李 可, 金 輝, 陳 卓, 趙明明, 胡新燕, 李衛(wèi)華, 陳曉光

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所,廣東湛江 524091; 2.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇徐州221000)

白粉病是南瓜發(fā)生最普遍、最嚴(yán)重的一種病害。南瓜白粉病是由單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii)引起的。截至目前,國(guó)內(nèi)外大量研究已鑒定出多個(gè)與植物白粉病抗性相關(guān)基因,其中一些已成功運(yùn)用到抗病育種中,獲得了一些抗病品種[1-4],這些基因?yàn)榕嘤碌目共∑贩N提供了遺傳材料[5-6]。R基因是最常見(jiàn)的一類(lèi)抗病基因,具有專(zhuān)一高效的特點(diǎn),缺點(diǎn)是容易因病原菌突變導(dǎo)致抗性丟失。另一類(lèi)是負(fù)調(diào)控植物抗病性,參與植物感病的S基因,其功能缺失而產(chǎn)生植物抗病性,且與R基因相比抗性更穩(wěn)定[7]。

自1942年在大麥中發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)MLO基因突變體,大量學(xué)者對(duì)多種作物中的MLO基因進(jìn)行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn),MLO基因是植物特有的一類(lèi)由單基因控制的隱性抗病基因,MLO基因突變可誘導(dǎo)植物對(duì)白粉菌產(chǎn)生廣譜、高效且持久的抗性。截至目前,已在多種植物中證實(shí)MLO基因是參與白粉病病菌侵染植物的感病因子。研究者利用生物技術(shù)手段沉默或突變大麥、擬南芥、煙草、小麥、番茄等植物中的相關(guān)MLO基因[8-12],可誘導(dǎo)它們產(chǎn)生廣譜抗性。

中國(guó)南瓜全基因組測(cè)序工作的完成為MLO基因家族的鑒定奠定了基礎(chǔ),本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)中國(guó)南瓜MLO基因家族成員進(jìn)行鑒定,分析其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、進(jìn)化關(guān)系及白粉病的誘導(dǎo)表達(dá)模式,以期為中國(guó)南瓜MLO基因的功能驗(yàn)證及抗白粉病材料創(chuàng)制和新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 中國(guó)南瓜MLO基因的鑒定與分析

利用已報(bào)道的近緣種的MLO蛋白序列在中國(guó)南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cucurbitgenomics.org/organism/14)中進(jìn)行相似性搜索(BLAST),其中包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)、美洲南瓜(Cucurbitapepo)、印度南瓜(Cucurbitamaxima)。相關(guān)的MLO蛋白序列從數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cucurbitgenomics.org/organism/14;http://cucurbitgenomics.org/organism/8)中獲取的中國(guó)南瓜MLO基因的CDS序列,利用BioXM2.7翻譯成蛋白序列。獲得的中國(guó)南瓜MLO蛋白序列通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pfam.xfam.org/)確認(rèn)是否含有MLO基因的保守結(jié)構(gòu)域[13-15]。相應(yīng)的MLO基因序列也從中國(guó)南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取。

1.2 基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,分析其外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成。ORF分析利用BioXM2.7軟件完成[16-17]。

1.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析

采用在線軟件ExPASy(https://www.expasy.org/)對(duì)中國(guó)南瓜MLO蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析,包括分子權(quán)重和等電點(diǎn)分析。利用在線軟件TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)進(jìn)行跨膜區(qū)螺旋預(yù)測(cè)。氨基酸序列保守基序預(yù)測(cè)采用在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/)完成[18]。

1.4 多序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)85個(gè)MLO氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)作圖,包括15個(gè)擬南芥、20個(gè)美洲南瓜、21個(gè)印度南瓜、20個(gè)中國(guó)南瓜以及已報(bào)道的4個(gè)單子葉植物的白粉病抗性相關(guān)MLO蛋白和5個(gè)雙子葉植物抗病基因氨基酸序列。利用MEGA6采用Align by ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì),采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。被劃分到第Ⅴ分支的MLO蛋白序列利用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì),鑒定該分支的保守氨基酸及基序[19]。

1.5 白粉病抗性相關(guān)基因的表達(dá)分析

感病和抗病材料為本研究前期篩選鑒定出的中國(guó)南瓜資源?？垢胁牧嫌?021年6月在江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室的光照培養(yǎng)箱中種植,培養(yǎng)條件為30 ℃光照16 h,25 ℃黑暗8 h,于南瓜苗3葉1心期接種白粉病菌。白粉病菌取自江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地發(fā)病的大田南瓜葉片,挑取單菌落于吐溫20中,制成2.5×105～5.0×105個(gè)/mL孢子懸浮液,噴施接種在健康的感病南瓜幼苗葉片上,置于25～30 ℃、濕度90%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),經(jīng)5次分離純化后,收集白粉病菌孢子用于接種試驗(yàn)。接種后置于光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件同上,分別于接種前(0 h),接種后12、24、48、72 h取樣,液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱中保存。分別檢測(cè)抗感材料中被劃分到第Ⅴ分枝的MLO基因(CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19)的表達(dá)量。

