桃葉珊瑚苷通過活化miR-1294/YWHAZ信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移

尹 恒 羅全慧 殷 浩 劉毅力 趙 琳

宮頸癌起源于宮頸上皮,是女性最常見的泌尿生殖道惡性腫瘤之一[1]。宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚不明確,與乳頭瘤病毒感染、吸煙、炎癥等關(guān)系密切[2, 3]。早期宮頸癌患者的臨床癥狀不明顯,中晚期宮頸癌患者的治療效果較差,預(yù)后不良[4, 5]。細(xì)胞增殖和遷移在宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[6～8]。桃葉珊瑚苷提取自車前草、玄參、地黃等傳統(tǒng)中藥材,是一種環(huán)烯醚萜苷化合物[9]。桃葉珊瑚苷在細(xì)胞氧化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,具有抗炎、抗腫瘤的功效[10]。桃葉珊瑚苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響尚未明確。本研究旨在探討桃葉珊瑚苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響,結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探究桃葉珊瑚苷可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1.細(xì)胞、藥品和試劑:宮頸癌C-33A細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)。桃葉珊瑚苷購自美國MedChemExpress公司(分析純、批號(hào):N20151634)。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、熒光素酶報(bào)告野生型載體WT-酪氨酸3單加氧酶-色氨酸5單加氧酶激活蛋白ζ(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta,YWHAZ)和突變型載體MUT-YWHAZ購自美國Promega公司。miR-1294序列、無意序列(miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。二代測(cè)序由廣州銳博生物科技有限公司完成。噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)試劑盒購自南京博恩生物技術(shù)有限公司。qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo公司。一抗β-actin、YWHAZ、p-Akt、p-PRAS40、mTORC1、SGK1抗體均購自英國Abcam公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和處理:宮頸癌C-33A細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)參數(shù)為37℃、5%濃度CO2。C-33A細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期,分別采用0、20、40、60、80、100μmol/L桃葉珊瑚苷處理。經(jīng)0μmol/L桃葉珊瑚苷處理的C-33A細(xì)胞為對(duì)照組,經(jīng)80μmol/L桃葉珊瑚苷處理的C-33A細(xì)胞為桃葉珊瑚苷組,48h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)miRNA表達(dá)差異。

3.MTT法檢測(cè)C-33A細(xì)胞增殖活性:將不同濃度桃葉珊瑚苷處理的C-33A細(xì)胞按照2.5×104個(gè)/毫升接種于96孔細(xì)胞板,每孔200μl,培養(yǎng)36h,在每個(gè)孔中加入10%質(zhì)量濃度的MTT試劑15μl,培養(yǎng)箱中反應(yīng)5h。真空吸去上清液,每孔添加130μl二甲基亞砜試劑,震蕩30min,采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔C-33A細(xì)胞在490nm波長處的吸光度(A)值。

4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C-33A細(xì)胞遷移情況:將對(duì)照組和桃葉珊瑚苷組C-33A細(xì)胞懸液按照2.5×105個(gè)/毫升接種于24 孔板,每孔3ml。細(xì)胞貼壁后,經(jīng)10μl移液器吸頭在孔底直線劃痕,10倍光學(xué)顯微鏡觀察并分析劃痕寬度C1。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h,繼續(xù)用光學(xué)顯微鏡觀察并分析劃痕寬度C2。對(duì)照組和桃葉珊瑚苷組C-33A細(xì)胞劃痕愈合率(%)=(C1-C2)/C1×100%。

5.qRT-PCR檢測(cè)miR-1294和YWHAZ mRNA表達(dá):Trizol法提取C-33A細(xì)胞總RNA,瓊脂糖凝膠分析RNA的純度和濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為97℃預(yù)變性10min,97℃ l5s,60℃退火40s,70℃延伸40s,41次循環(huán)。引物如下:miR-1294上游引物:5′- CTCACGAGAGAGGAAGGCA-3′,下游引物:5′-ACCTCAAGAACAGTATTTCCAGG-3′;β-actin上游引物:5′- CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′,下游引物:5′- AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′;YWHAZ上游引物:5′-CCTGCATGAAGTCTGTAACTGAG-3′,下游引物:5′-GACCTACGGGCTCCTACAACA-3′;U6上游引物:5′- TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′,下游引物:5′- GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。miR-1294表達(dá)變化以U6為內(nèi)參,YWHAZ mRNA表達(dá)變化以β-actin為內(nèi)參。

