郭俊杰, 劉悍寧, 吳 媛, 莊 鑫, 陳佳雯, 胡 星, 劉玉翠, 肖井雷

(1.長春中醫(yī)藥大學,吉林長春 130117; 2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,吉林長春 130021)

根際土壤真菌是土壤根際微生物的重要組成部分,其群落組成具有廣泛性和多樣性,在土壤中有機質的分解和養(yǎng)分的循環(huán)中發(fā)揮著關鍵的作用[1],與植物的生長和代謝密切相關[2-3]。同時隨著植物的生長,根際代謝活動逐漸變化,尤其是分泌一些有機物質,對其根際土壤真菌的組成和分布也會產生相應的影響[4-5]。現有研究表明植物的種類[6]、產地[7]和生長階段[8]的不同是影響根際土壤真菌結構的主要因素。

朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)是小檗科淫羊藿屬的多年生草本植物,其葉入藥,主要用于抗衰老、降低血壓、抑制腫瘤、增強免疫功能[5],淫羊藿中的功效成分主要為總黃酮及總黃酮醇苷,其中含總黃酮的含量以淫羊藿苷計,含總黃酮醇苷的含量以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的總量計[6]。本研究首先采用第2代高通量測序技術對不同采集地、不同采集時期的朝鮮淫羊藿根際土壤真菌多樣性進行分析,并采用HPLC法測定對應朝鮮淫羊藿活性成分的含量,進行相關性分析,以期為朝鮮淫羊藿仿野生種植土壤微生態(tài)的構建、有益微生物篩選提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Pico-21臺式離心機、Q32866 Qubit? 3.0熒光計(賽默飛世爾科技公司);Gl-88B漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);TND03-H-H混勻型干式恒溫器(深圳拓能達科技有限公司);DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽(北京市六一儀器廠);ETC811 PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司);Research plus 0.5-10 μL移液器(艾本德公司)。

1.2 材料

M5635-02磁珠土壤DNA小量提取試劑盒(美國OMEGA公司);Q10212 Qubit3.0 DNA檢測試劑盒(Life Technologies Corporation);2×Hieff?凝膠電泳 PCR預混液、Hieff NGSTMDNA 分選磁珠[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]。

采用抖落取樣法在吉林省臨江市區(qū)域采集朝鮮淫羊藿根際土壤,每個采集地選取3～5個采樣點,采集信息見表1。

表1 樣品信息

2 試驗方法

2.1 高通量測序分析

2.1.1 DNA提取 根際土壤總DNA提取參照M5635-02磁珠土壤DNA小量提取試劑盒說明書進行,采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性,并利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒檢測純度和濃度。

2.1.2 PCR擴增 以根際土壤總DNA為模板,共進行2輪PCR擴增,第1輪:PCR反應體系30 μL:正反引物各1 μL、2×Hieff? 凝膠電泳 PCR預混液 15 μL、DNA模板 10～20 ng,補ddH2O至30 μL,ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′,ITS2R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR反應條件為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,45 ℃ 20 s,65 ℃ 30 s,5個循環(huán);94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,20個循環(huán);72 ℃ 5 min,10 ℃停止。第2輪:PCR反應體系30 μL:正反引物各1 μL、2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL、Template DNA 20～30 ng,補ddH2O至30 μL,ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′,ITS2R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR反應條件:95 ℃ 3 min;94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,5個循環(huán);72 ℃ 5 min,10 ℃停止。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段大小,用DNA純化磁珠對DNA進行純化,純化產物用Qubit 3.0熒光定量儀進行濃度測定,之后進行Miseq測序。測序部分由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.1.3 數據處理與分析 使用Usearch 11.0.667 軟件對有效序列按照97%相似性將序列進行OTU聚類,再將每個OTU的代表序列與真菌UNITE數據庫進行比對,獲得代表性序列在各分類水平的物種注釋信息,并利用R 3.6.0軟件制作物種相對豐度柱狀圖和稀釋曲線圖,采用Mothur 1.43.0進行rarefaction分析和計算Ace指數、Chao1指數、香農(Shannon)指數和辛普森(Simpson)指數,用以進行微生物豐度和多樣性分析。采用R 3.6.0軟件進行PCoA主坐標分析和樣本層級聚類分析和制圖。多組間差異分析和制圖則采用LefSe 1.1.0軟件進行。2組間差異分析則采用STAMP 2.1.3軟件進行分析和制圖。使用Excel 2016和SPSS 21.0軟件對試驗數據進行統(tǒng)計,對樣品組間的差異采用單因素方差檢驗分析。

