肖 雄 糜自豪 劉亭亭 王 藝 張 園 王 川 孫樂樂 時(shí)培殿 劉 紅 張福仁

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院),山東省皮膚病性病防治研究所,濟(jì)南,250022

海分枝桿菌是引起人類機(jī)會(huì)性感染的最常見的非結(jié)核分枝桿菌之一。海分枝桿菌感染可引起皮膚潰瘍和肉芽腫性病變,感染嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致腱鞘炎、關(guān)節(jié)炎和骨髓炎等,其病理改變主要是巨噬細(xì)胞及其衍生細(xì)胞異常增生并在感染部位聚集[1]。此外,海分枝桿菌感染患者的藥物治療時(shí)間3周～2年不等,平均治療時(shí)間140天,這嚴(yán)重影響了患者的身心健康[2]。

免疫代謝指免疫細(xì)胞的代謝情況決定著自身的命運(yùn),代謝重編程與免疫細(xì)胞功能密切相關(guān)[3]。免疫細(xì)胞的代謝方式主要有糖代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝。其中,糖酵解代謝是指葡萄糖經(jīng)相關(guān)酶(HK2、LDHA等)催化分解為乳酸同時(shí)產(chǎn)生少量ATP的過程。免疫細(xì)胞糖酵解代謝與癌癥、肥胖、糖尿病等代謝綜合征密切相關(guān)[3-5]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)糖酵解與感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),其中分枝桿菌中以結(jié)核分枝桿菌感染重編程巨噬細(xì)胞糖酵解的研究為最多。研究表明感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體(GLUT-1)基因SLC2A1的表達(dá)增加了葡萄糖的攝取,同時(shí)也增加糖酵解關(guān)鍵基因HK2(編碼關(guān)鍵酶HK2:催化糖酵解第一步葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸)和LDHA(編碼關(guān)鍵酶LDHA:催化糖酵解最后一步丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸)的表達(dá)[6-8]。與此同時(shí),上調(diào)的糖酵解對(duì)巨噬細(xì)胞抵御結(jié)核分枝桿菌感染至關(guān)重要[9]。但是,國(guó)內(nèi)外罕有報(bào)道海分枝桿菌感染對(duì)其最主要宿主細(xì)胞巨噬細(xì)胞糖酵解調(diào)控的系統(tǒng)研究。

因此本研究利用海分枝桿菌感染小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophage,BMDM),通過對(duì)糖酵解代謝相關(guān)基因的表達(dá)和糖酵解最終產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生進(jìn)行檢測(cè),系統(tǒng)地研究了海分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞糖酵解代謝的調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 倫理聲明 本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并獲得參與者的知情同意。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) C57BL/6野生型小鼠(中國(guó),集萃藥康)BMDM的分離:脫臼處死小鼠,75%酒精浸泡10 min。生物安全柜中分離出小鼠股骨和脛骨,剔除骨頭兩端,無菌胰島素注射器吸取2 mL的DMEM培養(yǎng)基沖洗股骨和脛骨兩端各三次。收集沖洗后的培養(yǎng)基(美國(guó),ATCC),70 μm細(xì)胞篩過濾。取過濾后的培養(yǎng)基,500 rpm離心5 min,棄上清,加入5 mL的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó),ATCC)重懸。用默克ScepterTM3.0細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞濃度。

BMDM培養(yǎng):將BMDM以5×105個(gè)/mL均勻鋪入24孔板中,加入終濃度20 ng/mL的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)(美國(guó),R&D)誘導(dǎo)分化6天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(37℃,5% CO2)。培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(美國(guó),ATCC),添加1%青霉素-鏈霉素(Penicillin-Streptomycin)(美國(guó),Gibco)和10%胎牛血清(FBS)(美國(guó),Gibco)。

