灘涂圍墾區(qū)農(nóng)田土壤中無機(jī)磷解磷菌的分離鑒定及解磷特性

龍錫恩，張 欣，萬少昱，周彤彤，張 蛟

（1.南通大學(xué) 地理科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通 226007；2.江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 如皋 226541）

沿海灘涂作為我國重要的后備土地資源具有巨大的開發(fā)潛力，不僅能夠緩解人多地少的矛盾，還可為社會經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展拓展空間[1]。目前，農(nóng)業(yè)利用是灘涂圍墾的主要方式。圍墾前后水文條件的改變和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中人為因素的影響，土壤理化性質(zhì)發(fā)生顯著變化[2-3]，但灘涂土壤仍存在含鹽量高、養(yǎng)分貧瘠、土壤滲透性差等特征，如何提高土壤養(yǎng)分利用率是一個亟待解決的問題[4]。

磷在農(nóng)業(yè)中具有重要作用，其中最主要的表現(xiàn)為土壤有效磷供給是影響作物產(chǎn)量的限制性因子[5-6]。適當(dāng)施用磷肥能夠確保作物代謝正常進(jìn)行，促進(jìn)植株生長發(fā)育，并提高其抗寒性和抗旱性。但磷肥施入土壤后很容易與鈣、鐵、鋁離子等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成難溶態(tài)磷而被土壤固定，從而降低其利用效率，因此，農(nóng)民往往會施入大量的磷肥以維持作物產(chǎn)量，而磷肥的利用率通常只有10%～25%[7]。磷肥長期大量投入，不僅帶來磷肥資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，還是我國大面積農(nóng)業(yè)面源污染的主要誘因。因此，如何提高磷肥的利用效率是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展所亟待解決的重要問題之一。土壤微生物有助于作物更好地利用土壤中的磷。溶磷微生物（phosphatesolubilizing microorganisms，PSMs）在土壤中普遍存在，占細(xì)菌的1%～50%和真菌的0.1%～0.5%[8]。其主要機(jī)理是通過微生物群落產(chǎn)生有機(jī)酸（葡萄糖酸、草酸和檸檬酸）和無機(jī)質(zhì)子增加無機(jī)磷的溶解度，無機(jī)質(zhì)子通過降低根際pH、螯合陽離子（Al、Fe、Ca）和競爭吸附位點(diǎn)向土壤釋放磷酸鹽；而對于土壤有機(jī)磷，除了礦化作用外，不溶性有機(jī)磷還可以被細(xì)胞壁結(jié)合酶或游離酶所激活，如磷酸酶、磷蛋白磷酸酶、植酸酶和核苷酸酶[9]。

施用解磷菌有助于溶解土壤中的難溶性磷，以此提升有效磷的含量，從而促進(jìn)植物的生長[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，增加土壤中的解磷微生物，可以促進(jìn)土壤中的難溶磷轉(zhuǎn)化成生物有效磷，提高磷肥的利用率，改善磷肥過量施用與難溶磷在土壤中長期累積的惡性循環(huán)[13]。但解磷菌的解磷能力受到營養(yǎng)源、溫度、酸堿度等環(huán)境因素的顯著影響[14-15]。因此，探明不同營養(yǎng)、環(huán)境條件對其解磷能力的影響，是對解磷菌進(jìn)一步深入研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)。本文通過對篩選出的5 株解磷菌在不同環(huán)境中的解磷能力的研究，探明解磷菌的最適生長條件，以期為灘涂圍墾土壤專用生物菌肥開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

土壤樣品采集自寧波市北侖區(qū)春曉鎮(zhèn)（120°10'E，29°68'N）和南通市如東縣（120°42'E，32°12'N）的灘涂圍墾區(qū)農(nóng)田土壤。土樣帶回實驗室后，去除根系、石塊等雜物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g，葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，Ca3（PO4）210 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5，固體培養(yǎng)基需加18～20 g 的瓊脂。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基需加15 g 的瓊脂。