2.2 根際土壤真菌黃酮類成分分析

2.2.1 對照品溶液制備 精確稱取淫羊藿苷對照品適量,加甲醇制成0.104 mg/mL的溶液。

精確稱取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量,加甲醇制成含朝藿定A 0.104 mg/mL、朝藿定B 0.104 mg/mL、朝藿定C 0.100 mg/mL、淫羊藿苷0.100 mg/mL的混合溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取不同產地朝鮮淫羊藿葉片,粉碎過3號篩,取約0.2 g,置具塞錐形瓶中,精確加入稀乙醇20 mL,稱定質量,超聲處理1 h,放冷,再稱定質量,用稀乙醇補足減失的質量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液。

2.2.3 總黃酮含量測定

2.2.3.1 標準曲線制備 精確量取淫羊藿苷對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.6、2.0、2.4、2.8 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻。以相應試劑為空白,在270 nm波長處測定吸光度,以淫羊藿苷濃度C(μg/mL)為橫坐標,吸光度(D)為縱坐標,繪制標準曲線,回歸方程為y=0.004 7x-0.002 8,r=0.999 8,線性范圍為2.08～29.12 μg/mL。

2.2.3.2 樣品含量測定 參照2020年版《中國藥典》淫羊藿項下總黃酮含量測定方法[9]。

2.2.4 總黃酮醇苷含量測定

2.2.4.1 色譜條件 色譜柱Inertsil? ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相水(A)-乙腈(B);梯度洗脫0～37 min,24% 乙腈;37～47 min,24%～38% B,47～60 min,38%～24% B;檢測波長為 270 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL[10]。

2.2.4.2 標準曲線制備 精確吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10 μL,按“2.2.4.1”節(jié)色譜條件進樣分析,以進樣量(μg)為橫坐標,峰面積(A)為縱坐標,繪制標準曲線。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的回歸方程分別為y=236 084x+124.1、y=352 428x+1 683.1、y=251 598x+668.6、y=329 973x-6 238.7,決定系數r2均為0.999 9,線性范圍分別為0.208～1.040、0.208～1.040、0.200～1.000、0.200～1.000 μg。

2.2.4.3 樣品含量測定 取供試品溶液過 0.22 μm 濾膜后進樣分析。

3 結果與分析

3.1 OTU聚類和物種注釋

3.1.1 T1類樣品OTU聚類和物種注釋 通過對T1類5組樣品數據的質量進行質控過濾,共得到有效序列369 745條和4 170個OTU。由圖1可知,BT5組OTU數目為1 386個、DT5組1 792個、ST5組2 009個和NT5樣品1 705個,BT5組OTU數目為2 650個、DT5組2 777個、ST5組2 791個和NT5樣品2 465個,4組樣品共有OTU數目416個,占全部OTU數目的9.98%;BT1、DT1、ST1和NT1樣品特有OTU數目分別為354、499、563、469個,分別占本組OTU總數的25.54%、27.85%、28.02%、27.51%;ST1樣品OTU數目和特有OTU數目最多,BT1樣品最少。從門到屬對4組樣品所獲得的OTU進行物種注釋,除去未分類的,共得到16門56綱153目325科855屬真菌。

3.1.2 T5類樣品OTU聚類和物種注釋 通過對T5類樣品數據的質量進行質控過濾,共得到有效序列399 939條和4 983個OTU。由圖2可知,BT5組OUT數目為2 650個、DT5組2 777個、ST5組2 791個和NT5樣品2 465個,4組間共有OTU數目1 228個,占全部OTU數目的24.64%;4組特有OTU數目分別為401、419、477、297個,分別占本組樣品OTU數目的15.13%、15.09%、17.09%、12.05%。從門到屬對4組樣品所獲得的OTU進行物種注釋,除去未分類的,共得到15門58綱160目340科933屬真菌。與T1類樣品相比,T5類樣品OTU數目均有所升高,注釋得到的物種數目有所增加,表明7月朝鮮淫羊藿根際土壤真菌組成更為豐富。

3.2 α多樣性分析

3.2.1 質量分析 以隨機抽取一定數量的序列為橫坐標,OTU數目為縱坐標建立稀釋曲線(圖3),各組樣品在橫軸上曲線逐漸趨于平緩,表明本次測序結果合理,數據量足夠,能夠反映各組樣品的根際土壤真菌群落的真實情況。

