周域，鄧麗平，胡俊，吳勐，壽玥鶯，高潔婷，李韋

平湖市第一人民醫(yī)院藥劑科，浙江平湖 314200

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病[1]，以發(fā)病率高、危害大、反復(fù)發(fā)作為特點(diǎn)，對(duì)人體生命健康造成嚴(yán)重危害。目前，全球支氣管哮喘患者已超過(guò)3.58 億，其中我國(guó)約占6.67%[2]。臨床常采用β2受體激動(dòng)劑、M 膽堿受體阻斷劑、吸入性糖皮質(zhì)激素、白三烯受體阻斷劑、磷酸二酯酶抑制劑等藥物治療，但不良反應(yīng)較多、易耐受等問(wèn)題突出。中醫(yī)治療支氣管哮喘能夠改善患者癥狀且不良反應(yīng)少，不易產(chǎn)生耐藥性，具有一定的治療優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為腎主納氣，若腎氣不足，則出現(xiàn)呼多吸少、吸氣困難、動(dòng)則喘甚等癥。喘可治注射液為國(guó)家二類新藥，主要由淫羊藿、巴戟天組成，其味甘性溫，入脾腎經(jīng)，功能溫腎助陽(yáng)，止咳平喘[3]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接驗(yàn)證對(duì)喘可治注射液治療支氣管哮喘的活性成分、靶點(diǎn)、通路、生物過(guò)程等進(jìn)行研究，為臨床合理用藥提供佐證。

1 資料與方法

1.1 確定活性成分

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）中以“淫羊藿”“巴戟天”為關(guān)鍵詞檢索喘可治注射液中淫羊藿、巴戟天2 味中藥的活性成分，以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)納入活性成分。從ChemicalBook、PubChem 中獲得活性成分相關(guān)化學(xué)信息及化學(xué)結(jié)構(gòu)，保存為sdf 格式文件。

1.2 活性成分-靶點(diǎn)篩選

將從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的活性成分的分子結(jié)構(gòu)上傳至SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)。以“淫羊藿”“巴戟天”為關(guān)鍵詞在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索喘可治注射液中淫羊藿、巴戟天2 味中藥的活性成分所對(duì)應(yīng)靶蛋白，在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（the human gene database，GeneCards）中將所得靶蛋白轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，整合并刪除以上2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中重復(fù)靶點(diǎn)后明確活性成分中的最終靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)篩選及活性成分-支氣管哮喘靶點(diǎn)構(gòu)建

以“支氣管哮喘（bronchial asthma）”為關(guān)鍵詞，在GeneCards、比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（comparative toxicogenomics database，CTD）中進(jìn)行檢索。整合去重后得到支氣管哮喘靶點(diǎn)。將支氣管哮喘靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)輸入Fun Rich 軟件，二者交集作為喘可治注射液治療支氣管哮喘的靶點(diǎn)，將上述靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-支氣管哮喘靶點(diǎn)圖。

1.4 活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將活性成分-靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 平臺(tái)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值“medium confidence=0.4”，其他參數(shù)保持默認(rèn)值。將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，利用“network analysis”功能計(jì)算各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度值、介數(shù)及最短路徑等拓?fù)鋮?shù)，節(jié)點(diǎn)的度值、介數(shù)、最短路徑越大，該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置就越重要[4]。選取度值、介數(shù)、最短路徑同時(shí)在平均值之上的靶蛋白、活性成分作為喘可治注射液治療支氣管哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵活性成分。

1.5 KEGG 通路富集和GO 生物過(guò)程分析

運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)喘可治注射液治療支氣管哮喘的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集，在OmicShare 云平臺(tái)進(jìn)行可視化處理。利用Origin 軟件將得到的GO 生物過(guò)程進(jìn)行可視化處理并以圖片形式輸出。

1.6 活性成分與支氣管哮喘關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

從PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。借助PyMOL 將靶蛋白與原配體分離，同時(shí)去除靶蛋白的水分子、磷酸根及多余的非活性配體，進(jìn)行分子對(duì)接前的處理。將靶蛋白導(dǎo)入AutoDuck Tools進(jìn)行加氫、電荷等操作。將關(guān)鍵活性成分的2D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Chembio3D 后，以mol2 的格式保存，將靶蛋白、原配體、關(guān)鍵活性成分3D 結(jié)構(gòu)統(tǒng)一設(shè)置成AutoDuck Tools 可識(shí)別的pdbqt 格式。設(shè)置原配體所在部位為活性口袋位點(diǎn)，進(jìn)行關(guān)鍵靶蛋白和關(guān)鍵活性成分的分子對(duì)接，以評(píng)價(jià)活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選

