鞘翅目昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白研究進(jìn)展

范廣文 桑育黎 石磊 辛躍強(qiáng) 闞佳格 郝延軍

摘? ? 要：嗅覺(jué)在昆蟲(chóng)行為反應(yīng)中具有重要作用，氣味結(jié)合蛋白是昆蟲(chóng)外周嗅覺(jué)系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的一類功能性蛋白。鞘翅目為昆蟲(chóng)綱中最豐富的類群，數(shù)目眾多、分布廣泛。雖然氣味結(jié)合蛋白研究起步較晚，但近年來(lái)國(guó)內(nèi)外發(fā)展尤為迅速，其主要聚焦于氣味結(jié)合蛋白與氣味分子相互作用研究方面?；诖耍疚木C述了鞘翅目昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白的種類、結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)分布、生理功能，以及研究方法，并指明了目前存在問(wèn)題和未來(lái)研究方向，以期為揭示昆蟲(chóng)-植物（氣味分子等）化學(xué)通訊機(jī)制和行為控制及開(kāi)辟新型害蟲(chóng)防控體系提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鞘翅目；氣味結(jié)合蛋白；生理功能；新技術(shù)

中圖分類號(hào)：Q966? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.05.010

Abstract： Olfaction plays an important role in the behavioral response of insects. Odorant binding proteins are a class of functional proteins which play a crucial role in the peripheral olfactory system of insects. Coleoptera are the most abundant group in the insecta class， which are numerous and widely distributed. Although the research on odorant binding proteins started relatively late， the research at home and abroad has developed particularly rapidly in recent years， and mainly focused on the interaction between odorant binding proteins and odor molecules. In this review， we summarized the species， structural characteristics， expression distribution， physiological functions and research methods of odorant binding proteins in Coleoptera， and pointed out current problems and future research directions， in order to provide a theoretical basis for exploring the chemical communication mechanism and behavior control between insects and plants （odor molecules， etc.） and developing new pest control systems.

Key words： Coleoptera; odorant binding proteins; physiological function; new technology

嗅覺(jué)作為昆蟲(chóng)與外界環(huán)境進(jìn)行信息交流主要方式之一，具有專一性、靈敏性等特點(diǎn)[1]，在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、發(fā)育、覓食、聚集、繁殖，以及躲避天敵威脅和外界環(huán)境不利傷害等行為反應(yīng)中起著至關(guān)重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，其外周嗅覺(jué)系統(tǒng)包含多種功能性蛋白，例如氣味結(jié)合蛋白（Odorant Binding Proteins，OBPs）[3]、化學(xué)感受蛋白（Chemosensory Proteins，CSPs）[4]、氣味受體（Odorant Receptors，ORs）[5]、離子受體（Ionotropic Receptors，IRs）[6]、感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白（Sensory Neuron Membrane Proteins，SNMPs）[6]和氣味降解酶（Odor Degrading Enzymes，ODEs）[7]等。氣味分子等化學(xué)信號(hào)通過(guò)嗅覺(jué)感受器進(jìn)入外周嗅覺(jué)系統(tǒng)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為電信號(hào)進(jìn)入腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行加工處理，指導(dǎo)昆蟲(chóng)進(jìn)行相應(yīng)的行為活動(dòng)[8]。其中，氣味分子與氣味結(jié)合蛋白特異性識(shí)別并結(jié)合既是昆蟲(chóng)嗅覺(jué)系統(tǒng)中氣味分子傳導(dǎo)過(guò)程的第一步，也是昆蟲(chóng)感受外界環(huán)境信息的關(guān)鍵。1981年Vogt等[9]利用同位素標(biāo)記法，首次在雄性多音天蠶Antheraea polyphemus觸角中發(fā)現(xiàn)信息素結(jié)合蛋白（Pheromone Binding Protein，PBP）以來(lái)，氣味結(jié)合蛋白一直是生物學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、分子生物學(xué)，以及生物信息學(xué)等一系列學(xué)科飛速進(jìn)步，昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白研究發(fā)展尤為迅速。

