主要分布在貴州、山西、陜西、甘肅、四川等地區(qū)，是我國的瀕危藥用植物[2]。山慈菇中含有黃酮類、生物堿、酚類、糖類等多種化合物[3-5]，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗血管生成、降低血壓血糖等多種藥理活性[5-9]。多糖作為山慈菇中的一種天然活性成分，因其具有的多種生物活性(降血脂、抗腫瘤、提高免疫功能)和無毒無害、無抗藥性等作用[10]，近年來已成為多個行業(yè)(食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥)關(guān)注的焦點。開展山慈菇活性物質(zhì)提取方面的研究，對進一步促進其在食品加工、生物制藥等方面的開發(fā)應用具有現(xiàn)實意義。【前人研究進展】目前，提取多糖的新興工藝主要有超聲輔助提取法、酶提取法、超臨界流體萃取法等[11-19]。其中超聲輔助提取法反應速度快，但只適用于物理穩(wěn)定性的藥材；而酶提取法雖提取率高，但要求酶活力很高，且酶的價格昂貴?！狙芯壳腥朦c】山慈菇多糖的提取工藝鮮有報道，而酶法和超臨界流體萃取法要求高、成本高、難以普遍使用；超聲波輔助提取法威力過大又容易破壞多糖結(jié)構(gòu)[20]。相比之下，傳統(tǒng)的水提醇沉法具有操作簡單、成本低、對多糖結(jié)構(gòu)影響小等優(yōu)點?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒于目前山慈菇多糖提取工藝的研究狀況，擬采用經(jīng)典方法(水提醇沉)對山慈菇的多糖類物質(zhì)進行提取，為山慈菇多糖進一步應用于食品、醫(yī)藥領域奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 山慈菇 購自毫州市永剛飲片廠有限公司。

1.1.2 試劑 無水-D葡萄糖對照品，貴州省貴陽市凱信生物工程有限公司；乙醇、苯酚、濃硫酸等，國產(chǎn)分析純，均為市購。

1.1.3 儀器設備 FW100高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；EL-204電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；ALLEGRA X-30A離心機，貝克曼庫爾特有限公司；UV-2700紫外分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山慈菇多糖的提取流程 干燥山慈菇藥材→粉碎機粉碎→過40目篩(山慈菇粉末)→水浴鍋回流提取→轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容，過濾→取濾液→加乙醇進行多糖沉淀→冷凍→離心(10 000 r/min，5 min)→取多糖沉淀→真空干燥→山慈菇粗多糖。

1.2.2 山慈菇多糖含量的測定

1) 繪制標準曲線。采用苯酚硫酸法測定山慈菇多糖含量[21]。先配制100 μg/mL的葡萄糖對照品溶液，存于4℃冰箱備用。精密吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL上述溶液于5支1 mL的已編號試管中，不足1 mL的加水補足，輕輕晃蕩，快速加入5%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL，搖勻，將具塞試管置于沸水中保溫20 min，取出冷卻，在490 nm處測吸光度值，繪制標準曲線，擬合吸光度(y)與多糖濃度(x)的回歸方程。

2) 測定山慈菇樣品多糖含量。稱取0.5 g山慈菇粉末回流提取120 min，將提取液轉(zhuǎn)至量瓶中定容，過濾，在濾液中加醇使醇含量為80%，4℃冰箱醇沉過夜，取出，以10 000 r/min的速度離心5 min，取沉淀放于量瓶中定容，取1 mL置試管中，按上述方法進行山慈菇多糖顯色并測定其吸光度，計算多糖的提取率。

提取率=(CVN/m)×100%

式中，C為待測溶液葡萄糖的濃度(μg/mL),V為待測溶液體積(mL),N為稀釋倍數(shù),m為山慈菇粉末質(zhì)量(g)。

1.2.3 山慈菇多糖的提取因素

1) 固液比。稱取5份0.5 g山慈菇粉末分別置于5個錐形瓶中，分別按固液比(g∶mL)為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入不同比例的水，沸水浴回流120 min，提取液轉(zhuǎn)至量瓶中定容至50 mL，過濾，分別加95%醇使終濃度含醇量達80%，4℃醇沉過夜備用，3次重復。