通過(guò)檢索TCMSP、TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合文獻(xiàn)篩得喘可治注射液中淫羊藿、巴戟天的活性成分，其中7 個(gè)活性成分來(lái)自淫羊藿，2 個(gè)活性成分來(lái)自巴戟天，見(jiàn)表1。

表1 喘可治注射液的主要活性成分信息

2.2 喘可治注射液靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及其靶點(diǎn)-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

檢索TCMSP、SwissTargetPrediction、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中巴戟天、淫羊藿的活性成分相關(guān)靶點(diǎn)，整合去重后得到活性成分靶點(diǎn) 112 個(gè)。檢索整合GeneCards、CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中支氣管哮喘相關(guān)靶點(diǎn)，得到2369 個(gè)疾病靶點(diǎn)。將活性成分靶點(diǎn)和支氣管哮喘靶點(diǎn)導(dǎo)入Fun Rich 軟件，去重后得到66 個(gè)治療支氣管哮喘靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。將活性成分及其靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，得到靶點(diǎn)-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。

圖1 活性成分-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 活性成分-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

將66 個(gè)活性成分-疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 平臺(tái)，在Cytoscape 軟件中進(jìn)行可視化處理，PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有66 個(gè)節(jié)點(diǎn)，420 條相互作用連線，平均度值為12，平均介數(shù)為0.016，見(jiàn)圖3。度值和介數(shù)均大于平均值的靶點(diǎn)有18 個(gè)，見(jiàn)表2；度值、介數(shù)均大于平均值的活性成分有5 個(gè)，見(jiàn)表3。由此預(yù)測(cè)喘可治注射液中關(guān)鍵活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定B、淫羊藿A、低聚七糖、蔗果四糖，主要通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、β2 腎上腺素受體（beta2 adrenergic receptor，ADRB2)、5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（SLC6A4）等18 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)達(dá)到治療支氣管哮喘的功效。

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)

表3 活性成分拓?fù)鋮?shù)

圖3 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 KEGG 信號(hào)通路分析

將喘可治注射液66 個(gè)支氣管哮喘靶點(diǎn)富集在KEGG 信號(hào)通路上，根據(jù)P＜0.05 篩選得到支氣管哮喘相關(guān)信號(hào)通路13 條，見(jiàn)表4。富集因子較大的通路包括絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）/cGMP 依賴性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路等。

表4 KEGG 信號(hào)通路

2.5 GO 功能富集分析

以P＜0.05 為原則在DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)66 個(gè)支氣管哮喘靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，得到12 條生物過(guò)程，見(jiàn)表5。預(yù)測(cè)喘可治注射液可能通過(guò)參與這些生物過(guò)程治療支氣管哮喘。

表5 GO 功能富集分析

2.6 分子對(duì)接

分別選取淫羊藿、巴戟天中度值、介數(shù)排名第一的有效成分淫羊藿次苷I 和蔗果四糖，與排名前5位的支氣管哮喘相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果顯示淫羊藿次苷I 與TNF、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）結(jié)合程度高，蔗果四糖與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、α2A 腎上腺素能受體（alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）結(jié)合程度高，見(jiàn)圖4。

圖4 關(guān)鍵活性成分與作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

支氣管哮喘屬中醫(yī)哮證、喘證、痰飲等范疇，中醫(yī)認(rèn)為支氣管哮喘的發(fā)生與宿痰內(nèi)伏于肺有關(guān)[5]。支氣管哮喘對(duì)身體健康和日常生活具有一定危害，急性發(fā)作時(shí)需采取積極治療措施以控制臨床癥狀。中成藥喘可治注射液的主要成分為淫羊藿、巴戟天，能夠有效發(fā)揮止咳平喘、補(bǔ)益腎肺、化痰健脾、固本培元之功效[6]。淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為小檗科植物淫羊藿的干燥地上部分[5,7]。實(shí)驗(yàn)證明淫羊藿可使哮喘大鼠下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)[8]。巴戟天是我國(guó)著名的四大南藥之一，具有抗應(yīng)激、抗炎的功效[9]。

