鄭 偉, 吳亞維, 宋 莎, 羅昌國(guó), 王 彬

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所,貴州貴陽(yáng) 550006)

蘋果白粉病病原為白叉絲單囊殼(Podosphaeraleucotricha),屬于子囊菌亞門叉絲單囊殼屬,無性階段(Oidiumsp.)屬半知菌類真菌,在我國(guó)蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍[1]。該病也是貴州省威寧縣蘋果生產(chǎn)中的主要病害之一,芽、嫩梢、花、葉及幼果都會(huì)受到侵染,嚴(yán)重影響樹勢(shì),降低產(chǎn)量,嚴(yán)重制約威寧縣優(yōu)質(zhì)蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

韓婷婷等以白肉蘋果金冠為母本、紅肉蘋果紅勛1號(hào)為父本雜交獲得的F1代為試材,對(duì)雜交后代的性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析[3]。李政等以18個(gè)新疆野蘋果優(yōu)系、23個(gè)鮮食蘋果品種和7個(gè)蘋果砧木品種為材料,對(duì)3類蘋果資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析[4]。侯麗媛等以山定子和25份蘋果栽培品種為試驗(yàn)材料,利用16 對(duì)熒光SSR 分子標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行分子鑒定,同時(shí)進(jìn)行了遺傳多樣性分析,并構(gòu)建了各供試材料的指紋數(shù)據(jù)和分子身份證[5]。索相敏等利用TRAP(target region amplified polymorphism)分子標(biāo)記對(duì)蘋果屬30 個(gè)種和梨屬3 個(gè)種共33 份材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析[6]。侯麗媛等利用TP-M13-SSR 技術(shù)對(duì)供試材料進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建,在此基礎(chǔ)上采用GenAlEx 6.501 軟件對(duì)供試材料進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析,利用Ntsys 軟件基于Jaccard 系數(shù)進(jìn)行了UPGMA聚類分析[7]。侯麗媛等以赤霞及其親本和部分蘋果栽培品種為試驗(yàn)材料,利用16 對(duì)熒光SSR 分子標(biāo)記進(jìn)行分子鑒定的同時(shí)構(gòu)建了指紋圖譜,并進(jìn)行了遺傳多樣性分析[8]。于少帥等利用15 對(duì)特異性SSR 引物對(duì)290 份新疆野蘋果和栽培蘋果樣品進(jìn)行擴(kuò)增,并通過分子生物學(xué)方法分析其遺傳變異特征與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[9]。蘇艷麗等做了SSR標(biāo)記的開發(fā)在蘋果遺傳多樣性中的應(yīng)用研究[10]。高源等對(duì)蘋果屬15 個(gè)種的葉綠體DNA變異與遺傳分化進(jìn)行了研究,對(duì)蘋果屬植物種質(zhì)多樣性的 SLAF-seq 進(jìn)行了分析[11-12]。有多位學(xué)者對(duì)蘋果樹腐爛病、莖溝病毒、褪綠葉斑病毒、褐斑病、炭疽病等的遺傳多樣性進(jìn)行了分析[13-17]。雖然前人在以上方面研究很多,但在不同蘋果品種白粉病田間抗性與遺傳多樣性相關(guān)性方面報(bào)道還很少。采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)16份蘋果送檢樣品進(jìn)行了DNA鑒定,建立供試種質(zhì)的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù),并對(duì)白粉病田間抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)和遺傳多樣性分析,了解不同蘋果品種間親緣關(guān)系以及與白粉病抗性之間關(guān)系,以期為抗性利用、病害防治和新品種選育等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鑒定材料詳細(xì)信息見表1。

表1 材料編號(hào)及名稱

取樣時(shí)間:2017年5月18日;取樣地點(diǎn):威寧縣雪山鎮(zhèn)新街果園。

1.2 檢測(cè)方法和調(diào)查方法

1.2.1 DNA的提取及檢測(cè) 采用天根生物科技(北京)有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP320-03)提取樣品DNA,操作方法參考試劑盒使用說明,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量后,-20 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 從33條ISSR引物中篩選出19條譜帶清晰、多態(tài)性較好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列及其退火溫度見表2。PCR反應(yīng)體系為 10 μL:3.0 μL ddH2O;0.8 μL 10 μmol/L ISSR引物;1.2 μL 50 ng/μL DNA模板;5.0 μL 2×TaqPCP Master Mix;最后加1滴石蠟油防止蒸發(fā)。

表2 ISSR引物序列及退火溫度

PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,40～56 ℃退火45 s(退火溫度隨引物而異),72 ℃ 延伸90 s,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。

1.2.3 電泳檢測(cè) 取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,在含GoldviewⅠ型核酸染色劑(0.6 μg/mL)的1.5%瓊脂糖凝膠中以110 V的恒定電壓電泳50 min,以DL2000[天根生化科技(北京)有限公司]為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照,然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察,將所成圖像拍照保存。

1.2.4 發(fā)病情況調(diào)查 在蘋果葉片采集的當(dāng)天,對(duì)園內(nèi)的各品種進(jìn)行白粉病的發(fā)病情況調(diào)查。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物按在相同遷移位置上(相同分子量片段)有帶記為“1”,無帶記為“0”,全部以1、0統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫(kù),轉(zhuǎn)換為數(shù)值矩陣后,用NTSYSpc 2.10e分析軟件中的Qualitative data進(jìn)行矩陣分析和SAHN Clustering計(jì)算相似系數(shù),并按UPMGA法構(gòu)建親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA指紋圖譜