2) 提取溫度。稱取5份0.5 g山慈菇粉末分別置于5個錐形瓶中，按固液比1∶30 加入水，分別在60℃、70℃、80℃、90℃和100℃等不同提取溫度下回流提取120 min，提取液轉(zhuǎn)至量瓶中定容至50 mL，過濾，分別加95%醇使終濃度含醇量達80%，4℃醇沉過夜備用，3次重復。

3) 提取時間。稱取5份0.5 g山慈菇粉末分別置于5個錐形瓶中，按固液比1∶30加入水，沸水浴中分別回流提取30 min、60 min、90 min、120 min和150 min，提取液轉(zhuǎn)至量瓶中定容至50 mL，過濾，分別加95%醇使終濃度含醇量達80%，4℃醇沉過夜備用，3次重復。

4) 醇沉濃度。稱取5份0.5 g山慈菇粉末分別置于5個錐形瓶中，按固液比1∶30加入水，沸水浴回流120 min，提取液移至量瓶中定容至50 mL，過濾，分別加入95%醇使終濃度達70%、75%、80%、85%和90%，4℃冰箱醇沉過夜備用，3次重復。

1.2.4 Box-Behnken試驗設計優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素試驗結(jié)果結(jié)合BOX-Behnken Design設計原理，以固液比、提取溫度和提取時間為考察對象，多糖提取率為響應值，運用Design-Expert 8.0.6 進行33的響應面優(yōu)化試驗，以確定山慈菇多糖的最佳提取條件，試驗編碼詳見表1。根據(jù)響應面優(yōu)化試驗結(jié)果使用Design-Expert 8.0.6進行多元回歸擬合。通過響應曲面圖和等高線圖可反映固液比、提取溫度、提取時間對山慈菇多糖提取率的影響，也可同時反應影響因素間的相互作用。響應曲面圖曲線越彎越陡，說明該條件對響應值影響越大；反之曲線越平，說明該條件對響應值的影響越小。等高線反應因素間的交互強弱，等高線越密集，呈橢圓狀，表示交互越明顯，反之則表示交互不明顯[22]。

表1 山慈菇多糖提取的山慈菇多糖提取的響應面試驗因素與水平

1.3 統(tǒng)計分析

試驗所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6和Spss進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山慈菇多糖的標準曲線

在490 nm處測得不同濃度吸光度值，以吸光度(y)為縱坐標，多糖濃度(x)為橫坐標繪制得到標準曲線(圖1)。經(jīng)擬合得回歸方程：y=0.068 5x+0.038，R2=0.998 5。說明多糖濃度在2.857～14.286 μg/mL時吸光度與多糖濃度存在良好的線性關(guān)系。

圖1 山慈菇多糖的標準曲線

2.2 不同提取條件山慈菇多糖的提取率

從圖2可知，固液比、提取溫度、提取時間和醇沉濃度等不同提取條件山慈菇多糖的提取率存在差異。

圖2 不同提取條件山慈菇多糖的提取率

2.2.1 固液比 隨著固液比的增加，山慈菇多糖的提取率呈先增后減趨勢，提取率為6.58%～7.63%，其中，固液比為1∶30時多糖提取率最高，1∶40時其次，1∶60時最低，依次為1∶30>1∶40>1∶20>1∶50>1∶60。在固液比1∶30時，多糖的提取率達最大，表明提取山慈菇多糖固液比以1∶30為宜。原因可能是固液比小時，山慈菇多糖溶出不充分；而固液比過大時，受溶解度的影響，山慈菇多糖的提取率變低[23]。因而，選取固液比為1∶20、1∶30和1∶40進行后續(xù)試驗。