鞘翅目是昆蟲(chóng)綱中第一大目，下分為原鞘亞目、菌食亞目、肉食亞目、多食亞目四大亞目，現(xiàn)存已超過(guò)38萬(wàn)余種，約占全球動(dòng)物物種1/4[10]。大多數(shù)鞘翅目昆蟲(chóng)是農(nóng)業(yè)[11]、林業(yè)[12]、漁業(yè)[13]等方面世界性害蟲(chóng)，如天牛、金龜子、赤擬谷盜、米象等。由于其種類繁多、分布廣泛、食性復(fù)雜、繁殖迅速、適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)木材、中藥材、小麥、玉米及倉(cāng)儲(chǔ)物等危害嚴(yán)重，會(huì)造成巨大的生態(tài)破壞和經(jīng)濟(jì)損失[14]。因此，明確自然環(huán)境中氣味分子和昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白相互作用機(jī)制，有助于人們開(kāi)辟環(huán)境友好型害蟲(chóng)治理策略，進(jìn)而為其他害蟲(chóng)防治、資源可持續(xù)利用與發(fā)展，以及環(huán)境保護(hù)等方面提供理論指導(dǎo)和參考。本文對(duì)近年來(lái)鞘翅目昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白種類、結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)分布、生理功能，以及研究方法等方面進(jìn)行了總結(jié)和綜述。

1 OBPs種類

近年來(lái)，越來(lái)越多昆蟲(chóng)嗅覺(jué)感受器中氣味結(jié)合蛋白被陸續(xù)鑒定。研究表明，昆蟲(chóng)OBPs主要有兩大分類方式。一方面，根據(jù)OBPs氨基酸序列長(zhǎng)度，可將 OBPs 分為短鏈OBPs、中鏈OBPs、長(zhǎng)鏈OBPs 3類；另一方面，根據(jù)OBPs氨基酸序列中Cys數(shù)量及特點(diǎn)，通常分為5個(gè)亞型，包括Classic OBPs、Plus-C OBPs、Minus-C OBPs、Dimer OBPs、Atypical OBPs（表1）。在鱗翅目昆蟲(chóng)中，根據(jù)OBPs氨基酸序列同源性，通常將Classic OBPs分為3個(gè)亞家族，包括普通氣味結(jié)合蛋白（General Odorant Binding Proteins，GOBPs）、性信息素結(jié)合蛋白（Pheromone Binding Proteins，PBPs）、觸角結(jié)合蛋白（Antennal Binding Proteinx，ABPx）。其中，GOBPs又分為GOBPs Ⅰ和GOBPs Ⅱ[15]，ABPx又分為ABPx Ⅰ和ABPx Ⅱ[16]。但在鞘翅目昆蟲(chóng)中，由于Classic OBPs基因種類和基因資源相對(duì)匱乏，目前對(duì)Classical OBPs進(jìn)一步分類較為困難。

Duan J等[17]研究發(fā)現(xiàn)，白蠟窄吉丁Agrilus plani-pennis AplaGOBP56A氨基酸序列結(jié)構(gòu)屬于Minus-C OBPs，但卻被歸類為GOBPs亞家族。李廣偉等[18-19]研究亦發(fā)現(xiàn)，光肩星天牛Anoplophora glabripennis AglaOPB1屬于Minus-C OBPs；結(jié)合AglaOBP12在雌雄蟲(chóng)觸角中表達(dá)特征、進(jìn)化聚類關(guān)系，以及與氣味分子結(jié)合特性等，推測(cè)其屬于Classical OBPs中ABPx亞家族。

2 OBPs結(jié)構(gòu)特征

氣味結(jié)合蛋白是一類酸性、水溶性小分子球狀蛋白，主要存在于昆蟲(chóng)嗅覺(jué)感受器淋巴液[20]。其分子量為15～17 KDa，pH5.0左右，等電點(diǎn)大多在4～6之間。昆蟲(chóng)OBPs由120～150個(gè)氨基酸組成，N-末端具有一段約20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽[21]。其中，成熟蛋白第40～60位約有20個(gè)親脂性氨基酸，推測(cè)此種結(jié)構(gòu)可能與OBPs結(jié)合脂溶性氣味物質(zhì)有關(guān)[22]。不同于脊柱動(dòng)物鼻粘液OBPs β-筒狀結(jié)構(gòu)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋[23]。

