劉紫杉，王一鑫，李永明

上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，上海（200072）

牙槽骨是牙齒的重要支持部分，在正畸牙移動及牙周炎發(fā)展及治療的過程中，涉及到骨穩(wěn)態(tài)的平衡及骨改建。牙槽骨血供豐富，在受到機(jī)械應(yīng)力、炎癥刺激時(shí)，由于骨組織內(nèi)血流中斷，部分區(qū)域組織無法正常供氧及營養(yǎng)物質(zhì)，常常處于低氧環(huán)境［1］。低氧參與并影響機(jī)體正常生理過程，氯化鈷是已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的低氧模擬物，通過增加缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）的表達(dá)水平影響下游的低氧反應(yīng)元件，從而使細(xì)胞達(dá)到化學(xué)低氧狀態(tài)，可用于體外研究模擬細(xì)胞低氧狀態(tài)［2-3］。研究表明，HIF-1α 參與調(diào)控低氧環(huán)境下機(jī)體的反應(yīng)，是骨組織在低氧環(huán)境下調(diào)節(jié)骨代謝的核心分子［4］。HIF-1α 的激活刺激多個(gè)缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，可通過多種通路參與調(diào)節(jié)骨的形成與恢復(fù)［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞表達(dá)的促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞激酶受體配體B2（erythropoietin producing hepatocyte kinase receptor ligand B2，EphrinB2）和成骨細(xì)胞表達(dá)的促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞激酶受體B4（erythropoietin producing hepatocyte kinase receptor B4，EphB4）通過相互作用產(chǎn)生雙向信號，影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能，參與骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)控［7-8］。在成骨細(xì)胞譜系中，EphrinB2 與EphB4均有表達(dá)，通過相互作用，可以抑制成骨細(xì)胞的凋亡來支持成骨細(xì)胞譜系的持續(xù)分化，從而維持促進(jìn)新的類骨質(zhì)基質(zhì)礦化［9］。但在低氧條件下，缺氧對成骨細(xì)胞EphrinB2/EphB4 的表達(dá)及成骨分化的影響目前尚不清楚。

本研究通過使用氯化鈷（CoCl2）模擬低氧環(huán)境，觀察低氧環(huán)境下MC3T3-E1 細(xì)胞HIF-1α、EphrinB2 及EphB4 的表達(dá)變化及成骨分化情況，了解低氧是否通過EphrinB2/EphB4 信號通路調(diào)控MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨分化，為低氧環(huán)境下骨代謝機(jī)制的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC3T3-E1（上海研生生化試劑有限公司，中國），PBS（Hyclone，美國），胎牛血清（BI，以色列），DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國），50 μmol/L抗壞血酸（Sigma，美國），10 mmol/L β-磷酸甘油（Sigma，美國），100 nmol/L 地塞米松（Sigma，美國），1%青-鏈霉素（Hyclone，美國），胰蛋白酶（Gibco，美國），RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本），TRIZOL 試劑（Thermo Fish，美國），茜素紅工作染液（Solarbio，中國），BCIP/NBT 免疫組織化學(xué)顯色試劑盒（上海生工生物公司，中國），氯化鈷（Sigma，美國），EphB4 激酶自身磷酸化抑制劑NVPBHG712（MCE，美國）。

RIPA 裂解液（Thermo Fisher，美國），兔抗鼠多克隆HIF-1α 抗體（1∶1 000，Affinity，美國），兔抗鼠多克隆β-actin 抗體（1∶3 000，Affinity，美國），兔抗鼠多克隆EphB4 抗體（1：1 000，Proteintech，美國），兔抗鼠多克隆runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt related transcription factor 2，RUNX2）抗體（1∶1 000，Affinity，美國），兔抗鼠多克隆I 型膠原（collogen-1，COL I）抗體（1：1 000，Affinity，美國），兔抗鼠多克隆堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）抗體（1∶1 000，博士德，中國），鼠單克隆骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體（1∶1 000，博士德，中國），羊抗兔熒光二抗（IR Dye 800CW，Abcam，英國）、羊抗鼠熒光二抗（IR Dye 680RD，Abcam，英國），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Lightcyler96，Roche，瑞士），Western 激光成像系統(tǒng)（Odyssey clx，LICOR，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與低氧誘導(dǎo)