RNA提取利用翊圣 MolPure? Blood RNA Kit 植物RNA提取試劑盒,cDNA合成利用Takara PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒完成?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用TOYOBO SYBR? Green Realtime PCR Master Mix熒光定量試劑盒,反應(yīng)程序:95 ℃,60 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,40個(gè)循環(huán)。利用ABIQuantStudioTM6 Flex進(jìn)行熒光定量PCR。利用NCBI中的Primer-BLAST 設(shè)計(jì)引物,18S RNA作為內(nèi)參[20-22]。

表1 熒光定量引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)南瓜中MLO基因的鑒定與分析

通過(guò)同源比對(duì)及鑒定,共獲得20個(gè)中國(guó)南瓜MLO基因(表2),按照其在染色體上的分布命名為CmoMLO1到CmoMLO20。20個(gè)CmoMLO基因分布在除了5、10、11、12、14和19號(hào)以外的14條染色體上。其中1、2、3、4、13和20號(hào)染色體上分別有2個(gè)CmoMLO基因分布。鑒定結(jié)果表明,中國(guó)南瓜的CmoMLO基因數(shù)量與美洲南瓜及印度南瓜的MLO基因數(shù)量相當(dāng)。中國(guó)南瓜CmoMLO基因大小從 2 965 bp 到9 967 bp不等,所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量也從324個(gè)至1 264個(gè)不等,對(duì)應(yīng)的等電點(diǎn)為6.26～9.63,分子權(quán)重為36 403.18～140 267.57 ku,外顯子個(gè)數(shù)為6～22個(gè)(圖1)。20個(gè)CmoMLO基因中有9個(gè)基因(CmoMLO2、CmoMLO5、CmoMLO8、CmoMLO10、CmoMLO14、CmoMLO15、CmoMLO16、CmoMLO18、CmoMLO20)含有15個(gè)外顯子。20個(gè)CmoMLO基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列含有2～8個(gè)不等的跨膜區(qū),其中12個(gè)CmoMLO蛋白(CmoMLO2、CmoMLO4、CmoMLO6、CmoMLO8、CmoMLO9、CmoMLO10、CmoMLO11、CmoMLO13、CmoMLO15、CmoMLO17、CmoMLO18、CmoMLO19)含有7個(gè)跨膜螺旋。利用MEGA6采用Align by ClustalW clustlW進(jìn)行多序列比對(duì),采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),20個(gè)中國(guó)南瓜CmoMLO蛋白被分為6個(gè)分枝。

表2 中國(guó)南瓜MLO家族基因的特征

2.2 第Ⅴ分枝氨基酸序列保守基序預(yù)測(cè)

利用在線軟件MEME對(duì)來(lái)自不同作物的第Ⅴ分枝23個(gè)MLO氨基酸序列進(jìn)行保守基序預(yù)測(cè)(圖2),在參數(shù)設(shè)置為0.05顯著水平條件下得到22個(gè)寬度6～50不等的保守基序,motif1、motif2和motif9是第Ⅴ分枝所有MLO蛋白序列都含有的保守基序,可能與雙子葉植物白粉病抗性有關(guān)。

2.3 多序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

85個(gè)MLO蛋白聚類(lèi)分析,分成7個(gè)分枝(圖3),中國(guó)南瓜的20個(gè)MLO基因被劃分到除第Ⅳ分枝外的6個(gè)分枝,其中5個(gè)被劃分到第Ⅰ分枝(CmoMLO2、CmoMLO7、CmoMLO12、CmoMLO15、CmoMLO16),3個(gè)被劃分到第Ⅱ分枝(CmoMLO11、CmoMLO17、CmoMLO20),3個(gè)被劃分到第Ⅲ分枝(CmoMLO5、CmoMLO9、CmoMLO10),5個(gè)被劃分到第Ⅴ分枝(CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19),2個(gè)被劃分到第Ⅵ分枝(CmoMLO1、CmoMLO14),2個(gè)被劃分到第Ⅶ分枝(CmoMLO3、CmoMLO6)。已知的雙子葉植物抗白粉病相關(guān)MLO蛋白均被聚類(lèi)到第Ⅴ分枝。第Ⅳ分枝涵蓋了所有已知單子葉植物白粉病抗性相關(guān)MLO蛋白。

為了揭示第Ⅴ分枝MLO蛋白的序列特點(diǎn),利用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì),鑒定該分枝MLO蛋白的保守氨基酸及基序。結(jié)果表明,該分枝的MLO蛋白的氨基酸序列含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM1～TM7),且大部分成員的跨膜區(qū)氨基酸殘基高度保守(圖4)。