保存培養(yǎng)基（無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基）：瓊脂15 g，M9 鹽溶液100 mL，微量元素營養(yǎng)液10 mL，蒸餾水1 000 mL。

M9 儲備液（10X）：Na2HPO4·2H2O 75.2 g/L，KH2PO430 g/L，NaCl 5 g/L，NH4Cl 5 g/L，pH 7.2，蒸餾水1 000 mL，20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）葡萄糖20 mL，1 mol/L MgSO41 mL，biotin 1 mL，1 mol/L CaCl20.3 mL。

微量元素儲備液（100X）：EDTA 5 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.83 g/L，ZnCl284 mg/L，CuCl2·2H2O 13 mg/L，CoCl2·2H2O 10 mg/L，H3BO310 mg/L，MnCl2·4H2O 1.6 mg/L，pH 7.5，蒸餾水1 000 mL。

所有培養(yǎng)基均置于滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min后進(jìn)行實驗。

1.2 解磷菌的分離與篩選

運(yùn)用涂布平板法：稱取5 g 土壤樣品置于裝有100 mL 無菌水的錐形瓶中，在25 ℃、180 r/min 條件下充分振蕩1 h后，采用梯度稀釋法進(jìn)行稀釋，分別取0.1～0.001 的稀釋液10 μL，涂布接種于無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，倒置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)7 d。用滅菌牙簽挑取生長速度快、形態(tài)特殊和能產(chǎn)生透明圈的單菌落，用游標(biāo)卡尺測量透明圈直徑（D）和菌落生長直徑（d），并計算解磷比（透明圈直徑和菌落生長直徑的比值，即D/d）。

1.3 解磷菌株的鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)

將篩選出的5 株解磷菌劃線接種于LB 平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)特征。

1.3.2 菌株16S rRNA 基因序列分析

將保存的5 株菌株接種到LB 培養(yǎng)液中，在25 ℃、180 r/min 條件下恒溫振蕩過夜培養(yǎng)。采用菌液PCR法直接對篩選菌株進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增正向引物為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3'），反向引物為1492R（5'-TACGGTTACCTTGT TACGACTT-3'）。PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板0.1 μL（菌液），10×PCR Buffer 2 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.2 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL，引物27F（10 μmol/L）0.5 μL，引物1492R（10 μmol/L）0.5 μL，GoTaq DNA Polymerase（5 U/μL）0.4 μL，ddH2O 14.9 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃90 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后采用SpanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列拼接，將獲得的16S rRNA 基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫作BLAST 比對分析。

1.4 不同碳源對菌株解磷能力的影響

將-80 ℃保存的5 株菌株活化兩次后，接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，菌液濃度控制在108～109cfu/mL 之間。保持無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基其他成分不變，分別設(shè)葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉為唯一碳源，均以4 g/L 碳量加入培養(yǎng)基中。每種碳源處理均設(shè)立3 組重復(fù)，以不接菌處理作為空白對照。在25 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)37 h后，測定菌株上清液pH 和水溶性磷的含量。

1.5 不同氮源對菌株解磷能力的影響

保持無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基其他成分不變，分別設(shè)尿素、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸銨為唯一氮源，均以0.1 g/L 氮量加入培養(yǎng)基中。每種氮源處理均設(shè)立3 組重復(fù)，以不接菌處理作為空白對照。在25 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)37 h后，測定菌株上清液pH和水溶性磷的含量。

1.6 不同碳氮摩爾比對菌株解磷能力的影響

利用葡萄糖和硫酸銨分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基碳氮摩爾比（C/N）至50∶1、25∶1、12∶1，保持無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基其他成分不變。每種C/N 處理均設(shè)立3 組重復(fù)，以不接菌處理作為空白對照。在25 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)37 h后，測定菌株上清液pH 和水溶性磷的含量。