1.3 分枝桿菌的培養(yǎng)和感染 分枝桿菌培養(yǎng):海分枝桿菌為荷蘭萊頓大學(xué)Annemarie H. Meijer教授惠贈(zèng)的表達(dá)紅色熒光蛋白mCherry的海分枝桿菌菌株Mycobacteriummarinum(Mma20)。減毒牛型分枝桿菌(BCG)為濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院的劉昂副教授贈(zèng)送。Mma20和BCG培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)瓶置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中(上海,知楚),溫度為32℃,振蕩速度為100 rpm。培養(yǎng)基為分枝桿菌即用型液體完全培養(yǎng)基(上海,晶諾)。海分枝桿菌表達(dá)紅色熒光蛋白,在海分枝桿菌培養(yǎng)瓶中加入終濃度為50 μg/mL的潮霉素B(北京,索萊寶)維持其自發(fā)熒光。超聲細(xì)菌分散計(jì)數(shù)儀(寧波,新芝)測(cè)量分枝桿菌濃度。

分枝桿菌感染:分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞3 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液13000 rpm離心10 min,用無菌PBS(中國(guó),逍鵬)洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板2次去除細(xì)胞培養(yǎng)板中殘留的細(xì)菌。小心吸取離心后的培養(yǎng)基,并將無細(xì)菌的培養(yǎng)基上清加回原培養(yǎng)孔中。對(duì)于熱滅活分枝桿菌,在恒溫水浴鍋中99℃,30 min熱滅活Mma20(HK-Mma20)后感染巨噬細(xì)胞。

1.4 乳酸測(cè)量 感染指定時(shí)間后的上清液通過10 kd截留分子量過濾管(美國(guó),millipore)過濾,以13000 rpm離心10 min去除上清液中的乳酸脫氫酶。按照廠家說明書使用乳酸比色法測(cè)定試劑盒(MAK064)(美國(guó),Sigma-Aldrich)測(cè)定上清液中的乳酸濃度。

1.5 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)分析 使用Eastep? Super總RNA提取試劑盒從感染的巨噬細(xì)胞中提取總RNA(美國(guó),Promega)。使用GoScriptTMReverse Transcription Mix,Random Primers 試劑盒(美國(guó),Promega)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用SYBR Green PCR試劑盒(中國(guó),CWBIO),并用stepone plus熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó),Applied Biosystems)分析。

1.6 2-脫氧葡萄糖(2-DG)抑制糖酵解的實(shí)驗(yàn) 共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光:在10 mM 2-DG(中國(guó),MCE)存在的條件下,Mma20感染巨噬細(xì)胞48 h。用蔡司LSM980共聚焦顯微鏡對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)Mma20的熒光進(jìn)行觀察。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度:在10 mM 2-DG存在的條件下,Mma20感染巨噬細(xì)胞48 h,棄上清,無菌PBS清洗2遍。加入0.25%胰酶(預(yù)熱37℃)吹打混勻,顯微鏡下觀察到貼壁的巨噬細(xì)胞懸浮后立即加入等體積FBS終止反應(yīng),收集細(xì)胞懸液以500 rpm,離心5 min,棄上清,加入100 μL PBS重懸。在BD流式細(xì)胞儀(FACSAriaTMFusion)上使用PE通道檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)海分枝桿菌的熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究中的所有數(shù)據(jù)均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,并使用Graphpad Prism V.8.0.1軟件進(jìn)行分析。采用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)和非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)。在所有實(shí)驗(yàn)中,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海分枝桿菌感染導(dǎo)致巨噬細(xì)胞糖酵解代謝顯著上調(diào) 為了解海分枝桿菌感染對(duì)巨噬細(xì)胞糖酵解的影響,我們研究了海分枝桿菌(Mma20)感染BMDM 24 h后葡萄糖的攝取情況。2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)是一種葡萄糖類似物,能競(jìng)爭(zhēng)性被巨噬細(xì)胞攝取,在巨噬細(xì)胞中呈現(xiàn)綠色熒光。共聚焦顯微鏡分析顯示感染后的巨噬細(xì)胞中2-NBDG的綠色熒光與巨噬細(xì)胞吞噬的海分枝桿菌的紅色熒光重合,表明巨噬細(xì)胞吞噬海分枝桿菌的同時(shí)對(duì)葡萄糖的攝取增加(圖1a～1d)。我們又檢測(cè)了脂多糖(LPS)、海分枝桿菌(Mma20)和減毒牛型分枝桿菌(BCG)分別感染BMDM后葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體(GLUT-1)基因SLC2A1和糖酵解相關(guān)酶編碼基因(HK2、LDHA)的表達(dá)。RT-qPCR分析表明,感染24 h后,感染組中SLC2A1、HK2和LDHA的表達(dá)量均顯著高于未感染組(圖1e～1g)。與此同時(shí),感染后的巨噬細(xì)胞上清液中乳酸濃度在24 h后也顯著高于對(duì)照組(圖1h)。以上這些結(jié)果表明,海分枝桿菌感染能促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)胞外葡萄糖的攝取,并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞糖酵解重編程。

