劉英玉，楊　舟，吾買爾江·牙合甫，張曉紅，米克熱木·沙衣布扎提，姚　剛

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

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新疆伊犁某肉牛場(chǎng)大腸埃希菌及其毒力基因的檢測(cè)

劉英玉，楊舟，吾買爾江·牙合甫，張曉紅，米克熱木·沙衣布扎提，姚剛*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

摘要：為了解新疆伊犁某肉牛場(chǎng)潛在的致病性大腸埃希菌，對(duì)新疆伊犁地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)2013年秋季和2014年夏冬兩季的飼草料和糞樣及定點(diǎn)屠宰場(chǎng)2013年和2014年秋季屠宰加工環(huán)節(jié)的樣品進(jìn)行大腸埃希菌的分離鑒定，采用PCR方法檢測(cè)大腸埃希菌毒力基因(stx1和stx2、eae)存在的數(shù)量。結(jié)果表明，該養(yǎng)殖場(chǎng)飼草料樣品在夏季、秋季、冬季的大腸埃希菌分離率分別為44.8%、31.4%和6.0%，其毒力基因的檢出率為3.6%；該養(yǎng)殖場(chǎng)糞樣樣品在夏季、秋季、冬季的大腸埃希菌分離率分別為70.7%、75.0%和74.4%，其毒力基因的檢出率為23.5%；定點(diǎn)屠宰場(chǎng)在加工環(huán)節(jié)樣品中2013年和2014年秋季的大腸埃希菌分離率為32.4%和32.5%，只有1株菌株攜帶有毒力基因stx1和stx2，檢出率為4.2%。新疆伊犁地區(qū)不同季節(jié)對(duì)飼草料中大腸埃希菌的污染分布具有影響，糞樣中具有比較穩(wěn)定的大腸埃希菌數(shù)量，其毒力基因的檢出率最高。

關(guān)鍵詞：大腸埃希菌；毒力基因；飼草料；糞樣；屠宰加工環(huán)節(jié)

食品安全問(wèn)題是當(dāng)今世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，而食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因，其中致病性大腸埃希菌是嚴(yán)重威脅人類健康的致病菌之一。無(wú)論在發(fā)展中國(guó)家還是在發(fā)達(dá)國(guó)家由大腸埃希菌所致的腹瀉仍然嚴(yán)重威脅著人類健康，并引起患畜生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，生產(chǎn)性能低下，甚至造成死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p失。其中腸出血性大腸埃希菌(Entero-hemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)是一種新型的致病性大腸埃希菌，腸出血性大腸埃希菌感染性腹瀉對(duì)腸道的危害比較嚴(yán)重[1]，血清型主要包括O157:NM、O26:H8、O125:NM和O45:p等，其中以O(shè)157:H7血清型為主，占90%以上，是出血性腸炎的主要病原體[2]，國(guó)內(nèi)外多次暴發(fā)EHEC感染事件，均由該血清型引起。多年來(lái)對(duì)EHEC研究發(fā)現(xiàn)，其致病性主要表現(xiàn)在其產(chǎn)生的志賀毒素(Shiga toxin，stx)和黏附力兩個(gè)方面，主要包括編碼志賀毒素的stx1和stx2基因、緊密黏附素的eae基因(主要位于細(xì)菌毒力島內(nèi))、腸溶血素(hemolysin，Hly)和腸凝集性熱穩(wěn)定毒素的毒力基因[3]，都可對(duì)生物體產(chǎn)生一定程度的危害。