2.2.2 提取溫度 山慈菇多糖的提取率隨溫度升高呈先增后減趨勢，提取率為6.74%～7.89%，其中，提取溫度為80℃時多糖提取率最高，70℃時其次，100℃時最低，依次為80℃>70℃>60℃>90℃>100℃。溫度為80℃時山慈菇多糖的提取率最大，表明提取溫度以80℃為宜。原因可能是山慈菇多糖在一定溫度范圍內(nèi)，溶解度增加，提取率增高，當溫度超過適宜溫度時，多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，導致多糖提取率降低[24-25]。因而，選取提取溫度為70℃、80℃和90℃進行后續(xù)試驗。

2.2.3 提取時間 山慈菇多糖的提取率隨提取時間延長呈先增后減趨勢，提取率為6.83%～7.75%，其中，提取時長為120 min時多糖提取率最高，90 min時其次，150 min時最低，依次為120 min>90 min>60 min>30 min>150 min。在120 min時，山慈菇多糖的提取率最大，表明120 min為最佳提取時間。原因可能是山慈菇回流提取時間過短，多糖溶出不充分，提取率低；當提取時間過度延長時，溶液又達飽和狀態(tài)，使得多糖溶出減少，且時間過長又會導致山慈菇的糖蛋白變性，析出沉淀，提取率變低[25]。因而，選取提取時間為90 min、120 min和150 min進行后續(xù)試驗。

2.2.4 醇沉濃度 山慈菇多糖的提取率隨醇沉濃度增加呈先增后減趨勢，提取率為7.08%～7.85%，其中，醇沉濃度為80%時多糖提取率最高，85%時其次，90%時最低，依次為80%>85%>75%>70%>90%。在濃度為80%時，多糖提取率達最大，表明醇沉濃度以80%為宜。原因可能是一定范圍內(nèi)的醇沉濃度可以降低山慈菇多糖的溶解度，利于山慈菇多糖的沉淀；而當醇沉濃度過高時，會使一些雜質(zhì)一起沉淀，從而導致多糖不純，影響提取率[23]。

2.3 響應面試驗優(yōu)化提取工藝

2.3.1 Box-Behnken試驗結(jié)果 從表2看出，17個處理山慈菇多糖提取率為6.89%～7.77%，其中，處理5和處理17，即固液比1∶30，提取溫度80℃，提取時間120 min時山慈菇多糖提取率最高，均為7.77%；處理15、處理1和處理12的試驗條件與處理5和處理17相同，但山慈菇多糖提取率稍低，為7.65%～7.75%。各處理山慈菇多糖提取率依次為處理5=處理17>處理15>處理1>處理12>處理14>處理3>處理6=處理16>處理4=處理8>處理13>處理11>處理9>處理2>處理10>處理7。

表2 山慈菇多糖提取的響應面試驗設計及結(jié)果

2.3.2 Box-Behnken模型的建立與統(tǒng)計分析 經(jīng)對上述提取結(jié)果進行多元回歸擬合得到山慈菇多糖提取率(Y)與提取因素 固液比(A)、溫度(B)和提取時間(C)的回歸擬合方程：

Y=7.73-0.060A-0.079B+0.049C-

0.002 5AB+0.013AC+0.22BC-0.056A2-

0.24B2-0.25C2

從表3看出，模型P<0.000 1，F(xiàn)=44.68，表明，試驗二次模型可信度高，可用于描述因素與響應值間的變化關(guān)系。決定系數(shù)R2=0.982 9，校正決定系數(shù)Radj2為0.960 9，變異系數(shù)CV為0.64%(較小)，失擬項0.625 7(>0.05)，說明模型擬合好，穩(wěn)定、可靠。同時，固液比與提取溫度的交互、固液比與提取時間的交互對山慈菇多糖提取率無顯著影響，而固液比、提取溫度、提取時間及固液比的交互對山慈菇多糖提取率影響顯著，提取溫度交互、提取時間交互及提取溫度與提取時間的交互對山慈菇多糖提取率影響極顯著。從A、B和C的F值大小可以判斷各因素對提取率的影響大小為B>A>C。

