陸曉林, 李 丹, 戴 昕, 姚燕來(lái), 王衛(wèi)平, 朱為靜

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所,浙江杭州 310021; 2.杭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,浙江杭州 310020;3.浙江省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,浙江杭州 310012)

番茄營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,是浙江省主要的蔬菜作物[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2017年浙江省設(shè)施番茄栽培面積超1萬(wàn)hm2,產(chǎn)值超億元[2]。特別是浙江省溫州市蒼南縣憑借獨(dú)特的物候優(yōu)勢(shì),已成為重要的番茄生產(chǎn)和供應(yīng)基地之一[3]。因此,番茄產(chǎn)業(yè)極大地增長(zhǎng)了當(dāng)?shù)剞r(nóng)村經(jīng)濟(jì)和農(nóng)民收入。但新形勢(shì)下,一些設(shè)施番茄大棚基地由于常年連作和不合理施肥等原因,造成番茄連作障礙現(xiàn)象普遍發(fā)生[2]。

番茄枯萎病作為番茄重要的土傳病害,最早于20世紀(jì)初被發(fā)現(xiàn)[4],目前在浙江省番茄優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)頻發(fā)[2],其在番茄植株上表現(xiàn)出植株萎蔫、葉片變黃、維管束褐變等系統(tǒng)癥狀,造成番茄嚴(yán)重減產(chǎn)[5]。已有研究表明,尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是番茄枯萎病主要致病菌之一[5-6]。此外,由于土壤中尖孢鐮刀菌的致病力、濃度和生長(zhǎng)速度關(guān)系到病害的發(fā)生和嚴(yán)重程度[7-9]。因此明確不同尖孢鐮刀菌的致病力差異及其在土壤中繁殖的最適環(huán)境因素,通過(guò)創(chuàng)造相應(yīng)的環(huán)境條件,有助于控制枯萎病的發(fā)生或蔓延[10-11]。但是,通過(guò)傳統(tǒng)手段如稀釋涂布計(jì)數(shù)或菌絲生長(zhǎng)測(cè)定來(lái)研究枯萎病病菌生長(zhǎng)的最適條件存在數(shù)據(jù)通量小和試驗(yàn)周期長(zhǎng)等弊端[11-13]。已有研究表明,Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析儀可連續(xù)監(jiān)測(cè)微生物的生長(zhǎng)速率并快速篩選出微生物菌株生長(zhǎng)的最優(yōu)條件[14]。當(dāng)前對(duì)不同尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)速度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及其最適生長(zhǎng)條件的快速篩選相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究從番茄枯萎病病株及其根際土壤上分離鑒定了3株代表性尖孢鐮刀菌,并對(duì)3株菌的致病特性和環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)行相關(guān)研究,旨在為番茄枯萎病的科學(xué)防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)病植株及其根際土壤于2021年3—5月采集自浙江省溫州市蒼南縣不同地區(qū)連作多年的設(shè)施番茄大棚內(nèi)。供試廣譜性生防細(xì)菌菌株分別為貝萊斯芽孢桿菌(BacillusvelezensisK1,K1)和解淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensJDF,JDF),由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所研究人員從蔬菜作物土壤根際分離得到。用于尖孢鐮刀菌分離培養(yǎng)及純化的培養(yǎng)基分別為尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基[11](去皮馬鈴薯200 g/L,瓊脂粉 20 g/L,無(wú)水乙醇16.2 mL/L,45%敵磺酸鈉2.1 g/L,硫酸鏈霉素0.75 g/L)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA:馬鈴薯浸出粉6 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂粉20 g/L,自然pH值)。用于生防細(xì)菌活化的培養(yǎng)基為lysogeny broth(LB)培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L,瓊脂粉 20 g/L,自然pH值)。供試0.05%HYPONeX植物營(yíng)養(yǎng)液從網(wǎng)上(http://www.hyponex.co.jp)購(gòu)買(mǎi)并按照說(shuō)明書(shū)的方法配制。供試藥劑:62.5 g/L精甲-咯菌腈懸浮種衣劑,購(gòu)自青島奧迪斯生物科技有限公司;65%代森錳鋅可濕性粉劑,購(gòu)自江西中迅農(nóng)化有限公司。供試番茄品種為合作903。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程(2021年6—12月)在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 尖孢鐮刀菌的分離及鑒定