3.2.2 T1類樣品α多樣性指數分析 由表2可知,4組樣品文庫覆蓋率均高達99%以上,表明注釋結果能夠反映各組樣品根際土壤真菌群落的真實情況。ST1樣品Ace指數和Chao1指數較BT1樣品顯著升高107.80%和44.27%(P<0.05),結果表明ST1樣品真菌物種數量最多,BT1樣品最少。對4組樣品的Shannon指數和Simpson指數進行比較,NT1樣品Shannon指數最高,較BT1、DT1和ST1樣品顯著升高30.00%、20.25%和37.82%(P<0.05),Simpson指數較BT1和DT1樣品顯著降低80.00%和86.67%(P<0.05),結果表明NT1樣品真菌群落多樣性最大。

表2 T1類樣品α多樣性指數分析

3.2.3 T5類樣品α多樣性指數分析 由表3可知,BT5樣品Ace指數最高,較ST5樣品顯著升高20.45%(P<0.05)。對4組樣品的Shannon指數和Simpson指數進行比較,BT5樣品的Shannon指數最高,Simpson指數最低,BT5樣品Shannon指數較NT5顯著升高45.48%(P<0.05),Simpson指數較DT5顯著降低82.61%(P<0.05),結果表明,BT5樣品真菌群落豐富度和多樣性最大。與T1類樣品相比,T5類樣品Ace指數和Chao1指數均有不同程度的升高,說明7月4個采集地朝鮮淫羊藿根際土壤真菌數目有所增加。

表3 T5類樣品α多樣性指數分析

3.3 β多樣性分析

3.3.1 T1類樣品β多樣性分析 采用R軟件的vegan的package進行T1類樣品的屬水平PCoA主坐標分析(圖4),橫坐標(PCoA1)解釋度為36.2%,縱坐標解釋度(PCoA2)為25.34%,總解釋度高達61.54%,表明該分析能較好地解釋其4組樣品的根際土壤真菌群落結構的關系;DT1和BT1樣品根際土壤真菌群落結構相似,距離較近,ST1和NT1樣品相對距離較遠,與另外2組樣品真菌群落結構差異較大;結合樣本層級聚類分析(圖5),結果進一步驗證了PCoA主坐標分析結果,當距離為0.1時,DT1和BT1樣品聚為1支,ST1和NT1單獨各聚為1支。

3.3.2 T5類樣品β多樣性分析 在屬水平分析T5類樣品真菌群落結構差異,結果(圖6)表明,橫坐標(PCoA1)解釋度為53.56%,縱坐標解釋度(PCoA2)為24.14%,總解釋度高達77.70%,表明該分析能較好地說明4組樣品的真菌群落結構的關系,由主坐標分析圖可知,DT5和NT5樣品距離較近,2組樣品的真菌群落結構較為相似。ST5和NT5樣品獨立聚集且與其他2組樣品距離較遠,說明與其他2組根際土壤真菌群落結構相似度較低;樣本層級聚類分析結果(圖7)表明,NT5組樣品聚為1支,DT5、ST5和BT5單獨各聚為1支,結果表明,各組樣品組內差異較小,而組間差異明顯。在PCoA主坐標分析中DT5樣品和NT5組距離較近,但該分析中DT5樣品獨立聚為1支,說明在微生物群落結構差異分析時應結合多種方法進行分析以確保結果的準確性。且通過T1類樣品和T5類樣品β多樣性分析結果綜合來看,時期的不同對真菌群落結構也存在一定的影響。

3.4 物種組成分析

3.4.1 T1類樣品門、屬水平物種組成分析 T1類樣品門水平上的物種組成和相對豐度(平均相對豐度>1%)見圖8、表4,除去未分類和其他,T1類樣品主要由擔子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)組成。其中擔子菌門、被孢霉門、子囊菌門相對豐度均>1%為核心菌門。5組樣品門水平物種組成上具有一定的相似性,但相對豐度具有明顯的差異,ST1和NT1樣品中擔子菌門為第一優(yōu)勢菌門,其次為子囊菌門、被孢霉門等。BT1和DT1樣品中則被孢霉門為第一優(yōu)勢菌門,其次為擔子菌門、子囊菌門等。

表4 T1類樣品門水平主要真菌相對豐度

T1類樣品屬水平上的物種組成和相對豐度(平均相對豐度>1%)見圖9、表5,除去未分類和其他,主要由被孢霉屬(Mortierella)、蠟殼耳屬(Sebacina)、Amphinema屬和棉革菌屬(Tomentella)等菌屬組成。其中被孢霉屬、蠟殼耳屬和棉革菌屬為4組樣品的核心菌屬。另外通過對平均相對豐度>1%的菌屬在各組樣品中的占比進行統(tǒng)計發(fā)現,3組樣品真菌群落豐度差異明顯, BT1、DT1和NT1樣品中被孢霉屬為第一優(yōu)勢菌屬,相對豐度分別為23.24%、49.99%、6.88%,其次為蠟殼耳屬和棉革菌屬等。ST1樣品中Amphinema屬為第一優(yōu)勢菌屬,相對豐度高達37.81%,其次為蠟殼耳屬(14.25%)、棉革菌屬(8.36%)、被孢霉屬(8.10%)、絲膜菌屬(5.16%)等。此外Amphinema屬為ST1樣品中特有優(yōu)勢菌屬,Piloderma屬和鎖瑚菌屬Clavulina為NT1樣品中特有優(yōu)勢菌屬。