在DMEM 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，1%青-鏈霉素配制完全培養(yǎng)基用于培養(yǎng)MC3T3-E1 細(xì)胞，在5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)。氯化鈷組培養(yǎng)基中加入125 μmol/L 的氯化鈷，對照組使用正常培養(yǎng)基，氯化鈷+抑制劑組在培養(yǎng)基中加入125 μmol/L 的氯化鈷和50 nmol/L 的NVP-BHG712，NVP-BHG712 是EphB4 激酶自身磷酸化的抑制劑，阻止EphB4 與EphrinB2 的接觸反應(yīng)。在48 h 后對細(xì)胞進(jìn)行RNA 和蛋白質(zhì)的提取。在完全培養(yǎng)基中加入50 μmol/L 抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、100 nmol/L 地塞米松，對細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，每48 h更換培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞增殖測定

以2×104個(gè)/mL 接種MC3T3-E1 細(xì)胞于96 孔板，按照分組處理培養(yǎng)48 h 后，PBS 洗滌，每孔加入CC-K8 溶液10 μL 與90 μL 完全培養(yǎng)基，于37 ℃CO2培養(yǎng)箱孵育2 h 后，酶標(biāo)儀波長450 nm 檢測吸光度，根據(jù)公式：細(xì)胞活力=（實(shí)驗(yàn)組的吸光度-空白組的吸光度）/（對照組的吸光度-空白組的吸光度），計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4 qRT-PCR

按分組處理細(xì)胞48 h，使用TRIZOL 對各組細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR 檢測成骨標(biāo)志物ALP、RUNX2、COL 1、OCN 的變化情況，以及信號分子HIF-1α、EphrinB2、EphB4 的變化。以β-actin 作為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primers sequences

1.5 Western blot

按分組處理MC3T3-E1 細(xì)胞48 h 后，棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解細(xì)胞，進(jìn)行蛋白的抽提及定量。取等量總蛋白100 ℃加熱5 min，10%及12.5%SDS-PAGE 電泳分離后，轉(zhuǎn)至NC 膜，使用5%BSA 封閉1 h，封閉后分別與兔抗鼠多克隆HIF-1α 抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆β-actin 抗體（1∶3 000），兔抗鼠多克隆EphB4抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆Ephrinb2 抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆ALP 抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆RUNX2抗體（1∶1 000），兔抗鼠多克隆COL I抗體（1∶1 000），鼠單克隆OCN 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，使用羊抗兔熒光二抗或羊抗鼠熒光二抗孵育，使用Odyssey clx 激光成像系統(tǒng)顯色。

1.6 ALP 染色及定量分析

對3 組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d，棄培養(yǎng)基，使用PBS清洗細(xì)胞3 次，使用4%的多聚甲醛固定液固定，按照BCIP/NBT 免疫組織化學(xué)顯色試劑盒說明書配置ALP 染色液，染色5 min 后洗滌，拍照。使用Image J對染色結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 茜素紅染色

不同條件處理下的細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d 后，首先使用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 輕緩沖洗3 次，加入茜素紅工作染液室溫染色5～10 min，吸取染色液，使用PBS 輕柔洗滌，顯微鏡下拍攝，使用Image J 對染色結(jié)果進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)進(jìn)行并獨(dú)立進(jìn)行3 次。使用SPSS20.0、GraphPad Prism8.0、Image J 軟件進(jìn)行分析與繪圖，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 氯化鈷及EphB4 磷酸化抑制劑NVP-BHG712對MC3T3-E1 細(xì)胞增殖的影響

分別使用125 μmol/L 的氯化鈷，50 nmol/L 的NVP-BHG712 處理MC3T3-E1 細(xì)胞48 h 后，與對照組比較，細(xì)胞增殖率無明顯差異（圖1）（P＞0.05），說明在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入氯化鈷和抑制劑NVPBHG712 不影響細(xì)胞的增殖與凋亡。

圖1 氯化鈷及NVP-BHG712 處理MC3T3-E1 48 h 對細(xì)胞增殖的影響Figure 1 The effect of CoCl2and NVP-BHG712 treatment on MC3T3-E1 cell proliferation for 48 h