6.靶基因預(yù)測(cè)和鑒定:通過MicroRNAdb數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-1294具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的基因是YWHAZ。分別將WT-YWHAZ、MUT-YWHAZ 與miR-1294、miR-NC共轉(zhuǎn)染至C-33A細(xì)胞,培養(yǎng)箱孵育48h。裂解細(xì)胞,采用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒分別檢測(cè)C-33A細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶活性以及海腎熒光素酶活性,相對(duì)熒光素酶活性為二者的比值。

7.Western blot法檢測(cè)YWHAZ和Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá):細(xì)胞裂解液裂解C-33A細(xì)胞,13000r/min離心40min,取上清加入蛋白緩沖液。經(jīng)15%十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜后,通過30g/L的脫脂牛奶封閉,分別添加一抗YWHAZ(1∶4000稀釋)、p-Akt(1∶1000稀釋)、p-PRAS40(1∶1000稀釋)、β-actin(1∶4000稀釋)、mTORC1(1∶2000稀釋)、SGK1(1∶2000稀釋),4℃搖床孵育10h。TBST溶液洗膜,添加二抗山羊抗鼠,室溫?fù)u床孵育2.5h。加入ECL發(fā)光顯影液,在Bio-Rad成像儀中曝光、顯影。

結(jié) 果

1. 桃葉珊瑚苷對(duì)C-33A細(xì)胞增殖活性的影響:MTT結(jié)果顯示,0、20、40、60、80、100μmol/L桃葉珊瑚苷處理后宮頸癌C-33A細(xì)胞A值分別為1.02±0.17、0.75±0.06、0.61±0.10、0.41±0.05、0.17±0.09、0.47±0.12,與0μmol/L比較,不同濃度的桃葉珊瑚苷處理后的C-33A細(xì)胞增殖活性明顯降低(F=28.90,P<0.05,圖1),選擇對(duì)C-33A細(xì)胞增殖活性抑制作用最明顯的80μmol/L桃葉珊瑚苷做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 桃葉珊瑚苷對(duì)C-33A細(xì)胞增殖活性的影響與0μmol/L比較,*P<0.05,**P<0.01

2.桃葉珊瑚苷對(duì)C-33A細(xì)胞遷移能力的影響:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組和桃葉珊瑚苷組C-33A細(xì)胞的劃痕愈合率分別為59.28%±9.93%和25.75%±9.29%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.93,P<0.01,圖2),表明桃葉珊瑚苷可抑制C-33A細(xì)胞的遷移能力。

圖2 桃葉珊瑚苷對(duì)C-33A細(xì)胞遷移能力的影響

3.桃葉珊瑚苷對(duì)C-33A細(xì)胞miR-1294表達(dá)的影響:二代測(cè)序結(jié)果顯示,對(duì)照組和桃葉珊瑚苷組C-33A細(xì)胞中miR-1294的表達(dá)差異最明顯(P<0.01)。qRT-PCR結(jié)果顯示,對(duì)照組和桃葉珊瑚苷組C-33A細(xì)胞中miR-1294的表達(dá)分別為1.01±0.62和10.14±2.02,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.65,P<0.01)。

4.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-1294的靶基因:采用MicroRNAdb數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-1294具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的基因是YWHAZ,YWHAZ mRNA野生型位點(diǎn)和突變型位點(diǎn)詳見圖3。

圖3 miR-1294與YWHAZ mRNA的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)

5.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-1294靶向結(jié)合YWHAZ mRNA:雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,WT-YWHAZ+miR-NC和WT-YWHAZ+miR-1294相對(duì)熒光素酶活性分別為0.99±0.16和0.20±0.08,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.76,P<0.01);MUT-YWHAZ+miR-NC和MUT-YWHAZ+miR-1294相對(duì)熒光素酶活性分別為0.98±0.11和1.01±0.24,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.17,P>0.05,圖4)。

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-1294與YWHAZ mRNA的結(jié)合與miR-NC比較,*P<0.01

6.桃葉珊瑚苷對(duì)YWHAZ mRNA表達(dá)的影響:qRT-PCR結(jié)果顯示,對(duì)照組和桃葉珊瑚苷組C-33A細(xì)胞中YWHAZ mRNA表達(dá)分別為4.74±1.22和1.01±0.22,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.00,P<0.01)。

7.桃葉珊瑚苷對(duì)YWHAZ和Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響:Western blot法結(jié)果顯示,桃葉珊瑚苷處理C-33A細(xì)胞后,YWHAZ蛋白表達(dá)明顯下降,Akt信號(hào)通路蛋白p-Akt、p-PRAS40、mTORC1、SGK1表達(dá)明顯下降(圖5)。