1.7 不同pH 對菌株解磷能力的影響

利用1 mmol/L HCl 或NaOH 溶液分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 至4.0、6.0、7.0 和13.0，保持無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基其他成分不變。每種pH 處理均設(shè)立3 組重復(fù)，以不接菌處理作為空白對照。在25 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)37 h后，測定菌液pH 和水溶性磷的含量。

1.8 不同溫度對菌株解磷能力的影響

以無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)為4、25、37 ℃。每種溫度處理均設(shè)立3 組重復(fù)，以不接菌處理作為空白對照。在180 r/min條件下培養(yǎng)37 h后，測定菌液pH 和水溶性磷的含量。

1.9 不同處理下水溶性磷含量和菌液上清液pH的測定

水溶性磷含量的測定（采用鉬銻抗比色法）：各取1.8 mL 菌液于100 mL LB 培養(yǎng)基中，在25 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)37 h。搖勻后，各取1.5 mL 于離心管中，1 500 r/min 離心5 min；酶標(biāo)板中分取20 μL解磷菌上清液、40 μL 鉬銻抗顯色劑和240 μL 蒸餾水，顯色15 min，送入酶標(biāo)儀（M nano，tecan）中，于24.5～25.5 ℃、600 nm 波長處測定。

菌液pH 的測定：各取5 mL 菌液于50 mL 離心管中，加入12.5 mL 蒸餾水，震蕩5 min后，8 000 r/min離心3 min，采用pH 計（F2-Standard，梅特勒-托利多）測定上清液pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的分離純化

采用涂布平板法和梯度稀釋法從土樣中分離篩選出的5 株解磷菌的菌落特征如表1 所示，整體呈現(xiàn)扁平、不透明的特征，多數(shù)呈圓形；表面主要為干黏和光滑黏狀；Ps.chlororaphis和Brv.nasdae可觀察到明顯的溶磷圈，而Mib.flavescens和Ps.jessenii菌株生長菌圈最大，直徑分別為69.7 和11.85 mm。菌株在無機(jī)磷培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖1 所示。

表1 解磷菌培養(yǎng)7 d 的菌落特征Tab.1 Colony characteristics of phosphate-soluble bacteria cultured for 7 days

圖1 5 株解磷菌株在無機(jī)磷培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig. 1 Morphology of 5 phospholytic strains on inorganic phosphorus medium

2.2 解磷菌的基因鑒定

經(jīng)16S rRNA 基因序列鑒定，所分離菌株及其基因序列號分別為：Mib flavescens（MZ636717）、Ps.chlororaphis（MZ636758）、Ps.jessenii（MZ636760）、M.varians（MZ636806）和Brv.nasdae（MZ636807）。

2.3 不同培養(yǎng)條件下分離菌株的解磷能力

2.3.1 不同碳源下分離菌株的解磷能力

由圖2 可知，不同碳源對菌株的解磷能力有顯著影響。當(dāng)葡萄糖為唯一碳源時，Mib.flavescens的解磷能力最強(qiáng)，解磷量達(dá)9.20 mg/L；當(dāng)蔗糖為唯一碳源時，Brv.nasdae的解磷能力最強(qiáng)，解磷量達(dá)0.70 mg/L；當(dāng)乳糖為唯一碳源時，Ps.chlororaphis的解磷能力最強(qiáng)，解磷量達(dá)0.96 mg/L；當(dāng)可溶性淀粉為唯一碳源時，M.varians的解磷能力最強(qiáng)，解磷量達(dá)0.68 mg/L。此外，Mib.flavescens、Ps.chlororaphis、Ps.jessenii和M.varians在以葡萄糖為碳源時，解磷效果顯著，解磷量保持在1.11～9.20 mg/L 之間。結(jié)果表明：葡萄糖更有利于菌株發(fā)揮最佳解磷效力。

圖2 碳源對5 株解磷菌解磷能力的影響Fig. 2 Effects of carbon source on phosphorus digesting ability of 5 strains of phosphorus digesting bacteria