經(jīng)典OBPs氨基酸序列包含6個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)，且第2和第3個(gè)Cys之間相隔3個(gè)氨基酸殘基，第5和第6個(gè)Cys之間相隔8個(gè)氨基酸殘基。其中，6個(gè)保守半胱氨酸相互交叉形成3對(duì)二硫鍵（Cys1-Cys3、Cys2-Cys5、Cys4-Cys6），對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)固作用[24]。二硫鍵的形成導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)靈活度下降，使其不易變性和退化。因此，無(wú)論是脊椎動(dòng)物還是昆蟲(chóng)，OBPs都具有較高的熱穩(wěn)定性。

非經(jīng)典OBPs氨基酸序列包含多于或少于6個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)。其中，Plus-C OBPs多于6個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)[25]；Minus-C OBPs少于6個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)[26]；Dimer OBPs具有12個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)，增大了蛋白與配體結(jié)合能力[27-28]（表1）。

3 OBPs表達(dá)分布

3.1 OBPs表達(dá)分布組織差異

起初研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)OBPs僅在觸角中特異性表達(dá)。后來(lái)大量數(shù)據(jù)表明，除觸角以外，昆蟲(chóng)OBPs在頭、胸、腹、足、翅、口器等多個(gè)部位中均可表達(dá)（表2）。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，不同種類OBPs表達(dá)分布量各異。Classic OBPs主要在觸角中表達(dá)，而Minus-C OBPs可在身體多個(gè)部位中表達(dá)。

Stefan Dippel等[34]發(fā)現(xiàn)，赤擬谷盜Tribolium cast-aneum 15種Classic OBPs（OBP0A、OBP4B、OBP4C、OBP4D、OBP4E、OBP4F、OBP6B、OBP6C、OBP6D、OBP6E、OBP6F、OBP6G、OBP7C、OBP8A、OBP8B）在觸角和口器中高度表達(dá)；3種Classic OBPs（OBP4J、OBP4A、OBP7D）僅在口器中富集；3種非群集性Classic OBPs（OBP5A、OBP6A、OBP7D）在所有組織中均勻表達(dá)。此外，Plus-C OBPs（OBP5E）在觸角和口器中均有分布，21種Minus-C OBPs在所有組織中均有表達(dá)。其中，OBP4G、OBP 4I、OBP 7E主要表達(dá)于頭部和腿部；OBP3A、OBP7B、OBP7G、OBP7H、OBP7I、OBP7J、OBP10A、OBP10B、OBP10C、OBP10D主要分布于身體內(nèi)部；OBP7L、OBP9C參與化學(xué)感覺(jué)過(guò)程；OBP7F、OBP7B主要參與昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育；但并未在所有組織中檢測(cè)出OBP2A。同樣，類似現(xiàn)象也存在于其他鞘翅目昆蟲(chóng)中，如暗黑鰓金龜Holotrichia parallela[35]和稻象蟲(chóng)Lissorhoptrus oryzophilus[36]。此外，利用原位雜交和免疫組織技術(shù)研究嗅覺(jué)感器OBPs表達(dá)分布特征，發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)OBPs在不同感器表達(dá)量也存在差異。如GOBPs主要在對(duì)植物揮發(fā)物或一般氣味敏感的錐型感器中表達(dá)[22]，而PBP主要在對(duì)信息素敏感的長(zhǎng)毛型感器中表達(dá)[37]。

