鄒建文　饒紅欣　陳靈　羅先權(quán)　何潤華　陳銘　何艷

關(guān)鍵詞：黑老虎；DNA 指紋圖譜；遺傳多樣性；親緣關(guān)系

中圖分類號：S567.19 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

黑老虎（Kadsura coccinea）俗稱冷飯團(tuán)，為五味子科（Schisandraceae）南五味子屬一種常綠木質(zhì)藤本植物。黑老虎是一種食藥兼用的新型珍稀水果，具有較高的藥用價(jià)值和營養(yǎng)保健功效，而且其果形奇特、果期長，亦具有獨(dú)特的觀賞價(jià)值，在中藥材、水果和食品以及園林綠化美化等方面頗具發(fā)展?jié)摿1]。近年來，隨著其果實(shí)和相關(guān)產(chǎn)品在國內(nèi)市場不斷走俏，黑老虎在湖南、廣西、貴州和云南等?。▍^(qū)）得到大力發(fā)展，一些市（縣）形成了產(chǎn)業(yè)化發(fā)展格局，有力推動(dòng)了國家鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的實(shí)施。尤其在湖南通道縣，黑老虎的種植規(guī)模迅速擴(kuò)大，并且獲評國家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品[2]。在黑老虎的規(guī)模發(fā)展過程中，科研人員開展了黑老虎新種質(zhì)的挖掘和選育研究，并通過嫁接推廣應(yīng)用。目前已涌現(xiàn)出一批在果形、果色、口感、早實(shí)性等方面具特異性的品種（系）。

由于黑老虎的種質(zhì)特異性，以果實(shí)及其經(jīng)濟(jì)性狀為主，加之生長環(huán)境導(dǎo)致的營養(yǎng)器官形態(tài)變異也較大，在結(jié)實(shí)前依據(jù)形態(tài)性狀較難鑒別。由于DNA 標(biāo)記不受環(huán)境和發(fā)育時(shí)期的影響，構(gòu)建DNA 指紋圖譜是一種快速且準(zhǔn)確的途徑[3]。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、測試操作簡單、結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（International? Union for the Protection of NewVarieties of Plants， UPOV）確定為構(gòu)建植物品種（系）DNA 指紋數(shù)據(jù)庫的首選標(biāo)記[4]，已在寶巾花[5]、梨屬[6]、仁用杏[7]、核桃[8]、薄殼山核桃[9]、苦參[10]以及楊樹[11-12]等觀賞、食用、藥用以及材用植物品種（系）DNA 指紋圖譜上得到廣泛應(yīng)用。本研究應(yīng)用SSR 標(biāo)記技術(shù)分析湖南省選育的20個(gè)黑老虎品系的遺傳多樣性，探明其親緣關(guān)系，構(gòu)建SSR 指紋圖譜，旨在為黑老虎品種（系）鑒定以及新品種（系）選育與創(chuàng)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

20個(gè)黑老虎品系來自湖南省通道縣獨(dú)坡鎮(zhèn)蝦團(tuán)村、芷江縣大樹坳鄉(xiāng)竹坡村和芷江縣三道坑鎮(zhèn)芷溪村（表1）。其中，通道縣獨(dú)坡鎮(zhèn)蝦團(tuán)村自2004年以來開始發(fā)展黑老虎，建立了平寬黑老虎專業(yè)合作社，湖南省植物園與當(dāng)?shù)胤N植大戶合作收集、保存了大量黑老虎種質(zhì)資源，部分品系即來自該種質(zhì)資源圃；其他品系是利用芷江縣大樹坳鄉(xiāng)竹坡村和三道坑鎮(zhèn)芷溪村天然次生林內(nèi)的黑老虎優(yōu)株經(jīng)嫁接而獲得。部分品系特征見圖1。對每個(gè)品系采集其嫩葉，用硅膠（質(zhì)量比為1∶10）干燥帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