此外，由圖3 可知，培養(yǎng)液最終pH 與菌株解磷能力呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。當(dāng)葡萄糖為唯一碳源時，培養(yǎng)液最終pH 降幅最大，為20.68%；而當(dāng)碳源為其他變量時，培養(yǎng)液最終pH 幾乎沒有變化。

圖3 不同碳源處理下5 株解磷菌上清液pH 的變化情況Fig. 3 The pH changes of supernatant of 5 strains of phosphorus hydrolyzing bacteria treated with different carbon sources

2.3.2 不同氮源下分離菌株的解磷能力

由圖4 可知，培養(yǎng)基中供給不同形態(tài)的氮素能影響菌株的解磷能力。當(dāng)銨態(tài)氮（硫酸銨）為唯一氮源時，Ps.chlororaphis的解磷能力最強(qiáng)，Ps.jessenii的解磷能力次之，解磷量分別為20.54、11.59 mg/L；當(dāng)硝態(tài)氮（硝酸鉀）為唯一氮源時，Ps.jessenii的解磷能力最強(qiáng)，Ps.chlororaphis的解磷能力次之，解磷量分別為17.16、16.95 mg/L；當(dāng)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮（硝酸銨）同時存在時，Ps.jessenii的解磷能力最強(qiáng)，Ps.chlororaphis的解磷能力次之，解磷量分別為12.27、8.14 mg/L；然而，當(dāng)酰胺態(tài)氮（尿素）為唯一氮源時，Ps.chlororaphis的解磷能力最強(qiáng)，Ps.jessenii的解磷能力次之，解磷量分別為2.73、1.92 mg/L，與其他處理相比差異顯著。結(jié)果表明：Ps.chlororaphis、Ps.jessenii在硝態(tài)氮、銨態(tài)氮或是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮都存在時，均能發(fā)揮最佳解磷效力。

圖4 氮源對5 株解磷菌解磷能力的影響Fig. 4 Effects of nitrogen source on phosphorus digesting ability of 5 strains of phosphorus digesting bacteria

此外，由圖5 可知，Ps.chlororaphis、Ps.jessenii在不同氮源中均能發(fā)揮較好的解磷效力，但其培養(yǎng)液的最終pH 差異不甚明顯。當(dāng)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮同時存在時，培養(yǎng)液的最終pH 降幅最大，為14.50%；而當(dāng)銨態(tài)氮為唯一氮源時，培養(yǎng)液的最終pH 降幅最小，為5.54%。這也說明解磷能力的大小主要是由菌株的特性所決定的。

圖5 不同氮源處理下5 株解磷菌上清液pH 的變化情況Fig. 5 The pH changes of supernatant of 5 strains of phosphorus hydrolyzing bacteria treated with different nitrogen sources

2.3.3 不同碳氮摩爾比下分離菌株的解磷能力

一般認(rèn)為，C/N 在25∶1 左右最適合微生物的生長代謝，為此，本實驗設(shè)置了3 個C/N 條件，即50∶1、25∶1 和12∶1，結(jié)果如圖6 所示。當(dāng)C/N=50∶1、25∶1時，Ps.chlororaphis的解磷能力最強(qiáng)，解磷量分別為11.95、68.57 mg/L；當(dāng)C/N=12∶1時，Brv.nasdae的解磷能力最強(qiáng)，解磷量達(dá)68.39 mg/L。相較而言，Ps.chlororaphis在C/N=25∶1 時解磷效果顯著，解磷量 達(dá)68.57 mg/L；Mib.flavescens、Ps.jessenii和Brv.nasdae在C/N=12∶1 時解磷效果顯著，解磷量保持 在40.27～68.39 mg/L 之間。其中，Ps.chlororaphis在不同碳氮比環(huán)境中解磷效果顯著，解磷量保持在11.95～68.57 mg/L 之間。結(jié)果表明：菌株在C/N=25∶1、C/N=12∶1 的環(huán)境更有利于發(fā)揮最佳解磷效力；而Ps.chlororaphis對不同碳氮比環(huán)境的適應(yīng)性最強(qiáng)。