分別采用組織分離法和梯度稀釋法[11,15]對(duì)發(fā)病植株及其根際土壤進(jìn)行尖孢鐮刀菌的分離。對(duì)分離得到的菌落采用尖端菌絲挑取法純化[16]:從菌落邊緣挑取適量菌絲轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上,相同條件下純化培養(yǎng),反復(fù)培養(yǎng)3～5代直到分離出形態(tài)一致的菌株。經(jīng)分離純化,共獲得20多株不同形態(tài)的尖孢鐮刀菌單菌落,委托生工生物工程(上海)股份有限公司提取待測(cè)真菌的DNA,再利用通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)對(duì)所提DNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)進(jìn)行擴(kuò)增[17]。用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小和特異性,隨后通過(guò)序列測(cè)定和同源性比較來(lái)鑒定未知真菌。最終,選取3株豐度較高的尖孢鐮刀菌作為代表性菌株,分別命名為6號(hào)、8號(hào)和19號(hào)。此外,在GenBank上下載3株分離菌株的rDNA-ITS序列用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建[5]。

1.3 尖孢鐮刀菌對(duì)番茄種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

將3株優(yōu)勢(shì)尖孢鐮刀菌接種到PDB培養(yǎng)基,并于28 ℃和160 r/min下振蕩培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后,分別制成106、105、104個(gè)/mL的孢子懸浮液,待用。各取10 mL孢子懸液(105、104個(gè)/mL)接入鋪有1層濾紙的培養(yǎng)皿中,并在培養(yǎng)皿中央散播飽滿(mǎn)一致的10顆番茄種子,置于孵育箱(26 ℃、70%相對(duì)濕度)暗培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定不同濃度尖孢鐮刀菌孢子懸浮液對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響[18]。設(shè)對(duì)照接種等量的滅菌PDB培養(yǎng)基的稀釋液,所有處理均重復(fù)3次。

采用水培法測(cè)定3株尖孢鐮刀菌對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響[19]。各取5 mL孢子懸浮液(105個(gè)/mL)接入到含有10 mL營(yíng)養(yǎng)液的離心管中。隨后,一個(gè)離心管移栽1顆番茄苗,并在24～30 ℃的溫室下培養(yǎng)[20]。每個(gè)處理包括8株番茄苗,3次重復(fù),對(duì)照接種等量的PDB培養(yǎng)基稀釋液。待發(fā)病后選取發(fā)病組織進(jìn)行病原菌的再次分離鑒定。枯萎病病害采用0～4級(jí)的5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),其中0級(jí),植株健康,無(wú)葉片發(fā)黃;1級(jí),植株無(wú)萎蔫癥狀,葉片發(fā)黃占比小于50%;2級(jí),植株無(wú)萎蔫癥狀,葉片發(fā)黃占比大于50%;3級(jí),植株葉片萎蔫,莖基部出現(xiàn)病斑;4級(jí),植株枯死。病情指數(shù)(disease index,DI)[21]采用如下公式進(jìn)行計(jì)算:

病情指數(shù)=∑(各級(jí)發(fā)病株數(shù)×該級(jí)代表值)×100/(調(diào)查總株數(shù)×病情最高級(jí)代表值)。

1.4 生防菌和藥劑對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用

采用平板對(duì)峙法測(cè)定生防菌對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響[22-23],用滅菌打孔器(直徑為5 mm)取活化好的尖孢鐮刀菌菌餅,倒扣在新鮮PDA培養(yǎng)基的一側(cè),然后在距離病原菌4 cm的位置再接種近似大小的生防菌單菌落。設(shè)不接種生防菌為對(duì)照,每處理重復(fù)3次。培養(yǎng)7 d后,測(cè)定各處理組尖孢鐮刀菌菌落平均半徑d,對(duì)照組尖飽鐮刀菌平均半徑為D,并計(jì)算抑制率。

利用菌絲生長(zhǎng)速率法[24],考察精甲-咯菌腈和代森錳鋅對(duì)尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)抑制作用。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上制成N(N≥6)個(gè)系列濃度的精甲-咯菌腈和代森錳鋅溶液,加入到PDA培養(yǎng)基混勻,以無(wú)菌水代替藥劑作為空白對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)4次。將尖孢鐮刀菌菌餅轉(zhuǎn)接到上述含藥PDA培養(yǎng)基和空白對(duì)照中,(28±2)℃培養(yǎng)7 d,用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)平均抑制率及藥劑對(duì)供試病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和抑制有效中濃度(EC50)[13]。菌絲生長(zhǎng)平均抑制率=(對(duì)照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值)/(對(duì)照菌落直徑均值-接種菌餅直徑)×100%。