本研究結(jié)果顯示，淫羊藿中活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿A、朝藿定B 和巴戟天中活性成分蔗果四糖、低聚七糖均為治療支氣管哮喘的關(guān)鍵活性成分。其中淫羊藿苷可明顯減輕氣道炎癥反應(yīng)、改善哮喘癥狀[7,10]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)朝藿定B具有祛痰平喘的作用[11]；淫羊藿次苷I、淫羊藿A、蔗果四糖、低聚七糖度值大、類藥性高，能與多個(gè)支氣管哮喘靶點(diǎn)相互作用，提示這4 種活性成分可能是喘可治注射液治療支氣管哮喘的關(guān)鍵活性成分。由PPI 和分子對(duì)接驗(yàn)證得到TNF、PTGS2、VEGFA、STAT3、ADRA2A 為喘可治注射液治療支氣管哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TNF-α 是哮喘氣道中的前炎癥細(xì)胞因子，也是哮喘炎癥過(guò)程中的重要啟動(dòng)因子[12]。TNF-α可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子、黏附分子和黏液素的表達(dá)和釋放，增強(qiáng)局部血管通透性，促進(jìn)支氣管炎癥介質(zhì)釋放和炎癥介質(zhì)之間相互作用，其水平越高，表明病情越嚴(yán)重[13-14]。PTGS 又稱環(huán)加氧酶，誘導(dǎo)型PTGS2 參與花生四烯酸代謝，能誘發(fā)哮喘急性發(fā)作[15]。馬素麗等[16]研究稱STAT3 參與兒童支氣管哮喘的發(fā)生和進(jìn)展，對(duì)哮喘的氣道炎癥具有一定的調(diào)節(jié)作用。Guan 等[17]發(fā)現(xiàn)VEGFA 不論在輕中度哮喘組與正常組還是重度哮喘組與正常組均是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的樞紐蛋白，提示VEGFA 可能與哮喘的發(fā)病有重要關(guān)系。

本研究通過(guò)分析得到13 條與支氣管哮喘有關(guān)的KEGG 通路和12 條GO 生物過(guò)程。其中PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞中，Durham 等[18]認(rèn)為PI3K可能通過(guò)刺激Akt 活化而進(jìn)一步促進(jìn)關(guān)鍵基因TNF表達(dá)，從而參與到哮喘的炎癥反應(yīng)中。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，哮喘發(fā)生時(shí)缺氧誘導(dǎo)因子1、VEGF 表達(dá)水平均明顯升高，從而使嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子聚集參與氣道炎癥、氣道重塑等過(guò)程，促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展[19]。MAPK 信號(hào)通路是參與支氣管哮喘發(fā)病及進(jìn)展的一條重要通路，通過(guò)調(diào)控免疫/炎癥細(xì)胞和氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞，引起氣道高反應(yīng)和氣道重塑，最終誘發(fā)支氣管哮喘[20]。本研究發(fā)現(xiàn)ErbB、T 細(xì)胞受體等信號(hào)通路也可能與支氣管哮喘發(fā)生機(jī)制有關(guān)，但尚需進(jìn)一步論證。以上通路可能參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）1 和ERK2 級(jí)聯(lián)的正調(diào)控、T 細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等多個(gè)生物過(guò)程從而協(xié)同發(fā)揮作用。ERK包括兩種異構(gòu)體ERK1 和ERK2，楊季國(guó)等[21]發(fā)現(xiàn)ERK1/2 在支氣管哮喘氣道重塑中起重要作用。一氧化氮是由體內(nèi)半必需氨基酸左旋-精氨酸在一氧化氮合成酶作用下合成的，一氧化氮在哮喘發(fā)病中具有雙刃劍作用：小劑量的一氧化氮可舒張支氣管平滑肌，而高水平的一氧化氮?jiǎng)t表現(xiàn)為炎癥及細(xì)胞毒性[22]。核因子κB 通過(guò)參與氣道重塑及炎癥反應(yīng)，在支氣管哮喘發(fā)病過(guò)程中起一定作用[23]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法說(shuō)明喘可治注射液能從抗炎、抗凋亡、調(diào)節(jié)增殖等方面治療支氣管哮喘。

綜上所述，喘可治注射液中的關(guān)鍵活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿A、朝藿定B、蔗果四糖、低聚七糖可作用于TNF、PTGS2、VEGFA、STAT3、ADRA2A 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)MAPK 等通路和參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等生物過(guò)程，起到治療支氣管哮喘的作用，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)論證提供了思路、奠定了基礎(chǔ)。