1a～1d: Mma20感染BMDM(MOI = 10,24 h),共聚焦顯微鏡觀察2-NBDG和Mma20的熒光檢測(cè)葡萄糖的攝取;1e～1g: LPS(100 ng/mL)、Mma20或BCG分別感染BMDM(MOI=10,感染時(shí)間24 h),RT-qPCR檢測(cè)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)水平;1h: LPS(100 ng/mL)、Mma20或BCG分別感染BMDM(MOI=10,感染時(shí)間24 h),細(xì)胞外的乳酸含量的檢測(cè)

2.2 海分枝桿菌以感染時(shí)間和感染復(fù)數(shù)(MOI)依賴的方式增加巨噬細(xì)胞的糖酵解代謝 為系統(tǒng)探究海分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞糖酵解代謝的影響,我們對(duì)不同感染時(shí)間和感染復(fù)數(shù)條件下的糖酵解變化進(jìn)行了詳細(xì)的研究。我們用Mma20分別感染BMDM 24 h、48 h或72 h,并對(duì)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)和培養(yǎng)基中乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,SLC2A1和LDHA的表達(dá)水平隨著感染時(shí)間的增加而升高,而HK2基因則在感染72 h后表達(dá)量顯著高于24和48 h(圖2a～2c)。同時(shí),我們?cè)谙嗤臅r(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞上清液中乳酸的濃度,感染Mma20的巨噬細(xì)胞上清液中乳酸含量隨著時(shí)間推移也有著顯著的差異(圖2d)。此外,我們?cè)诓煌腥緩?fù)數(shù)條件下檢測(cè)了這些關(guān)鍵基因的表達(dá)和代謝物產(chǎn)量。結(jié)果顯示,SLC2A1、HK2和LDHA的表達(dá)和乳酸濃度隨著感染復(fù)數(shù)的增加而升高(圖2e～2h)。

2a～2c: Mma20感染BMDM 24 h、48 h或72 h(MOI=10),RT-qPCR檢測(cè)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)水平;2d: Mma20感染BMDM 24 h、48 h或72 h(MOI=10),細(xì)胞外乳酸含量的檢測(cè);2e～2g: Mma20感染BMDM(MOI = 0、1、5或10,感染時(shí)間24 h),RT-qPCR檢測(cè)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)水平;2h: Mma20感染BMDM(MOI = 0、1、5或10,感染時(shí)間24 h),細(xì)胞外乳酸含量的檢測(cè)

2.3 活的海分枝桿菌可抑制巨噬細(xì)胞的糖酵解代謝 有研究表明,與熱滅活的結(jié)核分枝桿菌相比,活的結(jié)核分枝桿菌限制了巨噬細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)和乳酸的產(chǎn)生[10]。為了探索海分枝桿菌感染是否也會(huì)有類似的現(xiàn)象,我們比較熱滅活的海分枝桿菌(HK-Mma20)和活的海分枝桿菌(Mma20)對(duì)BMDM糖酵解的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與HK-Mma20相比,活的Mma20下調(diào)了BMDM中SLC2A1、HK2和LDHA的表達(dá)水平(圖3a～3c)。此外,活的Mma20感染BMDM后乳酸的釋放量也顯著低于HK-Mma20(圖3d)?？傊?活的Mma20能一定程度地抑制巨噬細(xì)胞糖酵解。