DNA 提取和SSR 分析。采用改良的CTAB法[13]提取DNA，從前期開發(fā)的28 對SSR 引種中選擇15 對（表2），應(yīng)用M13-tailed 引物法進(jìn)行SSR 分析[1]。采用10 μL 的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA 模板50 ng，dNTPs 150 μmol/L，MgCl22.0 μmol/L，M13 熒光標(biāo)記引物0.5 μmol/L，M13熒光標(biāo)記的正向引物0.5 μmol/L，反向引物0.5 μmol/L，1×PCR 緩沖液以及Taq DNA 聚合酶0.04 U/μL。PCR 緩沖液和Taq DNA 聚合酶由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)。在PCR 擴(kuò)增儀Master cycler Gradient Thermal Cycler （Eppendorf）上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其程序?yàn)椋? min 94 ℃預(yù)變性；30 s 94 ℃變性，30 s 60 ℃退火，30 s 72 ℃延伸，循環(huán)30 次；10 min 72 ℃延伸。選用GeneScan500 LIZ Size Standard（Applied Biosystems， USA）為內(nèi)標(biāo)，采用3730XL 自動(dòng)測序儀（Applied Biosystems，USA）檢測PCR 產(chǎn)物的多態(tài)性。應(yīng)用GeneMarker V2.2.0 軟件[14]判讀基因型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的基因型數(shù)量、特異等位基因數(shù)（Ap）以及鑒定品系數(shù)。應(yīng)用GenAlEx 6 軟件[15]計(jì)算每位點(diǎn)的等位基因數(shù)（A）、有效等位基因數(shù)（Ae）、Shannon 信息指數(shù)（I）、觀測雜合度（Ho）；基于等位基因頻率，采用公式PICi=1-ΣPij2 計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC），PIi=2（ΣPij2）2-ΣPij4 計(jì)算基因型相同的概率（PI），其中Pij 為位點(diǎn)i 等位基因j 的頻率[16]；按照各位點(diǎn)及其等位基因的有無構(gòu)建（ 0， 1 ） 矩陣， 應(yīng)用NYSYS-pc 2.1 軟件[17]計(jì)算品系間的Neis（1972）遺傳距離，基于遺傳距離進(jìn)行UPGMA（非加權(quán)組平均法）聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

15對SSR 引物在20 個(gè)黑老虎品系中共檢測到108 個(gè)基因型，76 個(gè)等位基因，其中18 個(gè)為特異等位基因，僅在1 個(gè)品系中出現(xiàn)。每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)（A）為2～15，有效等位基因數(shù)（Ae）為1.105～9.412，均以KCZ023 位點(diǎn)最高，15 個(gè)位點(diǎn)的A 和Ae 的平均值分別為5.067 和2.866。特異等位基因數(shù)（Ap）以KCZ023 和KCZ100 最多，均有4 個(gè)。Shannon 信息指數(shù)（I）為0.199～2.456，觀測雜合度（Ho）為0.100～0.900，多態(tài)信息含量（PIC）為0.095～0.894，亦均以KCZ023位點(diǎn)最高，15 個(gè)位點(diǎn)的I、Ho 和PIC 的平均值分別為1.106、0.473 和0.562。基因型相同的概率（PI）為0.020～0.824，以KCZ023 位點(diǎn)為最低（表3）。

2.2 親緣關(guān)系分析

20 個(gè)黑老虎品系間Neis（1972）遺傳相似系數(shù)為0.328～0.891，以TD07 與TD43 間遺傳相似系數(shù)最大，TD45 與TD46 間遺傳相似系數(shù)最小，其平均值為0.614（表4）。聚類分析發(fā)現(xiàn)，以遺傳相似系數(shù)0.57 為閾值可將20 個(gè)品系分為2 個(gè)類群：TD21、TD22、TD42、TD43、TD47、TD50、TD51 和TD54 等8 個(gè)品系聚為一類（I）；其他12個(gè)品系聚為一類（II）。以遺傳相似系數(shù)0.62 為閾值可將第II 類群分為3 個(gè)組：TD07、TD41、TD45、TD46、TD52、ZJ34、ZJ40 等7 個(gè)品系為一組；TD08 和TD19 為一組；TD23、TD40、TD44 為一組（圖2）。

2.3 DNA 指紋圖譜構(gòu)建

由表5 可知，15 個(gè)SSR 位點(diǎn)均不能單獨(dú)將20 個(gè)黑老虎品系完全區(qū)分開。其中，KCZ023 位點(diǎn)的區(qū)分能力最強(qiáng)，能單獨(dú)鑒別15 個(gè)品系，占75%；其次為KCZ035 位點(diǎn)，能單獨(dú)區(qū)分7 個(gè)品系，占35%；再次為KCZ100 和KCZ113，均能單獨(dú)鑒定出5 個(gè)品系，占25%；KCZ029、KCZ058和KCZ061 位點(diǎn)均不能單獨(dú)區(qū)分任何品系。

從表5 可以看出，位點(diǎn)兩兩組合中，KCZ023與KCZ059、KCZ023 與KCZ135 以及KCZ023 與KCZ147 等3 個(gè)組合中的任意一個(gè)均能將20 個(gè)品系完全區(qū)分，其他組合均不能將20 個(gè)品系完全區(qū)分。3 位點(diǎn)組合中，共有28 個(gè)組合能將20 個(gè)黑老虎品系完全區(qū)分，包括：（1）KCZ023 與KCZ035或KCZ023 與KCZ100，加上KCZ036、KCZ057、KCZ061、KCZ103 和KCZ113 的任意一個(gè)位點(diǎn)，計(jì)10 個(gè)組合；（2）KCZ035 與KCZ057，或KCZ035與KCZ059，或KCZ035 與KCZ100，加上KCZ103或KCZ135，計(jì)6 個(gè)組合；（3）KCZ035 與KCZ113加上KCZ059 或KCZ100 ， 以及KCZ035 與KCZ147 加上KCZ057 或KCZ059，計(jì)4 個(gè)組合；（ 4 ） KCZ035 與KCZ103 加上KCZ113 或KCZ135，以及KCZ035 與KCZ113 加上KCZ135或KCZ147，計(jì)4 個(gè)組合；（5）KCZ035、KCZ036和KCZ059，KCZ035、KCZ135 和KCZ147，KCZ057、KCZ100 和KCZ113 以及KCZ100、KCZ113 和KCZ135 等4 個(gè)組合。