3.2 OBPs表達(dá)分布年齡差異

張穎[52]利用蛋白印跡分析，發(fā)現(xiàn)SzeaOBP1在低齡幼蟲(chóng)、晚齡幼蟲(chóng)、蛹和初羽化成蟲(chóng)階段表達(dá)量高于成蟲(chóng)階段，而SzeaOBP28表達(dá)量在初羽化成蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)階段、蛹和雌成蟲(chóng)階段、低齡幼蟲(chóng)和晚齡幼蟲(chóng)階段逐級(jí)遞減。

3.3 OBPs表達(dá)分布性別差異

王宏民等[53]研究發(fā)現(xiàn)，綠豆象Callosobruchus chinensis 6個(gè)OBPs在成蟲(chóng)觸角、頭（不含觸角）、腹、足、翅部等均表達(dá)，但表達(dá)量各異。其中，CchiOBP5在綠豆象雌成蟲(chóng)觸角和頭部（不含觸角）中呈現(xiàn)高表達(dá)，表達(dá)量顯著高于腹、足、翅部。與雌成蟲(chóng)恰恰相反，CchiOBP5在綠豆象雄成蟲(chóng)足部中呈現(xiàn)高表達(dá)；在頭部（不含觸角）中表達(dá)量次之；在觸角中表達(dá)量最低。劉盼靜等[54]研究亦發(fā)現(xiàn)，綠芫菁Lytta caraganae 22個(gè)OBPs在成蟲(chóng)觸角中表達(dá)情況呈現(xiàn)性別偏向性，LcarOBP9在雄成蟲(chóng)觸角表達(dá)量比雌成蟲(chóng)觸角表達(dá)量高出約8倍。

3.4 OBPs表達(dá)分布種屬差異

OBPs在同科不同屬昆蟲(chóng)中豐富度也存在顯著差異。如在鞘翅目天牛科昆蟲(chóng)中，滅字脊虎天牛觸角中鑒定出24種OBPs[55]、光肩星天牛觸角中鑒定出42種OBPs[43]、星天牛觸角中鑒定出46種OBPs[44]，且主要表現(xiàn)為Minus-C OBPs基因數(shù)量差異性。

4 OBPs生理功能

4.1 感覺(jué)性行為調(diào)控

氣味結(jié)合蛋白在昆蟲(chóng)識(shí)別外界氣味分子過(guò)程中起著重要作用。一般認(rèn)為，氣味結(jié)合蛋白生理功能為選擇性結(jié)合氣味分子、轉(zhuǎn)運(yùn)并保護(hù)氣味分子、降解與清除有害物質(zhì)，以及保護(hù)觸角化學(xué)感器等[56]。目前，OBPs參與昆蟲(chóng)生理活動(dòng)和行為反應(yīng)過(guò)程具體機(jī)制尚不明確，主要存在3種假說(shuō)：一是氣味結(jié)合蛋白與氣味分子結(jié)合形成復(fù)合體，以復(fù)合體形式同受體結(jié)合[57]；二是氣味結(jié)合蛋白先與氣味分子結(jié)合形成復(fù)合體，通過(guò)淋巴液后解離[58]；三是氣味結(jié)合蛋白與氣味分子結(jié)合形成復(fù)合體，通過(guò)淋巴液并與受體跨膜蛋白結(jié)合后解離[59]。無(wú)論哪一種機(jī)制都認(rèn)為，氣味結(jié)合蛋白與氣味分子特異性結(jié)合增強(qiáng)了脂溶性物質(zhì)的水溶性，通過(guò)感器淋巴液到達(dá)神經(jīng)樹(shù)突膜受體，產(chǎn)生刺激，最終氣味降解酶將氣味分子降解，避免持續(xù)興奮，達(dá)到保護(hù)作用。近年來(lái)，大量試驗(yàn)表明，昆蟲(chóng)某些OBPs表達(dá)分布于全身多個(gè)組織，推測(cè)其具有其他非感覺(jué)性功能。因此，除了上述主要作用外，還存在著一些潛在的生理功能。