3a～3c:活的Mma20或HK-Mma20分別感染BMDM(MOI=10,感染時(shí)間72 h),RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平;3d:活的Mma20或HK-Mma20分別感染BMDM(MOI=10,感染時(shí)間72 h),細(xì)胞外乳酸含量的檢測(cè)

2.4 抑制巨噬細(xì)胞的糖酵解代謝促進(jìn)了胞內(nèi)海分枝桿菌的存活 為探究糖酵解的抑制是否有利于海分枝桿菌的存活,在Mma20感染前3 h,將糖酵解抑制劑2-DG 10 mM加入到BMDM細(xì)胞培養(yǎng)板中。2-DG被糖酵解第一步限速酶HK2磷酸化形成2-脫氧葡萄糖-6-磷酸(2-DG-6-P),其不能進(jìn)一步代謝并經(jīng)積累抑制糖酵解第一步,它是用于抑制糖酵解的常用分子[4,11]。因Mma20表達(dá)紅色熒光蛋白mCherry,我們?cè)诟腥?8 h后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)到在2-DG濃度為10 mM條件下mCherry陽性細(xì)胞比例和細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度顯著高于未加2-DG的條件下(圖4a、4b)。與此同時(shí),我們用共聚焦顯微鏡觀察了感染的BMDM中Mma20的熒光。在加入10 mM 2-DG感染48 h后,BMDM內(nèi)Mma20熒光強(qiáng)度明顯高于未加2-DG的條件下(圖4c)。以上結(jié)果表明2-DG的處理抑制了巨噬細(xì)胞的糖酵解代謝,減弱了細(xì)胞的殺菌能力,促進(jìn)了海分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的存活。

4a、4b:在培養(yǎng)基中加入10 mM 2-DG或不加2-DG條件下,Mma20感染BMDM(MOI=10,48h),流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽性細(xì)胞比例和細(xì)胞內(nèi)Mma20熒光強(qiáng)度(**表示P<0.01);4c:在培養(yǎng)基中加入10 mM 2-DG或不加2-DG條件下,Mma20感染BMDM(MOI=10,48 h),共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Mma20紅色熒光

3 討論

本世紀(jì)以來共報(bào)道三起群體海分枝桿菌感染暴發(fā)事件,第一起暴發(fā)感染事件發(fā)生于2008年,中國(guó)江蘇一處養(yǎng)魚場(chǎng)共計(jì)18名魚工感染[12]。第二起暴發(fā)感染事件發(fā)生于2013-2014年美國(guó)紐約魚市,感染人數(shù)總計(jì)98例[13]。最近的一起暴發(fā)感染事件則發(fā)生在2019-2020年山東壽光,217例患者均與鱸魚傳染有關(guān)[14]。此外,根據(jù)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院2008-2017年的數(shù)據(jù)報(bào)告顯示,該院非結(jié)核分枝桿菌感染率有明顯升高的趨勢(shì),其中海分枝桿菌占62.3%[15]。暴芳芳等通過文獻(xiàn)檢索共發(fā)現(xiàn)了2092例海分枝桿菌感染的報(bào)道,分布于全世界43個(gè)國(guó)家,其中美國(guó)居世界首位,高達(dá)757例,其次為中國(guó)441例,本世紀(jì)以來世界報(bào)道海分枝桿菌感染病例數(shù)量總體也呈現(xiàn)增多趨勢(shì)[2]。