篩選出的19 條引物均能擴(kuò)增出1條以上的清晰條帶,引物的有效擴(kuò)增率達(dá)到了100%,共擴(kuò)增出101條譜帶,多態(tài)性譜帶83條,送檢樣品的指紋圖譜詳見表3,圖1為引物835的擴(kuò)增譜帶。

表3 送檢樣品DNA指紋圖譜

2.2 樣品間的親緣關(guān)系

利用19條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的標(biāo)記信息,計(jì)算16份蘋果樣品的相似性系數(shù)。結(jié)果表明,被測(cè)樣品間相似系數(shù)范圍為0.56～0.93,遺傳相似系數(shù)見表4。從圖2可以看出,在遺傳距離0.63處供試材料被分成2大類,第1類只有1份材料,為翠秋;第2類包括15 份材料,其中以遺傳距離0.72 為閾值,該類分為5 小類,其中涼香的季節(jié)、王富、96-1、華富、布瑞本、涼香、華紅、皮諾娃聚在一起,說明這幾個(gè)品種親緣關(guān)系較近;天紅2號(hào)、紅富士、蜜脆、紅露聚到了一起,說明這幾個(gè)品種親緣關(guān)系較近;紅蓋露、王林、玉華早富都是單獨(dú)的一類,說明這幾個(gè)品種都與其他品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。樣品7號(hào)(涼香的季節(jié))與8號(hào)(王富)的的遺傳距離最小,親緣關(guān)系最近,相似系數(shù)為0.93;樣品1號(hào)(脆秋)與12號(hào)(王林)的遺傳距離最大,親緣關(guān)系最遠(yuǎn),相似系數(shù)為0.56。

表4 蘋果樣品間遺傳相似系數(shù)

2.3 不同品種親緣關(guān)系與蘋果白粉病抗性的相關(guān)性

從圖3和表5可以看出,天紅2號(hào)屬于高抗品種,王林屬于中抗品種,涼香的季節(jié)、王富屬于抗病品種,96-1、華紅、紅富士屬于感病品種,紅露、華富、涼香、玉華早富、布瑞本、翠秋、皮諾瓦、蜜脆屬于中感品種,紅蓋露屬于高感品種。從圖2和圖3可以看出,涼香的季節(jié)與王富親緣關(guān)系最近,對(duì)蘋果白粉病抗性的差異也較小,都屬于抗病品種。而涼香的季節(jié)、王富、96-1、華富、布瑞本、涼香、華紅、皮諾娃這幾個(gè)品種親緣關(guān)系較近,但對(duì)蘋果白粉病抗性的差異卻相差很大,脆秋與王林的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),但對(duì)白粉病的抗性差異卻不是最小的。由此可見不同蘋果品種對(duì)白粉病的抗性與親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近沒有太大的相關(guān)性。

表5 抗白粉病鑒定分級(jí)

3 討論與結(jié)論

ISSR是在微衛(wèi)星標(biāo)記的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的分子標(biāo)記技術(shù)[18],能夠揭示植物的遺傳多態(tài)性,有效反映出品種間的親緣關(guān)系[19]。其引物容易設(shè)計(jì),開發(fā)費(fèi)用低,PCR條件更為嚴(yán)謹(jǐn),試驗(yàn)重復(fù)性強(qiáng),操作過程簡(jiǎn)單,不需使用同位素,可以揭示更高程度的DNA多態(tài)性[20]。目前ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在果樹、蔬菜、食用菌、茶葉、中藥材、花卉等植物上進(jìn)行遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定以及構(gòu)建遺傳連鎖圖譜等方面[21-31]。研究結(jié)果表明,ISSR標(biāo)記技術(shù)是一種非?？煽康挠行Чぞ?在蘋果樹種上,ISSR 標(biāo)記技術(shù)主要應(yīng)用在雜交后代與親本遺傳[32-33]、芽變鑒定[34-35]、砧木資源遺傳多樣性[36-37]、病菌基因多態(tài)性的ISSR分析[38]、栽培品種ISSR分析[39]和指紋圖譜構(gòu)建[40]等。本研究利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)研究在貴州威寧蘋果園內(nèi)種植的16 份蘋果栽培品種的遺傳多樣性,篩選出的19條引物均能擴(kuò)增出1條以上的清晰條帶,引物的有效擴(kuò)增率達(dá)到了100%,共擴(kuò)增出101條譜帶,其中多態(tài)性譜帶83條,多態(tài)性比率為82.18%,表明這19條ISSR引物能夠用于16個(gè)蘋果品種的遺傳關(guān)系分析。進(jìn)一步遺傳分析表明,在標(biāo)記檢測(cè)范圍內(nèi),16份蘋果樣品表現(xiàn)出遺傳差異性,其遺傳距離在0.56～0.93。聚類分析顯示,以相似系數(shù)0.63為標(biāo)準(zhǔn),可將供試的16份蘋果品種劃分為2大類,第1類只有1份材料,為翠秋;第2類包括15份材料,其中以遺傳距離0.72為閾值,該類分為5小類,其中涼香的季節(jié)與王富的遺傳距離最小,親緣關(guān)系最近,相似系數(shù)為0.93;脆秋與王林的遺傳距離最大,親緣關(guān)系最遠(yuǎn),相似系數(shù)為0.56。但總的來說,遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)群體的相似系數(shù)普遍較高,這表明篩選出的ISSR 引物具有一定的代表性,可為之后蘋果的品種資源多態(tài)性及抗病性的鑒定提供一定的參考。而不同品種田間抗性的調(diào)查數(shù)據(jù)和親緣關(guān)系的分析數(shù)據(jù)顯示,不同蘋果品種對(duì)白粉病的抗性與親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近沒有太大的相關(guān)性。