4.2 生長(zhǎng)發(fā)育行為調(diào)制

Stefan Dippel等[34]研究赤擬谷盜Tribolium castan-eum氣味結(jié)合蛋白組織特異性表達(dá)分布，發(fā)現(xiàn)TcOBP7F在變態(tài)過(guò)程中表達(dá)，而TcOBP7B主要在胚胎形成和變態(tài)過(guò)程中呈現(xiàn)高度活性，推測(cè)其可能與赤擬谷盜生長(zhǎng)發(fā)育行為有關(guān)。

4.3 防御行為調(diào)制

Zhang等[60]研究北艾揮發(fā)油對(duì)赤擬谷盜Tribolium castaneum殺蟲(chóng)活性，發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜幼蟲(chóng)OBP等蛋白表達(dá)量顯著升高，當(dāng)使用RNAi抑制TcOBP11表達(dá)后，致死量顯著增加，推測(cè)TcOBP11與赤擬谷盜防御行為有關(guān)。

4.4 繁殖行為調(diào)制

渠成[41]研究異色瓢蟲(chóng)Harmonia axyridis嗅覺(jué)相關(guān)蛋白功能，發(fā)現(xiàn)HaxyOBP4和HaxyOBP9在雄蟲(chóng)觸角表達(dá)量顯著高于雌蟲(chóng)觸角，推測(cè)可能與雄蟲(chóng)尋找配偶有關(guān)；HaxyOBP6、HaxyOBP10、HaxyOBP19在雌蟲(chóng)觸角表達(dá)量高于雄蟲(chóng)觸角，推測(cè)可能與雌蟲(chóng)尋找合適的產(chǎn)卵場(chǎng)所有關(guān)。

4.5 覓食行為調(diào)制

Zhang等[61]研究玉米象鼻蟲(chóng)Sitapholus zeamais 2種OBPs表達(dá)特征和生理功能，發(fā)現(xiàn)SzeaOBP1可能參與低齡幼蟲(chóng)覓食行為，SzeaOBP28可能參與低齡幼蟲(chóng)和雄性成蟲(chóng)相關(guān)生命活動(dòng)，包括覓食和交配行為。

4.6 寄主選擇行為調(diào)制

Zhang等[62]研究松墨天牛Monochamus alternatus宿主定位行為分子基礎(chǔ)，利用熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MaltOBP1與宿主植物主要活性成分（+）-α-蒎烯、β-蒎烯、β-石竹烯、（+）-檸檬烯和馬鞭草烯酮呈現(xiàn)高度親和性，推測(cè)其在松墨天牛寄主選擇行為中發(fā)揮重要作用。

4.7 解毒代謝行為調(diào)制

Gao等[63]研究發(fā)現(xiàn)，北艾揮發(fā)油主要活性成分丁香酚顯著誘導(dǎo)赤擬谷盜Tribolium castaneum TcOBPC12表達(dá)，使用RNA干擾后，末齡幼蟲(chóng)死亡率升高，推測(cè)TcOBPC12參與丁香酚防御行為調(diào)制。組織表達(dá)譜表明，TcOBPC12在幼蟲(chóng)表皮、血淋巴和腸中呈現(xiàn)高度表達(dá)，在成蟲(chóng)表皮、頭部和脂肪體中呈現(xiàn)高度表達(dá)。發(fā)育表達(dá)譜表明，TcOBPC12在卵后期、幼蟲(chóng)前期、幼蟲(chóng)后期及成蟲(chóng)后期表達(dá)量高于其他發(fā)育階段?；谝陨显囼?yàn)數(shù)據(jù)，推測(cè)TcOBPC12與幼蟲(chóng)吸收降解外源性有毒物質(zhì)有關(guān)。