圖6 C/N 對5 株解磷菌解磷能力的影響Fig. 6 Effect of C/N on phosphorus degrading ability of 5 strains of phosphorus degrading bacteria

此外，由圖7 可知，培養(yǎng)液的最終pH 隨著C/N 的增大呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)C/N=12∶1 時降幅最大，為20.9%；而當(dāng)C/N=25∶1 時降幅最小，為13.57%。

圖7 不同C/N 處理下5 株解磷菌上清液pH 的變化情況Fig. 7 The pH changes of supernatant of 5 strains of phosphorus hydrolyzing bacteria under different C/N treatments

2.3.4 不同pH 下分離菌株的解磷能力

由圖8 可知，不同的初始pH 對菌株的解磷能力有顯著影響?？傮w來說，隨著pH 的增加，5 株解磷菌的解磷能力呈先增加后下降的趨勢。當(dāng)pH=4時，Mib.flavescens的解磷能力最強(qiáng)，解磷量達(dá)4.46 mg/L；當(dāng)pH=6、pH=7時，Brv.nasdae的解磷能力最強(qiáng)，解磷量分別為54.57、85.51 mg/L；當(dāng)pH=13時，Ps.chlororaphis的解磷能力最強(qiáng)，解磷量達(dá)1.60 mg/L。相較而言，Ps.chlororaphis、Ps.jessenii在弱酸性環(huán)境中解磷效果顯著，解磷量保持在34.81～36.89 mg/L之間；Mib.flavescens、Brv.nasdae在中性環(huán)境中解磷效果顯著，解磷量保持在80.27～85.51 mg/L 之間。而在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境中，菌株最優(yōu)解磷量僅為4.46 mg/L。結(jié)果表明：弱酸性和中性環(huán)境更有利于菌株發(fā)揮最佳解磷效力。

圖8 不同pH 對5 株解磷菌解磷能力的影響Fig. 8 Effects of different pH values on phosphorus hydrolysis ability of 5 strains of phosphorus hydrolysis bacteria

此外，由圖9 可知，培養(yǎng)液最終pH 與菌株解磷能力呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。當(dāng)pH=4、pH=13時，培養(yǎng)液最終pH 幾乎沒有變化；而當(dāng)pH=6、pH=7時，培養(yǎng)液最終pH 降幅明顯，分別為18.73%、22.46%。的環(huán)境中解磷效果顯著，解磷量保持在65.63～81.94 mg/L 之間。其中，Mib.flavescens僅在t=25 ℃時解磷效果顯著，解磷量達(dá)74.65 mg/L；Ps.jessenii在不同溫度環(huán)境中解磷效果顯著，解磷量保持在13.59～81.94 mg/L 之間。結(jié)果表明：菌株在25～37 ℃的環(huán)境中更有利于發(fā)揮最佳解磷效力；而Ps.jessenii對大幅度的溫度變化環(huán)境的適應(yīng)性最強(qiáng)。

圖9 不同pH 處理下5 株解磷菌上清液pH 的變化情況Fig. 9 The pH changes of supernatant of 5 strains of phosphorus hydrolyzing bacteria treated with different pH values

此外，由圖11 可知，不同溫度下培養(yǎng)液的最終pH 差異明顯。當(dāng)t=25 ℃時，培養(yǎng)液最終pH 降幅最大，為33.72%；而當(dāng)t=4 ℃時，培養(yǎng)液最終pH降幅最小，為10.82%。

圖10 溫度對5 株解磷菌解磷能力的影響Fig. 10 Effect of temperature on phosphorus degrading ability of 5 strains of phosphorus degrading bacteria

圖11 不同溫度處理下5 株解磷菌上清液pH 的變化情況Fig. 11 The pH changes of supernatant of 5 strains of phosphorus hydrolyzing bacteria treated at different temperatures