表5 T1類樣品屬水平主要真菌相對豐度

3.4.2 T5類樣品門、屬水平物種組成分析 T5類樣品門水平上的物種組成和相對豐度(平均相對豐度>1%)由圖10和表6可知,除去其他,主要集中于擔子菌門、子囊菌門、被孢霉門、羅茲菌門等真菌類群。其中擔子菌門、子囊菌門、被孢霉門為核心菌門。4組樣品第一優(yōu)勢菌門均為擔子菌門,平均相對豐度高達73.62%,其次相對豐度較高的為子囊菌門。

T5類樣品屬水平上的物種組成和相對豐度(平均相對豐度>1%)見圖11和表7, 在屬水平上主要由蠟殼耳屬、棉革菌屬、紅菇屬、絲膜菌屬、Archaeorhizomyces屬、濕傘屬、被孢霉屬組成。核心菌屬為蠟殼耳屬和被孢霉屬。且通過主要菌屬的相對豐度進行整理發(fā)現,3組樣品真菌群落相對豐度差異明顯,NT5、DT5和BT5樣品中蠟殼耳屬為第一優(yōu)勢菌屬,相對豐度分別為60.33%、50.96%、33.03%,其次為紅菇屬、Archaeorhizomyces屬、濕傘屬等。而ST5樣品中棉革菌屬為第一優(yōu)勢菌屬,相對豐度為25.36%,其次為絲膜菌屬、蠟殼耳屬等。此外,紅菇屬為BT5樣品中特有優(yōu)勢菌屬。

表7 T5類樣品屬水平主要真菌相對豐度

3.5 組間差異分析

3.5.1 T1類樣品組間差異分析 為找尋T1類樣品中具有統(tǒng)計學差異的生物標記物,利用組間差異顯著性分析LefSe對4組根際土壤真菌群落進行比較, 結果見圖12。以LDA 評分>4為標準, 在BT1樣品中與其他組具有顯著差異的真菌群落主要為牛肝菌目(Boletales); DT1樣品中則為被孢霉屬、被孢霉科(Mortierellaceae)等;ST1樣品中Amphinema屬、傘菌綱(Agaricomycetes)、擔子菌門等與其他組別差異明顯;NT1樣品中為Piloderma屬、絲膜菌屬、羅茲菌門等。

3.5.2 T5類樣品組間差異分析 由圖13可知,以LDA評分>4為標準。在BT5樣品中與其他組具有顯著差異的真菌群落主要為紅菇屬、紅菇目(Russulales)、紅菇科(Russulaceae)等;DT5樣品中則為Archaeorhizomyces屬、Archaeorhizomycetes綱等;ST5樣品中棉革菌屬、絲膜菌屬、革菌目Thelephorales等與其他組別差異明顯;NT5樣品中為濕傘屬、蠟傘科(Hygrophoraceae)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)等。

3.5.3 T1和T5類樣品組間差異分析 由圖14-A可知,BT1和BT5樣品在門水平上相對豐度差異顯著(P<0.05)的菌門為被孢霉門和擔子菌門,BT1樣品中被孢霉門占絕對優(yōu)勢,而BT5樣品擔子菌門相對豐度顯著高于BT1;由圖14-B可知DT1和DT5樣品在門水平上相對豐度差異顯著(P<0.05)的菌門為被孢霉門和擔子菌門等,DT1樣品中被孢霉門占絕對優(yōu)勢,而DT5樣品擔子菌門相對豐度顯著高于DT1; 由圖14-C可知,ST1和ST5樣品在門水平上相對豐度差異顯著(P<0.05)的菌門為子囊菌門和羅茲菌門等,ST5樣品中子囊菌門相對豐度顯著高于ST1;由圖14-D可知,NT1和NT5樣品在門水平上相對豐度差異顯著(P<0.05)的菌門為擔子菌門和羅茲菌門等,NT5樣品擔子菌門相對豐度顯著高于NT1。綜合4個采集地5月和7月根際土壤真菌群落(門水平)發(fā)現,造成5月和7月根際土壤真菌群落組成差異主要受被孢霉門、擔子菌門和子囊菌門真菌影響。