表3 Box-Behnken模型的方差分析結(jié)果

2.3.3 響應面因素間交互作用 從圖2看出固液比、提取溫度、提取時間對山慈菇多糖提取率影響的變化及影響因素間的相互作用。

1) 固液比與提取溫度。2個影響因素有交互作用，提取率均隨影響因素的遞增呈先增后減趨勢，曲面圖呈現(xiàn)一種彎曲且陡峭的狀態(tài)。同時，等高線在提取溫度側(cè)較多，呈長圓形，說明，回流提取溫度對多糖提取率的影響優(yōu)于固液比。

2) 固液比與提取時間。響應面曲面彎曲，2個影響因素有交互作用，多糖提取率隨影響因素的遞增呈先增后減趨勢。等高線在固液比一側(cè)聚集，呈長圓形，說明，固液比對多糖提取率的影響大于提取時間對多糖提取率的影響。

3) 提取溫度與提取時間。響應面曲面彎曲呈弧狀，表明溫度和提取時間的交互作用十分明顯，多糖提取率均隨提取溫度與提取時間增加呈先增后減趨勢。等高線呈長橢圓狀，表明，二者交互作用十分明顯，但等高線更多聚集在溫度側(cè)，說明提取溫度對多糖提取率的作用占優(yōu)勢。

綜合看，Design-Expert 8.0.6優(yōu)化出的山慈菇多糖最佳提取工藝為固液比1∶40，提取溫度為78.61℃，提取時間為121.85 min，此時山慈菇多糖的預測提取率為7.62%。

圖3 不同處理條件山慈菇多糖提取率及其響應面與等高線

2.4 提取工藝驗證

由于試驗操作條件有限，將提取工藝稍作修改，在提取條件為固液比1∶40、提取溫度79℃、提取時間122 min下重復試驗3次，得山慈菇多糖提取率為7.04%，與預測值(7.62%)相比誤差小于1%。表明，使用該方法優(yōu)化山慈菇多糖提取工藝可靠、真實且具有代表性。

3 討論

山慈菇多糖的提取工藝在我國目前還處于初步階段，而實際上，國內(nèi)外研究提取多糖工藝已出現(xiàn)新興方法[13-20]，如水提醇沉法、溶劑提取法、酶提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、超高壓提取法及復合提取法等，每種方法都有各自的優(yōu)缺點。為了充分利用瀕危藥用植物山慈菇，為其多糖的進一步開發(fā)和應用提供依據(jù)，該研究采用傳統(tǒng)的水提醇沉法提取山慈菇多糖，通過單因素試驗與響應面法相結(jié)合優(yōu)化了山慈菇多糖提取條件，在此最佳提取條件下山慈菇多糖提取率為7.62%。較之房宇坤等[13]的水提醇沉法研究，提取條件得到進一步優(yōu)化，為提高提取率奠定了一定基礎，也為食品、醫(yī)藥等領域利用山慈菇多糖提供了一種提取方式。雖然傳統(tǒng)的水提醇沉法簡單、方便，但隨著時代的發(fā)展與進步，今后應順應時代，嘗試多種新方法對提取工藝進行考察、改進，為縮短提取時間，獲得山慈菇多糖高提取率提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

試驗采用最經(jīng)典的水提醇沉法和響應面法結(jié)合優(yōu)化山慈菇多糖的提取工藝，獲得最優(yōu)的提取工藝參數(shù)，即固液比(g∶mL)為1∶40、提取溫度為78.61℃、提取時間為121.85 min，山慈菇多糖的預測提取率為7.62%。采用響應面法優(yōu)化山慈菇多糖提取工藝得出，固液比、提取時間及提取溫度對山慈菇多糖提取率的影響依次為提取溫度>固液比>提取時間，提取溫度與提取時間的交互對山慈菇多糖提取率的影響較顯著，固液比與提取溫度的交互及固液比與提取時間的交互對山慈菇多糖提取率幾乎無影響。考慮到實際操作限制，將提取工藝參數(shù)修改為固液比(g∶mL)1∶40、提取時間122 min、提取溫度79℃，此時山慈菇多糖的實際提取率為7.04%，與預測值基本一致。表明，該方法結(jié)果可靠，準確，且具有操作簡單、方便、經(jīng)濟等優(yōu)點，適用于山慈菇多糖的提取。