2.3.5 不同溫度下分離菌株的解磷能力

由圖10 可知，不同溫度對解磷菌的解磷能力有顯著影響。當(dāng)t=4 ℃、t=37 ℃時，Ps.jessenii的解磷能力最強(qiáng)，解磷量分別為13.59、81.94 mg/L；當(dāng)t=25 ℃時，Mib.flavescens的解磷能力最強(qiáng)，解磷量達(dá)74.65 mg/L。相較而言，5 株菌株主要在25～37 ℃

3 討論

當(dāng)前，國內(nèi)外許多關(guān)于植物根際解磷菌的報道中指出，植物根際解磷菌的種類主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單孢菌屬（Pseudolnonas）、沙雷氏菌屬（Serratia）、固氮菌屬（Azoto-baeter）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella）、泛菌屬（Pantoea）等[16-17]。本研究從浙江春曉和南通如東圍墾區(qū)土壤中分離出5 株解磷菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定分別為微桿菌屬（Microbacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、馬賽菌屬（Massilia）和短波單胞菌屬（Brevundimonas）。微桿菌屬、馬賽菌屬和短波單胞菌屬的發(fā)現(xiàn)豐富了解磷菌種的種類，為解磷微生物的研究提供了新的空間。

研究結(jié)果表明，在營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素的影響下，解磷菌的代謝途徑和生長繁殖方式發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致其解磷功效發(fā)生改變[18]。碳水化合物作為所有異養(yǎng)微生物的能源物質(zhì)，不同碳水化合物對微生物生長繁殖和生理代謝活動的影響存在顯著差異[19]。Farhat 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，碳源的種類不同導(dǎo)致解磷菌有機(jī)酸代謝發(fā)生變化，產(chǎn)生不同種類的有機(jī)酸，從而直接影響到解磷菌的解磷特性，其中葡萄糖的效果最好。衛(wèi)星等[21]對巨大芽孢桿菌NCT-2 的研究也發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖為碳源的溶磷效果要優(yōu)于麥芽糖、蔗糖和淀粉。本實驗所獲得的結(jié)論與上述結(jié)論相似，即葡萄糖是最有利于菌株發(fā)揮最佳解磷效力的碳源。其中，Mib.flavescens的解磷能力最強(qiáng)，解磷量最高可達(dá)9.20 mg/L。此外，當(dāng)葡萄糖為唯一碳源時，培養(yǎng)液pH 降幅最大。研究認(rèn)為，解磷微生物主要通過分泌有機(jī)酸來溶解不溶性礦質(zhì)磷酸鹽[22]，而這些有機(jī)酸主要來自于葡萄糖直接氧化代謝途徑[23-24]。

除了碳源，氮源也是影響微生物生理活動最重要的因素，然而，不同形態(tài)的氮素對溶磷菌的影響差異顯著。有學(xué)者認(rèn)為，銨態(tài)氮是解磷微生物的必需氮源，銨態(tài)氮作為氮源時，解磷菌對難溶性磷酸鹽的溶解量高于硝態(tài)氮[25-26]。也有學(xué)者認(rèn)為，溶磷菌以硝態(tài)氮為氮源時溶磷量最大[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ps.chlororaphis、Ps.jessenii在硝態(tài)氮、銨態(tài)氮或是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮都存在時，均表現(xiàn)出較好的解磷能力。但其培養(yǎng)液pH 受氮源的影響小，說明在不同形態(tài)氮源下，礦物態(tài)磷酸鹽的溶出機(jī)制在不同碳源條件下存在差異，還有待進(jìn)一步研究[28]。