2.2 氯化鈷低氧誘導(dǎo)對MC3T3-E1 成骨分化的影響

兩組MC3T3-E1 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后成骨標(biāo)記物mRNA 的檢測結(jié)果顯示：相比對照組，MC3T3-E1 經(jīng)過125 μmol/L 氯化鈷刺激48 h 后，ALP（t= 3.215，P= 0.032 4）、RUNX2（t= 5.332，P= 0.006）、COL I（t=12.41，P=0.000 2）、OCN（t=6.175，P=0.003 5）等成骨標(biāo)志物mRNA 表達(dá)明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2a）。兩組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d 后ALP染色結(jié)果如圖2b，Image J 定量分析結(jié)果顯示，氯化鈷組細(xì)胞成骨分化明顯高于對照組（t= 8.023，P=0.015 2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2c）。

圖2 氯化鈷低氧誘導(dǎo)對MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化影響Figure 2 Effects of hypoxia caused by CoCl2on osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells

2.3 低氧誘導(dǎo)使MC3T3-E1 中HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，并上調(diào)EphrinB2 及EphB4 的表達(dá)

在MC3T3-E1 的培養(yǎng)基中加入氯化鈷可以上調(diào)HIF-1α 的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)模擬低氧環(huán)境，其中mRNA上調(diào)120 倍（t= 9.406，P= 0.000 7），HIF-1α/β-actin蛋白比值增加1.5 倍（t= 17.49，P＜0.000 1）。通過對氯化鈷誘導(dǎo)48 h 后的細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)EphrinB2（t= 15.82，P＜0.000 1）和EphB4（t=23.40，P＜0.000 1）表達(dá)上調(diào)（圖3a）。經(jīng)Western blot 檢測，EphrinB2/β-actin 蛋白比值（t=16.44，P＜0.000 1）增加，EphB4/β-actin 蛋白比值（t= 14.87，P=0.000 1）也增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3b、3c）。

圖3 MC3T3-E1 細(xì)胞在氯化鈷低氧誘導(dǎo)下HIF-1α，EphrinB2，EphB4 基因及蛋白表達(dá)變化Figure 3 Expression of HIF-1α,EphrinB2,and EphB4 in MC3T3-E1 cells under hypoxia caused by CoCl2

2.4 抑制低氧誘導(dǎo)下EphrinB2 與EphB4 的結(jié)合可抑制細(xì)胞成骨分化及礦化

相比氯化鈷組，添加抑制劑組ALP（t= 5.324，P= 0.006）、RUNX2（t= 13.38，P= 0.000 2）、COLI（t=7.435，P=0.001 7）、OCN（t=2.385，P=0.075 5）成骨標(biāo)記物mRNA 表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4a）。

三組成骨誘導(dǎo)7 d ALP 染色結(jié)果見圖4b，Image J 定量分析結(jié)果顯示，使用EphB4 激酶自身磷酸化抑制劑后，細(xì)胞的成骨分化明顯減少（t=57.69，P=0.000 3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4c）。成骨誘導(dǎo)21 d 茜素紅染色結(jié)果見圖4d，Image J 定量分析結(jié)果顯示，使用EphB4 激酶自身磷酸化抑制劑后，細(xì)胞的礦化明顯減少（t=14.24，P=0.004 9），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4e）。另外，Western blot檢測結(jié)果顯示，添加抑制劑組中成骨標(biāo)志物ALP、OCN、Runx2、COLI 蛋白水平也低于氯化鈷組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4f、4g）。

圖4 抑制EphB4 與EphrinB2 結(jié)合對氯化鈷低氧誘導(dǎo)下MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化影響Figure 4 Effects of restraining the combination of EphB4 and EphrinB2 under hypoxia caused by CoCl2on osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells

3 討 論

研究低氧環(huán)境下骨代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，對了解牙槽骨在機(jī)械應(yīng)力、炎癥刺激下維持骨穩(wěn)態(tài)平衡、進(jìn)行骨改建具有重要意義。目前研究表明低氧對骨代謝起到調(diào)節(jié)作用，參與骨穩(wěn)態(tài)的維持［10-12］。作為細(xì)胞處于低氧環(huán)境的標(biāo)志物，HIF-1α 在低氧環(huán)境下被激活，調(diào)節(jié)氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)。以往研究發(fā)現(xiàn)，低氧會誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）轉(zhuǎn)錄增加，刺激局部血管的形成，輸送營養(yǎng)物質(zhì)，從而增強(qiáng)骨生成［13-17］；同時(shí)低氧環(huán)境可通過HIF-1α-GRP78-Akt 信號通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的存活、增殖，從而抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡［18］；通過STAT3 信號促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)成骨［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞低氧環(huán)境下HIF-1α 表達(dá)升高，成骨標(biāo)志物（ALP、RUNX2、COL I、OCN）在mRNA 水平的表達(dá)升高，細(xì)胞成骨分化能力增強(qiáng)，與以往研究結(jié)果一致。但也有研究報(bào)道持續(xù)的缺氧會抑制成骨分化［20-21］。本研究結(jié)果顯示，48 h 的低氧誘導(dǎo)增強(qiáng)了MC3T3-E1 的成骨分化，提示低氧暴露時(shí)間可影響成骨細(xì)胞的分化，適宜的低氧暴露可以有效誘導(dǎo)前體細(xì)胞成骨分化。

破骨細(xì)胞表面的EphrinB2 與成骨細(xì)胞表面表達(dá)的EphB4 結(jié)合產(chǎn)生雙向信號傳遞，其中正向信號通過刺激EphB4 增強(qiáng)Rho 蛋白的活性可誘導(dǎo)成骨分化。在成骨細(xì)胞中，特異性抑制EphrinB2 和EphB4 磷酸化可明顯降低成骨細(xì)胞分化，表明成骨細(xì)胞譜系中EphrinB2/EphB4 相互作用在成骨細(xì)胞分化中起到關(guān)鍵作用［22］。研究報(bào)道，缺氧可上調(diào)小鼠皮膚中的Eph 受體和Ephrin 配體的表達(dá)［23］，也有研究顯示缺氧可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中EphrinB2表達(dá)［24］。然而有關(guān)成骨細(xì)胞分化過程中缺氧和EphrinB2/EphB4 之間的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，氯化鈷處理MC3T3-E1 細(xì)胞后，HIF-1α mRNA 和蛋白表達(dá)升高，缺氧誘導(dǎo)成功；MC3T3-E1細(xì)胞EphrinB2、EphB4 mRNA 和蛋白的表達(dá)上調(diào)，表明低氧可以促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞表達(dá)EphrinB2和EphB4。通過對低氧誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞使用EphB4 磷酸化抑制劑NVP-BHG712，阻止EphrinB2與EphB4 結(jié)合產(chǎn)生信號后，MC3T3-E1 的成骨標(biāo)志物表達(dá)明顯下降，對細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，ALP 染色及茜素紅染色結(jié)果進(jìn)一步表明細(xì)胞的成骨分化及礦化能力下降。實(shí)驗(yàn)初步證明低氧可以通過上調(diào)EphrinB2、EphB4 在MC3T3-E1 細(xì)胞表面的表達(dá)，調(diào)節(jié)其成骨分化能力。

低氧環(huán)境中，HIF-1α 被激活，成為90～100 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的缺氧反應(yīng)元件，促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是其中重要基因之一［7］，EPO 可通過與間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞的直接相互作用來刺激成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨［25-26］。EPO 可通過促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面EphB4 過表達(dá)，與EphrinB2 結(jié)合，驅(qū)動成骨細(xì)胞分化［27-28］。因此，推測低氧可能通過HIF-1α-EPO- EphrinB2/EphB4 對MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨分化做出調(diào)控。具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在氯化鈷誘導(dǎo)的體外細(xì)胞低氧環(huán)境，MC3T3-E1 的成骨分化增加，同時(shí)，細(xì)胞低氧環(huán)境上調(diào)了HIF-1α、EphrinB2、EphB4 的表達(dá)，而阻止EphrinB2 和EphB4 的結(jié)合后，細(xì)胞的成骨分化下降，表明缺氧和EphrinB2/EphB4 之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在促進(jìn)前體細(xì)胞成骨分化過程中具有重要作用。EphrinB2/EphB4 可在低氧環(huán)境下促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨分化，增加成骨標(biāo)志物的表達(dá)及基質(zhì)礦化，為低氧調(diào)控骨代謝機(jī)制的研究提供了新的參考依據(jù)。

【Author contributions】Liu ZS peformed the experiments, analyzed the data, and wrote the article.Wang YX revised the article.Li YM designed the study and guided the writing of the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.