圖5 桃葉珊瑚苷對(duì)C-33A細(xì)胞YWHAZ蛋白和Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,*P<0.01

討 論

傳統(tǒng)中藥提取物已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要途徑之一,越來越多的中藥及其活性成分被發(fā)現(xiàn)能夠抑制宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展[11～13]。Yao等[14]研究表明,黃豆苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞能夠產(chǎn)生毒性作用,具有對(duì)宮頸癌細(xì)胞黏附的抑制特性,同時(shí)能夠通過調(diào)控宮頸癌細(xì)胞線粒體膜的通透性,誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。Xue等[15]研究表明,不同濃度的柴胡舒肝散對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞系均具有明顯的抗腫瘤作用,抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。Lin等[16]研究表明,柚皮苷能夠誘導(dǎo)宮頸癌C-33A、SiHa和HeLa細(xì)胞的凋亡,觸發(fā)細(xì)胞周期停滯,發(fā)揮明顯的抗增殖作用。桃葉珊瑚苷是多種中草藥如杜仲等的關(guān)鍵活性成分,能夠減少活性氧的形成,具有顯著的抗癌、抗炎作用[17]。本研究結(jié)果顯示,宮頸癌C-33A細(xì)胞給予桃葉珊瑚苷處理后,C-33A細(xì)胞的增殖活性和遷移能力顯著下降,提示桃葉珊瑚苷能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

微小RNA(miRNA)是一種長度約為22個(gè)核苷酸的低分子RNA,不具有編碼蛋白的潛力,在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮表觀遺傳調(diào)節(jié)作用,對(duì)靶基因的表達(dá)產(chǎn)生顯著的負(fù)調(diào)節(jié)作用,其表達(dá)改變是中藥活性成分發(fā)揮抗癌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制[18,19]。miR-1294在肝癌、非小細(xì)胞肺癌、腎透明細(xì)胞癌等惡性腫瘤中低表達(dá),恢復(fù)miR-1294表達(dá)能夠顯著抑制惡性腫瘤的進(jìn)展[20,21]。Chen等[22]研究顯示,miR-1294在宮頸癌組織和細(xì)胞系表達(dá)明顯降低,過表達(dá)miR-1294可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和糖酵解。本研究顯示,宮頸癌C-33A細(xì)胞給予桃葉珊瑚苷處理后,miR-1294表達(dá)明顯增加,提示桃葉珊瑚苷通過調(diào)控miR-1294表達(dá)發(fā)揮抗癌作用。

本研究進(jìn)一步通過MicroRNAdb數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-1294與YWHAZ具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,miR-1294能顯著降低野生型載體WT-YWHAZ的相對(duì)熒光素酶活性,而對(duì)突變型載體MUT-YWHAZ的相對(duì)熒光素酶活性沒有明顯作用,證實(shí)YWHAZ能夠靶向結(jié)合miR-1294。YWHAZ在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是一種高度保守的基因,其編碼的蛋白通過結(jié)合含磷酸絲氨酸的蛋白,參與調(diào)控多種分子信號(hào)通路的活化和抑制。研究顯示,YWHAZ基因在宮頸癌組織中高表達(dá),是一種癌基因,其可顯著促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展[22]。

本研究結(jié)果顯示,宮頸癌C-33A細(xì)胞給予桃葉珊瑚苷處理后,C-33A細(xì)胞中YWHAZ基因表達(dá)顯著減少,進(jìn)一步證明YWHAZ是miR-1294的靶基因。YWHAZ蛋白主要通過激活A(yù)kt信號(hào)通路發(fā)揮促癌作用,而Akt信號(hào)通路在促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[23～25]。本研究結(jié)果顯示,桃葉珊瑚苷處理C-33A細(xì)胞后,Akt信號(hào)通路蛋白Akt信號(hào)通路蛋白p-Akt、p-PRAS40、mTORC1、SGK1表達(dá)明顯下降,間接證明桃葉珊瑚苷在宮頸癌細(xì)胞中通過調(diào)節(jié)miR-1294/YWHAZ表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述,本研究探究了桃葉珊瑚苷通過活化miR-1294,抑制YWHAZ基因表達(dá)和Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而降低宮頸癌C-33A細(xì)胞的增殖和遷移能力。本研究豐富了桃葉珊瑚苷的抗癌作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。