3.6 根際土壤真菌黃酮類成分分析

各組樣品黃酮類成分測定結果見表8。

表8 各組樣品黃酮類成分測定結果

3.7 根際土壤真菌與黃酮類成分相關性分析

采用R 3.6.0軟件對5月朝鮮淫羊藿根際土壤真菌(屬水平)與黃酮類成分進行Spearman相關性分析,其中與黃酮類成分呈顯著或極顯著相關性菌屬較多。對平均相對豐度占比較高且與黃酮類化學成分具有顯著關系(P<0.05)的菌屬相關系數進行統(tǒng)計(表9),蠟殼耳屬與朝藿定A和朝藿定B呈顯著負相關(P<0.05);濕傘屬朝藿定C呈顯著正相關(P<0.05),與淫羊藿苷呈顯著負相關(P<0.05);紅菇屬與總黃酮醇苷呈顯著正向相關(P<0.05),Paraphoma屬與朝藿定C呈極顯著正相關(P<0.01),絲蓋傘屬與總黃酮呈顯著正相關(P<0.05),與淫羊藿苷和總黃酮醇苷呈極顯著正相關(P<0.01),鎖瑚菌屬除與朝藿定C和淫羊藿苷無顯著相關性外,與其他4種化學成分均呈顯著正相關(P<0.05)。

表9 5月根際土壤真菌主要菌屬與黃酮類成分相關系數

7月朝鮮淫羊藿根際土壤真菌(屬水平)與黃酮類成分相關性分析結果見表10,蠟殼耳屬與總黃酮呈顯著正相關(P<0.05),Archaeorhizomyces屬與淫羊藿苷呈顯著正相關(P<0.05),濕傘屬、被孢霉屬黃酮類化學成分均呈不同程度負相關,絕大部分顯著相關(P<0.05)。與5月不同的是,蠟殼耳屬在5月與朝藿定A和朝藿定B呈顯著負相關,而在7月與總黃酮呈顯著正相關。

表10 7月根際土壤真菌主要菌屬與黃酮類成分相關系數

4 討論與結論

研究表明,吉林省臨江市地區(qū)朝鮮淫羊藿根際土壤真菌群落主要由被孢霉屬和蠟殼耳屬組成。但因采集地點和采集時期的不同,相對豐度存在一定的差異。以上菌屬廣泛存在于植物的根際土壤中[7-10]。此外本研究發(fā)現不同采集地和不同采集時期的根際土壤真菌數量、種類、結構不同,原因可能是真菌組成和分布對外界環(huán)境變化較為敏感[11],4個采樣點雖同處于一個地區(qū),但降水量、土壤理化性質等因素可能是造成真菌組成和分布差異的因素之一[12];7月朝鮮淫羊藿根際土壤真菌群落豐富度高于5月,這一結論與康捷等的研究結果[13]較相似。

在本研究中被孢霉屬在朝鮮淫羊藿根際土壤中廣為分布,是5月不同采集地差異菌屬之一。相關研究表明,被孢霉屬在土壤中分布廣泛,可對土壤結構的改良[14]及植物的生長和代謝[15-16]起到一定的作用。蠟殼耳屬和紅菇屬屬于外生菌根真菌,在促進植物生長和對水分的吸收具有一定的作用[17-18],在本研究中蠟殼耳屬、紅菇屬、濕傘屬等菌屬是造成7月不同采集地不同生長階段根際土壤真菌群落結構差異的主要菌屬。

通過對吉林省臨江市地區(qū)不同采集地朝鮮淫羊藿根際土壤真菌多樣性進行分析表明,其根際土壤真菌種類豐富,受采集地和采集時期不同根際土壤真菌的種類、數量和結構存在不同程度的差異。通過進一步分析朝鮮淫羊藿根際土壤真菌與內在黃酮類成分之間的關系發(fā)現,在不同的采集時期真菌群落對其成分的影響也是不同的。

現有研究表明蠟殼耳屬中vermifera菌株可促進植物的生長和對磷元素的吸收,同時提高植株的抗灰霉病能力[19-20],在本研究中,7月根際土壤真菌中蠟殼耳屬與總黃酮呈顯著正相關(P<0.05)。此外Archaeorhizomyces屬具有良好的抗菌活性[21]。7月根際土壤真菌中該屬與淫羊藿苷呈正相關(P<0.05)。因此,依據本研究結果,可以推測蠟殼耳屬、Archaeorhizomyces屬等真菌類群與黃酮類化學成分含量具有正相關關系。研究結果可為后續(xù)篩選促進朝鮮淫羊藿黃酮類成分合成和積累或可產相似化學成分相關微生物提供理論依據。