正常條件下細(xì)胞內(nèi)葡萄糖以氧化磷酸化方式產(chǎn)生能量,在缺氧條件下則通過糖酵解途徑產(chǎn)生能量,然而Otto Heinrich Warburg發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的條件下也通過糖酵解途徑產(chǎn)生能量。因此,腫瘤細(xì)胞將葡萄糖代謝方式從氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為糖酵解的過程也被稱為Warburg效應(yīng),即代謝重編程[16-18]。代謝重編程指細(xì)胞通過改變代謝(糖代謝,脂質(zhì)代謝,氨基酸代謝)模式促進(jìn)自身存活和生長(zhǎng),這不僅能幫助細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境,還能賦予細(xì)胞新的功能[17,19]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞也能產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞類似的代謝重編程的現(xiàn)象[7,9]。而本研究以海分枝桿菌為模型,通過對(duì)糖酵解代謝相關(guān)基因的表達(dá)和乳酸的產(chǎn)生等的檢測(cè),系統(tǒng)研究了海分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞糖酵解的重編程現(xiàn)象,這和結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的糖酵解變化情況基本一致。Lachmandas等發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)人CD14+單核細(xì)胞糖酵解代謝相關(guān)基因HK2的表達(dá)上調(diào)以及細(xì)胞外乳酸產(chǎn)生增加[7]。Gleeson等發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染人肺泡巨噬細(xì)胞、人單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞和小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞后乳酸的生成增加[6]。Shi等發(fā)現(xiàn)小鼠肺中宿主細(xì)胞增強(qiáng)了葡萄糖的攝取、糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑以應(yīng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染[8]。Hackett等發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌以感染時(shí)間和感染復(fù)數(shù)依賴方式調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中乳酸的產(chǎn)生[10]。

對(duì)于海分枝桿菌對(duì)宿主細(xì)胞糖酵解的研究,Kan等發(fā)現(xiàn)海分枝桿菌感染小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)后葡萄糖的攝取、乳酸的分泌和糖酵解代謝中間體(己糖-6-磷酸、3-磷酸甘油酸和丙酮酸)的含量均增加[20]。但RAW264.7細(xì)胞是一種腫瘤細(xì)胞,有研究表明腫瘤細(xì)胞本身葡萄糖攝取增加,糖酵解活躍,乳酸產(chǎn)生增加,因此原代細(xì)胞可能是一種更為合適的巨噬細(xì)胞來研究海分枝桿菌感染后其糖酵解變化情況[16,21]。本文系統(tǒng)的研究了海分枝桿菌對(duì)小鼠原代巨噬細(xì)胞糖酵解的調(diào)控,發(fā)現(xiàn)海分枝桿菌以感染時(shí)間和感染復(fù)數(shù)依賴的方式增加原代巨噬細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因(SLC2A1、HK2和LDHA)的表達(dá)和乳酸的生成?？偠灾?海分枝桿菌感染有效的增加了巨噬細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的糖代謝重編程。

此外,在結(jié)核分枝桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)糖酵解抑制劑2-DG可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存活[10]。本研究表明2-DG也同樣促進(jìn)了海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。更有趣的是,與滅活的結(jié)核分枝桿菌不同,活的結(jié)核分枝桿菌最近被證明可以有效地抑制感染的巨噬細(xì)胞中的糖酵解轉(zhuǎn)變,這說明結(jié)核分枝桿菌已經(jīng)進(jìn)化出特定的策略,為了自身的存活來調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的糖酵解[10,22,23]。本研究發(fā)現(xiàn)與滅活的海分枝桿菌相比,活的海分枝桿菌抑制巨噬細(xì)胞中SLC2A1、HK2和LDHA的表達(dá)以及乳酸的產(chǎn)生。證實(shí)了活的海分枝桿菌也可抑制巨噬細(xì)胞的糖酵解代謝轉(zhuǎn)變,這可能是分枝桿菌甚至是胞內(nèi)菌免疫逃逸的共有機(jī)制。

總而言之,受感染的巨噬細(xì)胞的糖酵解受到其自身和海分枝桿菌的共同作用,這是決定感染結(jié)果的關(guān)鍵。因此,有望通過調(diào)控宿主細(xì)胞糖酵解代謝來輔助治療海分枝桿菌的慢性感染,減少治療周期。

志謝：感謝荷蘭萊頓大學(xué)Annemarie H. Meijer教授惠贈(zèng)的表達(dá)紅色熒光蛋白mCherry的海分枝桿菌菌株MycobacteriummarinumMma20和濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院劉昂副教授贈(zèng)送減毒牛型分枝桿菌。