動(dòng)物產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)羌馀ｐB(yǎng)殖過(guò)程與屠宰加工過(guò)程為一體的動(dòng)物性食品生產(chǎn)模式，也是為了從源頭控制肉品質(zhì)量安全提出的檢測(cè)體系。新疆伊犁地區(qū)是新疆肉牛養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)之一，該地區(qū)大多采用暖季放牧、冷季舍飼的集約化或半集約化養(yǎng)殖方式。有報(bào)道新疆肉牛規(guī)?；涝走^(guò)程中存在有大腸埃希菌的污染[4-5]，影響了牛肉的質(zhì)量安全。本研究對(duì)某養(yǎng)殖場(chǎng)2013年秋季和2014年夏冬兩季的飼草料和糞樣及定點(diǎn)屠宰場(chǎng)2013年和2014年秋季屠宰加工環(huán)節(jié)的樣品進(jìn)行大腸埃希菌的分離鑒定，進(jìn)一步采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法檢測(cè)大腸埃希菌毒力基因(eae、stx1、stx2)的分布情況，分析肉牛養(yǎng)殖過(guò)程中飼草料和糞樣在不同季節(jié)條件下和該養(yǎng)殖場(chǎng)在定點(diǎn)屠宰場(chǎng)中屠宰加工環(huán)節(jié)的大腸埃希菌污染狀況，調(diào)查大腸埃希菌攜帶毒力基因的數(shù)量。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品的采集飼草料和糞樣在伊犁地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)于2013年秋季和2014年夏冬兩季采集。飼草料的種類包括精飼料、青貯、青干草和秸稈類，共計(jì)194份，飼草料的采集方法和保存方式：按照隨機(jī)采樣原理，采用無(wú)菌手套采集飼料庫(kù)中的備料和飼槽前待喂的飼料約200 g～300g放入自封袋，隨即置入已用冰袋預(yù)冷的塑料泡沫盒中防止細(xì)菌增生。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室用粉碎機(jī)粉碎后移入4℃冰箱中備用待檢。共采集新鮮糞樣335份，糞樣的采集方法和保存方式：用棉拭子沾取新鮮糞便后放入滅菌的300 mL/L甘油的離心管中。通過(guò)保存在4℃車載冰箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。屠宰加工環(huán)節(jié)是對(duì)該規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的定點(diǎn)屠宰場(chǎng)2013年和2014年秋季展開(kāi)的采集，屠宰加工環(huán)節(jié)中樣品的的采集方法：胴體表面和加工用具用棉棒擦拭表面后放入225 mL生理鹽水中，牛肉組織用絞肉機(jī)絞碎后稱取25 g放入225 mL生理鹽水中混勻，共采集74份。

1.1.2引物設(shè)計(jì)合成參考Jianfa Bai的引物設(shè)計(jì)方法[6]設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1),用1×TE(10 mmol/L Tri-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0)稀釋引物為使用濃度10 μmol/L。

表1　多重PCR引物序列和擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.1.3PCR所用試劑TaqMasterMix、DNA Marker DL 2 000、瓊脂糖等,購(gòu)自新疆偉博鑫生物有限公司。

1.2方法

1.2.1菌株的分離和鑒定

1.2.1.1糞樣中大腸埃希菌的分離鑒定取糞樣液接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，劃線接種到伊紅美藍(lán)平皿中，觀察瓊脂上出現(xiàn)紫紅色金屬光澤菌落后挑取單菌落到麥康凱瓊脂中純化，并對(duì)單菌落革蘭染色鏡檢，將鑒定完成的菌株挑取單菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)18 h～24 h后，用300 mL/L甘油進(jìn)行保菌備用。

1.2.1.2飼草樣中大腸埃希菌的分離鑒定按照飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T18869—2002檢驗(yàn)方法中規(guī)定的大腸菌群檢測(cè)方法進(jìn)行分離，同時(shí)挑取具有典型大腸埃希菌特征的單菌落用革蘭染色法鏡檢，用300 mL/L甘油進(jìn)行保菌備用。

1.2.1.3屠宰加工環(huán)節(jié)中大腸埃希菌的分離鑒定按照食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.3—2008檢驗(yàn)方法中規(guī)定的大腸菌群檢測(cè)方法進(jìn)行分離，同時(shí)挑取具有典型大腸埃希菌特征的單菌落革蘭染色鏡檢，用300 mL/L甘油進(jìn)行保菌備用。大腸埃希菌CICC21530標(biāo)準(zhǔn)株：由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2.2細(xì)菌模板制備分別將分離純化的大腸埃希菌菌落重懸于100 μL雙蒸水，100℃水浴煮沸10 min，再置于冰上5 min，最后10 000 r/min離心10 min，收集上清為細(xì)菌模板。

1.2.3毒力基因的PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)體系為：TaqMasterMix 10 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL，細(xì)菌DNA模板2 μL，補(bǔ)去離子H2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，50℃～60℃ 30 s，72℃ 1 min，共34個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃終止反應(yīng)。取10 μL PCR產(chǎn)物于制備好的10g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在EB染色液中進(jìn)行染色，在凝膠成像系統(tǒng)下記錄結(jié)果。

2結(jié)果

2.1某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)飼草料和糞樣中大腸埃希菌及毒力基因的檢測(cè)

伊犁地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)飼草料樣品中大腸埃希菌的檢測(cè)結(jié)果如表2。2013年秋季采集的86份飼草料中分離鑒定出大腸埃希菌27份，分離率為31.4%；2014年夏季采集的58份飼草料中分離鑒定出大腸埃希菌26份，分離率為44.8%；2014年冬季采集的50份飼草料中分離鑒定出大腸埃希菌3份，分離率為6.0%。其志賀毒素毒力基因檢測(cè)有1株大腸埃希菌攜帶有stx1和stx2，緊密黏附素毒力基因檢測(cè)有1株大腸埃希菌攜帶有eae，飼草料中毒力基因(stx1和stx2、eae)檢出率為3.6%(2/56)(表2)。