1.5 尖孢鐮刀菌最適生長(zhǎng)條件測(cè)定

配制50 mL pH值分別為4、5、6、7和8以及NaCl濃度分別為0.5%、1%、2%和4%的PDB培養(yǎng)基。將不同pH值和NaCl濃度的PDB培養(yǎng)液在121 ℃下滅菌20 min,待冷卻至室溫后接種1%“1.3”節(jié)所制備的孢子懸浮液(105個(gè)/mL),混勻待測(cè)。各吸取0.2 mL培養(yǎng)液添加到加樣孔內(nèi),每組設(shè)置5個(gè)平行,將樣品板放入Bioscreen C(FP-1100-c,芬蘭)培養(yǎng)箱內(nèi),中速轉(zhuǎn)速和30 ℃條件下[14]培養(yǎng)72 h,根據(jù)菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)確定最適生長(zhǎng)pH值和NaCl濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2010、IBM SPSS 26.0和OriginPro 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、方差分析并作圖。不同數(shù)據(jù)組間差異顯著性分析采用Duncan’s新復(fù)極差法和Student’st檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較(α=0.05),所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌的分離鑒定

從發(fā)病番茄及其根際土壤中分離鑒定出3株占比較高的優(yōu)勢(shì)尖孢鐮刀菌菌株6號(hào)、8號(hào)和19號(hào)(表 1和圖 1)。此外,將這3株尖孢鐮刀菌ITS序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì),并下載與病原菌ITS序列同源性最為接近的4條序列,進(jìn)一步結(jié)合MEGA7.0分子軟件,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。發(fā)育樹(shù)顯示菌株6號(hào)、8號(hào)和19號(hào)的序列均與尖孢鐮刀菌的相似度高達(dá)100%,且菌株6號(hào)和8號(hào)在自舉值為100%水平上聚在同一個(gè)進(jìn)化分支上。

表1 優(yōu)勢(shì)鐮刀菌分離株的菌落形態(tài)特征

2.2 尖孢鐮刀菌致病力測(cè)定

3株尖孢鐮刀菌在不同濃度下對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響如圖3-A所示。104孢子懸浮液處理?xiàng)l件下,6號(hào)和8號(hào)菌株對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生了顯著(P<0.05)抑制,而19號(hào)株對(duì)萌發(fā)種子根長(zhǎng)的影響與對(duì)照相比,無(wú)顯著差異。105孢子懸液條件下,3株尖孢鐮刀菌均對(duì)萌發(fā)種子的根長(zhǎng)有顯著(P<0.05)抑制作用。

3株尖孢鐮刀菌對(duì)番茄幼苗的致病特性結(jié)果如圖3-B所示。6號(hào)和8號(hào)菌株孢子懸浮液培養(yǎng) 10 d 后,番茄幼苗表現(xiàn)出明顯的發(fā)病癥狀(圖3-C和圖3-D),病情指數(shù)均在80%以上,顯著高于在19號(hào)菌株孢子懸浮液培養(yǎng)下的病情指數(shù)(19.79%)(P<0.001)。

2.3 生防菌和抑菌藥劑對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗效果研究

生防菌K1和JDF與尖孢鐮刀菌的對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明,2株生防菌對(duì)3株尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用(圖4-A)。其中,生防菌JDF對(duì)3株尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)抑制率均在39%以上,且三者間無(wú)顯著差異(P>0.05)。而生防菌K1對(duì)8號(hào)菌株的抑制率顯著優(yōu)于6號(hào)和19號(hào)菌株(P<0.01),但總體上對(duì)三者的抑制率仍達(dá)到35%以上。

由表2可知, 精甲-咯菌腈和代森錳鋅對(duì)3株尖孢鐮刀菌均有一定的抑制作用。其中,精甲-咯菌腈對(duì)3株尖孢鐮刀菌的毒力作用優(yōu)于代森錳鋅,且2種藥劑對(duì)6號(hào)和8號(hào)菌株的抑制作用高于19號(hào)菌株。