3討論

本研究應(yīng)用15對SSR 引物研究了20 個(gè)黑老虎品系的遺傳多樣性，檢測到76 個(gè)等位基因、18個(gè)特異等位基因和108個(gè)基因型，尤其是KCZ023位點(diǎn)具有15 個(gè)等位基因，高于該位點(diǎn)在城步、桂東和會(huì)同3 個(gè)天然群體所檢測到的等位基因數(shù)（13）[1]，而且該位點(diǎn)對于黑老虎品系的區(qū)分能力最強(qiáng)，可單獨(dú)區(qū)分15 個(gè)品系，可作為黑老虎品系鑒定的核心位點(diǎn)。20 個(gè)品系的多態(tài)信息含量（PIC）為0.095～0.894，絕大多數(shù)高于城步、桂東和會(huì)同3 個(gè)天然群體[1]，說明20 個(gè)黑老虎品系具有較高的遺傳多樣性。其原因可能是：盡管20個(gè)品系絕大部分來自湖南通道縣獨(dú)坡鎮(zhèn)蝦團(tuán)村，由于通道縣位于湖南、貴州和廣西三?。▍^(qū)）交界處，亦是人工種植黑老虎最早的地區(qū)之一[2]，當(dāng)?shù)胤N植大戶從各地廣泛收集黑老虎種質(zhì)資源進(jìn)行種植，湖南省植物園在當(dāng)?shù)胤N植大戶的基礎(chǔ)上也開展了黑老虎種質(zhì)資源的收集、保存和新品種（系）選育研究，使選育的品種（系）多樣性較為豐富。

20個(gè)黑老虎品系間的遺傳相似系數(shù)為0.328～0.891，依據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，可將20 個(gè)黑老虎品系劃分為2 個(gè)類群，其親緣關(guān)系與各品系的果色、果形、風(fēng)味等性狀并無明顯的相關(guān)性。如，TD45 和TD46 兩個(gè)品系的親緣關(guān)系最近，而果實(shí)顏色迥異，分別為紫黑色和粉色；同為早熟的TD44 和TD47 兩個(gè)品系的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分別屬于不同的類群；親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的2個(gè)品系TD07 和TD43 在果色和口感上也差異明顯，前者為虎綠、口感一般，而后者通常為紫紅色，果肉多且甜。這與本研究使用的SSR 標(biāo)記有關(guān)，因?yàn)檫@些SSR 標(biāo)記是通過簡化基因組測序開發(fā)而獲得的[1]，多為中性標(biāo)記。

目前黑老虎種質(zhì)主要通過嫁接方式無性系化進(jìn)行推廣應(yīng)用。本研究構(gòu)建了20 個(gè)黑老虎品系的SSR 指紋圖譜，從3 個(gè)2 位點(diǎn)組合和28 個(gè)3 位點(diǎn)組合中選擇任意組合均能將20個(gè)品系完全區(qū)分。15 個(gè)位點(diǎn)中，滿足PIC＞0.5 和PI＜0.2 的位點(diǎn)為KCZ023、KCZ035、KCZ059、KCZ100、KCZ113和KCZ135，說明這些位點(diǎn)均具有足夠的區(qū)分能力[16]，其組合可優(yōu)先應(yīng)用于黑老虎品系的鑒定。盡管嚴(yán)格意義上而言，對于有限數(shù)量的品系，DNA 指紋圖譜可用于區(qū)分品系，但未能應(yīng)用于直接鑒定[18]。然而這20 個(gè)品系涵蓋了目前生產(chǎn)上應(yīng)用的種質(zhì)，應(yīng)用這些SSR 指紋圖譜，可以區(qū)分在形態(tài)上相似的品系，如，果色同為虎綠的TD07和TD52，同為長形果的TD42 和TD50；亦可以為黑老虎品系嫁接苗的管理提供參考[19]。

綜上所述，本研究揭示了20個(gè)黑老虎品系的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，構(gòu)建了SSR 指紋圖譜，能夠準(zhǔn)確區(qū)分這些品系，不僅利于黑老虎品種（系）鑒定，也可應(yīng)用于黑老虎的雜交親本選配。黑老虎具有保健食用、藥用以及觀賞價(jià)值，隨著新種質(zhì)的不斷挖掘，新品種（系）將不斷涌現(xiàn)，SSR指紋圖譜也需要不斷更新；另一方面，針對其表型性狀的獨(dú)特性開發(fā)轉(zhuǎn)錄組SSR 標(biāo)記，并應(yīng)用于SSR 指紋圖譜構(gòu)建，從而使指紋圖譜更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。