伊犁地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)糞樣中大腸埃希菌的檢測(cè)結(jié)果如表2。2013年秋季采集的60份糞樣中有45份存在大腸埃希菌，分離率為75.0%；2014年夏季采集的150份糞樣中有106份存在大腸埃希菌，分離率為70.7%；2014年冬季采集的125份糞樣中有93份存在大腸埃希菌，分離率為74.4%。其志賀毒素毒力基因檢測(cè)有37株大腸埃希菌攜帶該基因，其中有17株大腸埃希菌攜帶有毒力基因stx1，檢測(cè)率為45.9%(17/37)，有16株大腸埃希菌攜帶有毒力基因stx2，檢測(cè)率為43.2%(17/37)，有4株大腸埃希菌攜帶有毒力基因stx1和stx2，檢測(cè)率為10.8%(4/37)；緊密黏附素毒力基因檢測(cè)有19株大腸埃希菌攜帶有eae，總體來(lái)看，糞樣中檢測(cè)出攜帶大腸埃希菌毒力基因(stx1和stx2、eae)的菌株數(shù)量較多，檢測(cè)率為23.5%(56/244)。

表2　肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中牛源大腸埃希菌及毒力基因檢測(cè)結(jié)果

2.2定點(diǎn)屠宰場(chǎng)加工環(huán)節(jié)中大腸埃希菌及毒力基因的檢測(cè)

伊犁地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)在定點(diǎn)屠宰場(chǎng)的加工環(huán)節(jié)中大腸埃希菌的檢測(cè)結(jié)果如表2。2013年秋季在屠宰場(chǎng)采集的34份樣品分離鑒定出大腸埃希菌11份，分離率為32.4%，2014年秋季在屠宰場(chǎng)采集的40份樣品分離鑒定出大腸埃希菌13份，分離率為32.5%。大腸埃希菌毒力基因(stx1和stx2、eae)的檢測(cè)只有1株菌大腸埃希菌攜帶有毒力基因stx1和stx2，檢出率為4.2%(1/24)。

3討論

飼料中富含有碳水化合物、維生素、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是大腸埃希菌生長(zhǎng)的天然培養(yǎng)基，大腸埃希菌的存在影響了動(dòng)物飼料的衛(wèi)生質(zhì)量。通過(guò)檢測(cè)伊犁地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)不同季節(jié)飼料受大腸埃希菌的污染程度發(fā)現(xiàn)，冬季氣溫較低飼料中大腸埃希菌的數(shù)量很少，而夏秋兩季的飼料中水分充足，合適的氣溫使存在飼草料中的大腸埃希菌容易繁殖，這與陳欣[7]報(bào)道土壤中大腸菌群數(shù)在夏季上升，而冬季下降一致。糞樣中存在的大腸埃希菌是飼草料的重要污染源，家畜養(yǎng)殖場(chǎng)所與飼料貯存點(diǎn)較近或?qū)暳现苯哟娣旁谧匀画h(huán)境中易導(dǎo)致大腸埃希菌的污染[8]，該規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)糞樣中大腸埃希菌的分離率在70%～75 %之間，說(shuō)明該養(yǎng)殖場(chǎng)的肉牛體內(nèi)存在比較穩(wěn)定的大腸埃希菌，需要加強(qiáng)飼草料的管理和監(jiān)測(cè)。肉牛屠宰加工環(huán)節(jié)中樣品包括牛肉、屠宰后胴體表面及加工過(guò)程中的工具等，定點(diǎn)屠宰場(chǎng)的大腸埃希菌分離率達(dá)到了30%，需要嚴(yán)格控制屠宰加工環(huán)節(jié)中大腸埃希菌的污染源，來(lái)保證牛肉的衛(wèi)生質(zhì)量安全。