表2 藥劑對(duì)尖孢鐮刀菌的毒力

2.4 pH值和鹽濃度對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響

生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果表明(圖5),3株尖孢鐮刀菌在pH值=4和NaCl濃度=2%條件下,生長(zhǎng)速度最快。其中,19號(hào)菌株對(duì)pH值和鹽濃度的適應(yīng)性更好,在pH值為4～8及NaCl濃度0.5%～4% 范圍內(nèi)均能快速生長(zhǎng)。而6號(hào)和8號(hào)菌株在酸性(pH值為4～5)和高鹽(NaCl濃度2%～4%)環(huán)境下,生長(zhǎng)速率更高。

3 討論與結(jié)論

了解番茄枯萎病病菌的種類(lèi)和環(huán)境適應(yīng)性是開(kāi)展有效防治的前提和基礎(chǔ)。本研究從番茄枯萎病株及其根際土壤分離得到3株豐度優(yōu)勢(shì)尖孢鐮刀菌6號(hào)、8號(hào)和19號(hào)。前人研究發(fā)現(xiàn),尖孢鐮刀菌為引發(fā)蔬菜作物枯萎病的主要病原菌之一[5,20,25]。此外,尖孢鐮刀菌存在多個(gè)生理小種[7-8],且這些菌株的致病力存在差異[10,25]。在本研究中,相比于19號(hào)菌株,6號(hào)和8號(hào)菌株對(duì)番茄種子和幼苗具有更高的抑制性或致病力。筆者推測(cè),19號(hào)菌株可能是弱致病力尖孢鐮刀菌,由于缺失了譜系特異性區(qū)域而對(duì)宿主植物具有非致病性[7,9]。而關(guān)于6號(hào)和8號(hào)菌株如何侵染宿主致其發(fā)病的相關(guān)機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

多黏類(lèi)芽孢桿菌(Bacillusspp.)是廣泛存在于自然界的重要的生物防治微生物資源,其生防機(jī)制主要有生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)、抑菌物質(zhì)產(chǎn)生、重寄生作用與改善植物生長(zhǎng)等[26-27]。多效拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在作物綠色防控上的作用更是已被前人所證實(shí)[4,28]。本試驗(yàn)表明,2種生防菌對(duì)3株尖孢鐮刀菌均有一定的抑制作用,尤其是解淀粉芽孢桿菌對(duì)3株尖孢鐮刀菌的抑制率較高,達(dá)到39.64%～44.57%,因而解淀粉芽孢桿菌用于防控本研究中尖孢鐮刀菌引起的枯萎病會(huì)更有潛力。而枯萎病害的發(fā)生往往是由多種尖孢鐮刀菌復(fù)合侵染作物引起,因此在摸清致病菌株致病特性基礎(chǔ)上開(kāi)展專(zhuān)用生防菌的篩選顯得尤為重要。此外,精甲-咯菌腈和代森錳鋅等殺菌劑已廣泛用于經(jīng)濟(jì)作物真菌病害的防治中[3,13]。謝昀燁等研究表明,代森錳鋅在田間防效上效果遠(yuǎn)高于精甲-咯菌腈,病原菌菌株差異性可能是其與本研究結(jié)果不一致的主要原因[3]。

本研究在室內(nèi)條件下探索了3株尖孢鐮刀菌的最適生長(zhǎng)條件,明確了3株菌在pH值=4和NaCl濃度=2%條件下生長(zhǎng)速度最快,這一結(jié)論與前人的研究結(jié)果[11,29]相似。由于氮素化肥的大量使用,我國(guó)設(shè)施大棚土壤酸化問(wèn)題十分突出,而酸化的土壤環(huán)境更加有利于尖孢鐮刀菌等土傳病原真菌的生長(zhǎng)和繁殖[11]。在中性或堿性條件下,致病力較強(qiáng)的6號(hào)和8號(hào)菌株的生長(zhǎng)速率均受到了一定程度的抑制。因此,在不影響作物生長(zhǎng)的前提下,提升酸化土壤pH值,或許可在一定程度上控制枯萎病的發(fā)生或蔓延。此外,研究發(fā)現(xiàn),較高的鹽濃度可顯著促進(jìn)6號(hào)和8號(hào)致病菌株的生長(zhǎng),這一現(xiàn)象與尖孢鐮刀菌為耐鹽真菌的結(jié)論[30]一致。

綜上所述,本研究對(duì)設(shè)施番茄大棚內(nèi)優(yōu)勢(shì)尖孢鐮刀菌的致病特性和環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)行了考察,研究結(jié)果為掌握番茄枯萎病的發(fā)病規(guī)律及開(kāi)發(fā)相應(yīng)的防治手段提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和參考。