微生物的解磷能力不僅受碳源和氮源種類的影響，而且還受C/N 的影響[29]。研究發(fā)現(xiàn)：有些菌株在高C/N 時表現(xiàn)出比較高的溶磷活性，如曲霉2TCiF2 和4TCiF6、節(jié)桿菌1TCRi14 和歐文氏菌4TCRi22；有些則在低C/N 時具有比較高的溶磷能力，如青霉1TCRiF5 和2TCRiF4[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株在C/N=25∶1、C/N=12∶1 的環(huán)境中更有利于發(fā)揮最佳解磷效力。此外，培養(yǎng)液的最終pH 隨著C/N 的增大而呈先升高后降低的趨勢，這可能是由于不同的C/N 導(dǎo)致菌株分泌的有機(jī)酸的種類和數(shù)量產(chǎn)生了變化[28]。

除此之外，外部因素亦是能夠影響解磷菌解磷能力的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌劑解磷作用的發(fā)揮也受到pH、溫度等因素的影響顯著[30]。

微生物對于磷酸鈣的溶解作用，主要取決于微生物分泌的有機(jī)酸的數(shù)量和種類。對于供試的5 株菌株而言，盡管氮源、碳源和C/N 的改變影響它們的代謝，但溶磷機(jī)理基本上沒有改變，所以培養(yǎng)基的初始pH 與其溶磷量之間存在顯著的相關(guān)性[28]。而且，不同解磷菌株溶解難溶性磷酸鹽時所需的最適初始pH 有所不同，pH 過高或者過低都影響解磷能力[31]。肖春橋等[32]研究發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境（初始pH=6）更有利于草酸青霉菌AP2 溶解磷酸鹽。趙小蓉等[28]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始pH 在7～8 之間時，PSF1 生長情況最好，同時解磷能力最高。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始pH在6～7 之間時，有利于Ps.chlororaphis、Ps.jessenii、Mib.flavescens和Brv.nasdae發(fā)揮良好的解磷效力。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度較低時，解磷菌活性較低，隨溫度上升，解磷菌活性提高，解磷量增加，但當(dāng)溫度超過一定數(shù)值（50 ℃左右）時，解磷菌活性受到抑制，解磷效果降低，解磷量下降[30]。研究還發(fā)現(xiàn)，25～37 ℃的環(huán)境更有利于菌株發(fā)揮最佳解磷效力。

4 結(jié)論

本研究篩選出5 株解磷菌，經(jīng)16S rRNA 測序并在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對，鑒定為：Mib.flavescens、Ps.chlororaphis、Ps.jessenii、M.varians和Brv.nasdae。

這5 株菌株在不同環(huán)境下所發(fā)揮的解磷效能各不相同。M.varians在以葡萄糖為碳源、硝酸銨為氮源、C/N=50∶1、pH=6、t=25 ℃時，解磷能力最佳，解磷量最高可達(dá)68.59 mg/L；Brv.nasdae在以蔗糖為碳源、硝酸銨為氮源、C/N=12∶1、pH=7、t=25 ℃時，解磷能力最佳，解磷量最高可達(dá)85.51 mg/L；Mib.flavescens在以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源、C/N=12∶1、pH=7、t=25 ℃時，解磷能力最佳，解磷量最高可達(dá)80.27 mg/L；Ps.chlororaphis在以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源、C/N=25∶1、pH=6、t=37 ℃時，解磷能力最佳，解磷量最高可達(dá)68.57 mg/L；Ps.jessenii在以葡萄糖為碳源、硝酸鉀為氮源、C/N=12∶1、pH=6、t=37 ℃時，解磷能力最佳，解磷量最高可達(dá)81.94 mg/L。其中，Mib.flavescens、Brv.nasdae在中性條件下解磷能力遠(yuǎn)優(yōu)于其他菌株，解磷量保持在80.27～85.51 mg/L 之間；Ps.jessenii能夠適應(yīng)大幅度的溫度變化環(huán)境，并保持良好的解磷效力，解磷量保持在13.59～81.94 mg/L 之間。本次實驗發(fā)現(xiàn)的這3 株菌株，具有良好的微生物肥料開發(fā)應(yīng)用潛力，為日后其菌肥開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。