快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)大腸埃希菌的致病性具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，其中檢測(cè)毒力基因是判定致病性大腸埃希菌的一個(gè)重要手段。緊密黏附素(eae)的主要致病能力是細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞的刷狀緣緊密黏附，導(dǎo)致腸微絨毛損傷消失，腸上皮細(xì)胞骨架發(fā)生改變，絲狀肌動(dòng)蛋白聚集等。目前研究證據(jù)表明，腸致病性大腸埃希菌(EPEC)和腸出血性大腸埃希菌(EHEC)都能引起特征性的黏附與脫落病變[9]。對(duì)伊犁地區(qū)肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中大腸埃希菌進(jìn)行毒力基因eae的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)飼草料和糞樣中存在大腸埃希菌攜帶毒力基因eae。近年來(lái)stx被國(guó)際社會(huì)列入生物武器核查清單中11種生物毒素之一，成為潛在的生物毒素戰(zhàn)劑和生物恐怖病原[10]。志賀毒素是大腸埃希菌中具有溶解致死作用的細(xì)胞毒素，stx家族包括stx1、stx2、stx2c、stx2d、stx2e和stx2f等，研究得最多的主要是stx1和stx2兩種[11]。有研究表明EHEC能產(chǎn)生stx1和stx2毒素或只產(chǎn)生stx2毒素，因此stx2毒素認(rèn)為是主要的毒力因子[12]。Dastmalchi S H和Ayremlou N報(bào)道[13]伊朗某地區(qū)從健康和腹瀉的小牛糞樣中分離鑒定的產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(STEC)通過(guò)PCR檢測(cè)出有6株(23.1%)攜帶stx1基因，有7株(26.9%)攜帶stx2基因，有13株(50%)攜帶stx1和stx2基因。伊犁地區(qū)不同季節(jié)中肉牛糞樣中分離鑒定的大腸埃希菌志賀毒素基因檢測(cè)中17株(45.9%)攜帶stx1基因，有16株(43.2%)攜帶stx2基因，有4株(10.8%)攜帶stx1和stx2基因。說(shuō)明不同國(guó)家不同地區(qū)分離鑒定的大腸埃希菌中攜帶的志賀毒素基因具有明顯得差異性。伊犁地區(qū)定點(diǎn)屠宰加工場(chǎng)中檢測(cè)出有1株攜帶有志賀毒素的大腸埃希菌，與Rogerie F等報(bào)道[14]的法國(guó)加工廠夏季在胴體加工后非O157 STEC的數(shù)量較低(1.9%)一致。同樣的，香港被報(bào)道[15]胴體加工后非O157 STEC的數(shù)量為1.7%。肉牛定點(diǎn)屠宰加工環(huán)節(jié)對(duì)牛肉質(zhì)量安全具有重要的影響，需要加強(qiáng)大腸埃希菌毒力基因的檢測(cè)來(lái)預(yù)防致病性大腸埃希菌的危害。

牛是大腸埃希菌的儲(chǔ)存宿主，致病性大腸埃希菌對(duì)人類和動(dòng)物的安全具有潛在的威脅。通過(guò)調(diào)查新疆伊犁地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)和定點(diǎn)屠宰場(chǎng)中大腸埃希菌的污染狀況，結(jié)果表明不同季節(jié)對(duì)飼草料中大腸埃希菌的污染分布具有影響，糞樣中具有比較穩(wěn)定的大腸埃希菌數(shù)量，屠宰加工環(huán)節(jié)也存在一定程度的大腸埃希菌污染。對(duì)分離鑒定的大腸埃希菌進(jìn)行毒力基因的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)糞樣中存在的毒力基因數(shù)量最多，飼料和屠宰加工環(huán)節(jié)中毒力基因數(shù)量很低。此結(jié)果說(shuō)明該地區(qū)肉牛攜帶穩(wěn)定的大腸埃希菌，其毒力基因分布具有一定的地域特點(diǎn)。

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Detection ofEscherichiacoliand Its Virulence Genes in A Beef Cattle Farm in Yili Area of Xinjiang

LIU Ying-yu，YANG Zhou，WUMAIERJIANG·Ya-he-fu，ZHANG Xiao-hong，MIKEREMU· Sha-yi-bu-zha-ti，YAO Gang

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China)

Abstract:To explore the potential pathogenic E.coli in the beef industry chain in Yili area of Xinjiang,this study isolated and identified of the E.coli from the samples in Yili area of Xinjiang.The samples included the forage and feces in the farms in autumn of 2013 and in summer and winter of 2014,as well as the slaughter processing link samples in the designated slaughter house in autumn of 2013 and 2014.The PCR method was used to detect the number of E.coli virulence genes (stx1 and stx2,eae).The isolation rates of E.coli from forage in the farms were 44.8%,31.4%,6.0% during the summer,autumn and winter,respectively.The detection rate of E.coli virulence genes from forage was 3.6%.The isolation rates of E.coli from feces in the farms were 70.7%,75.0%, 4.4% during the summer,autumn and winter,respectively.The detection rate of E.coli virulence genes from feces was 23.5%.The isolation rates of E.coli from slaughter processing link samples in the designated slaughter house were 32.4% and 32.5% during the autumn of 2013 and 2014.Only one bacterial strain encodes the virulence genes stx1 and stx2,the detection rate was 4.2%.The pollution distribution of E.coli from forage had affects in different seasons in Yili area of Xinjiang.The feces had the relatively stable numbers of E.coli.The detection rate of E.coli virulence genes was the highest in the feces.

Key words:Escherichia coli; virulence genes; forage; feces; slaughter and processing link

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0045-04

中圖分類號(hào):S851.43;S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：劉英玉(1984-)，女，重慶涪陵人，博士，主要從事畜產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD47B04)；基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)新疆普通高等學(xué)校重點(diǎn)學(xué)科科研啟動(dòng)項(xiàng)目；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014211B020)；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧學(xué)科研流動(dòng)站博士后經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目

收稿日期：2015-10-07