2.4 白粉病抗性相關(guān)基因的表達(dá)分析

為了檢測(cè)中國(guó)南瓜白粉病抗性相關(guān)MLO基因,于接種后不同時(shí)間點(diǎn)取樣,分別檢測(cè)抗感材料中被劃分到第Ⅴ分枝的MLO基因的表達(dá)量(CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19)(圖5)。CmoMLO4在抗病材料中接種前后表達(dá)量無(wú)顯著差異,感病材料中接種后24 h顯著上調(diào),其余幾個(gè)時(shí)期與接種前表達(dá)量無(wú)顯著差異。CmoMLO8在抗感材料中接種前后基因表達(dá)的整體趨勢(shì)較一致,均在接種后12 h顯著上調(diào)表達(dá),而后表達(dá)量開(kāi)始下降,但抗病材料中12、48、72 h基因上調(diào)表達(dá),顯著高于感病材料。CmoMLO13在抗病材料中接種后12 h顯著上調(diào)表達(dá),24、48 h與接種前表達(dá)量無(wú)顯著差異,接種后72 h再次顯著上調(diào)表達(dá),感病材料中接種后24 h顯著上調(diào)表達(dá),48 h表達(dá)量下降,72 h 再次顯著上調(diào)表達(dá)。CmoMLO18在抗病材料中接種后12、48 h顯著上調(diào)表達(dá)。CmoMLO18在感病材料中接種前后表達(dá)量無(wú)顯著差異。CmoMLO19在抗病材料中接種后12、48、72 h均顯著上調(diào)表達(dá)。CmoMLO19在感病材料中接種后顯著上調(diào)表達(dá),且在24 h達(dá)到峰值。CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19可能參與了白粉病病菌侵染中國(guó)南瓜的重要相關(guān)基因,且在接種后24 h是白粉病侵染的關(guān)鍵時(shí)期。

3 討論與結(jié)論

前人研究已證實(shí),MLO基因家族的某些成員在白粉病病菌侵染植物的過(guò)程中充當(dāng)“感病因子”,MLO基因的突變能夠引發(fā)植物對(duì)白粉病的廣譜抗性,因此MLO基因在植物抗白粉病育種中具有重要的意義。截至目前,葫蘆科蔬菜作物中西瓜、甜瓜、黃瓜、印度南瓜、美洲南瓜、苦瓜等多種作物均已報(bào)道了對(duì)MLO基因家族成員的鑒定與分析[17,23-26],而關(guān)于中國(guó)南瓜MLO基因的鑒定與分析還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)方法,利用中國(guó)南瓜基因組數(shù)據(jù),共鑒定得到20個(gè)MLO基因,基因數(shù)量與印度南瓜(20個(gè))和美洲南瓜(18個(gè))相當(dāng)[25-26]。印度南瓜的20個(gè)MLO基因分布在15條染色體上,而中國(guó)南瓜的20個(gè)MLO基因分布在14條染色體上,2個(gè)種中的5、10、11、12、14、19號(hào)染色體上均無(wú)MLO基因分布,其中1、2、3、4、13、20號(hào)染色體均有2個(gè)MLO基因分布,說(shuō)明MLO基因在2個(gè)種中具有較高的保守性,同時(shí)又存在一定的變異性。對(duì)應(yīng)的等電點(diǎn)為6.26～9.63,外顯子個(gè)數(shù)為6～22個(gè),有 2～8個(gè)不等的跨膜區(qū),與葫蘆科其他作物(西瓜、甜瓜、黃瓜、印度南瓜、美洲南瓜)一致性較高[23,25-26]。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,中國(guó)南瓜MLO蛋白與已報(bào)道的葫蘆科其他作物高度相似,均被劃分成6個(gè)分枝。

目前的研究表明,雙子葉植物中與白粉病抗性相關(guān)的MLO蛋白可能僅分布在第Ⅴ分枝,而單子葉植物中的相關(guān)基因僅位于第Ⅳ分枝,但這2個(gè)分枝上的基因并不都參與植物與白粉病病菌的互作[27]。因此通過(guò)人工接種試驗(yàn)鑒定中國(guó)南瓜第Ⅴ分枝相關(guān)MLO基因的表達(dá)量變化,發(fā)現(xiàn)CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19在感病材料接種后24 h顯著上調(diào)表達(dá),且上調(diào)幅度較高,而在抗病材料中上調(diào)表達(dá)不顯著或幅度明顯低于感病材料,說(shuō)明他們可能是白粉病病菌侵染中國(guó)南瓜過(guò)程中的主要感病因子。CmoMLO8和CmoMLO18在抗感材料中表達(dá)量變化趨勢(shì)整體上較一致,可能在抗感材料中參與了相似的生物學(xué)過(guò)程。CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19在接種感病材料后24 h表達(dá)量達(dá)到峰值,說(shuō)明接種后24 h是基因與白粉病病菌互作的關(guān)鍵時(shí)期。顏惠霞對(duì)南瓜白粉病病原菌侵染過(guò)程進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),接種后24 h白粉病病菌芽管伸長(zhǎng),形成初生菌絲,接種后36 h分生出次級(jí)菌絲,接種后96 h串生的分生孢子形成[28]。白粉病病菌侵染黃瓜葉片也有類(lèi)似的過(guò)程[29],本研究中基因表達(dá)量變化結(jié)果與該細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果相吻合。后續(xù)研究中可通過(guò)基因敲除或沉默技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19基因的功能。