5 OBPs研究方法

5.1 OBPs獲取方法

對(duì)于昆蟲(chóng)OBPs獲取方法，經(jīng)典研究方法往往直接從昆蟲(chóng)觸角中分離、純化氣味結(jié)合蛋白，進(jìn)而通過(guò)X射線衍射法[64]和核磁共振法[65]研究其結(jié)構(gòu)特征和生理功能。由于大多數(shù)鞘翅目昆蟲(chóng)觸角較小、分離純化過(guò)程繁雜，目前常采用基因克隆、體外表達(dá)方式，即首先構(gòu)建基因序列，利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆獲得目的基因，其次在細(xì)胞（真核或原核）中誘導(dǎo)表達(dá)，最后利用親和層析法等純化獲得重組蛋白。目前，蛋白體外表達(dá)系統(tǒng)主要包括原核（大腸桿菌）表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)等[66]（表3）。其中，相比于其他3類，采用原核細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)更為常見(jiàn)。如張穎[52]通過(guò)原核細(xì)胞表達(dá)獲得SzeaOBP1與SzeaOBP40。王超群等[67]亦通過(guò)RT-PCR克隆AcorOBP11，將目的基因連入原核表達(dá)系統(tǒng)pET28a、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），利用IPTG誘導(dǎo)AcorOBP11重組蛋白表達(dá)；超聲破碎菌體后取上清液過(guò)鎳柱，利用重組腸激酶切除His標(biāo)簽并再次過(guò)鎳柱獲得純化產(chǎn)物，為后續(xù)蛋白與配體相互作用研究奠定基礎(chǔ)。

5.2 OBPs生理功能研究方法

對(duì)于昆蟲(chóng)OBPs與配體（氣味分子等）互作研究，以往主要采用同位素標(biāo)記氣味物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，確定其與氣味分子結(jié)合特性。目前，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科發(fā)展，昆蟲(chóng)OBPs結(jié)合特性研究方法主要包括同源建模[68]、分子對(duì)接[68]、熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合[69]、RNA干擾[70]、免疫熒光定位[71]、蛋白點(diǎn)突變[72]、熒光淬滅[73]等。

5.2.1 同源建模 同源建模即利用序列相似則結(jié)構(gòu)相似原理，當(dāng)兩者（未知蛋白與已知蛋白）序列同源性大于30%時(shí)，往往具有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過(guò)未知蛋白和模板（已知蛋白結(jié)構(gòu)）比對(duì)、構(gòu)建目標(biāo)蛋白主鏈結(jié)構(gòu)模型、構(gòu)建目標(biāo)蛋白側(cè)鏈模型及優(yōu)化目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)等步驟實(shí)現(xiàn)建模。

5.2.2 分子對(duì)接 分子對(duì)接即通過(guò)Dock、AutoDock或FlexX等網(wǎng)絡(luò)軟件進(jìn)行配體（氣味分子）與蛋白三維結(jié)構(gòu)剛性、半柔性或柔性匹配對(duì)接，不斷優(yōu)化配體（氣味分子）位置，尋找最佳構(gòu)象并預(yù)測(cè)蛋白活性位點(diǎn)及與配體相互作用方式。

5.2.3 熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合利用氣味分子和熒光探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合OBPs原理，即氣味分子與OBPs結(jié)合能力越強(qiáng)，熒光強(qiáng)度值下調(diào)越大，并通過(guò)計(jì)算氣味分子和OBPs解離常數(shù)Ki（，其中[IC50]為OBPs與1-NPN復(fù)合物熒光強(qiáng)度降低50%時(shí)氣味分子濃度；[1-NPN]為游離1-NPN濃度；K1-NPN為OBPs與1-NPN復(fù)合體解離常數(shù)），確定OBPs與氣味分子結(jié)合情況，進(jìn)而推測(cè)其潛在的生理功能。解離常數(shù)Ki越小，OBPs與氣味分子結(jié)合能力越強(qiáng)。一般認(rèn)為，當(dāng)0 μmol·L-1 50 μmol·L-1時(shí)，OBPs與氣味分子無(wú)結(jié)合能力。

目前，常用型探針為1-氨基蒽（1-AMA）[74]、N-苯基-1-萘胺（1-NPN）[75]、8-苯胺-1-萘磺酸（1， 8-ANS）[76]。其中，N-苯基-1-萘胺（NPN）應(yīng)用更為廣泛。由于熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合具有操作簡(jiǎn)便、安全性高、價(jià)格低等特點(diǎn)，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于分析OBPs與目標(biāo)配體結(jié)合能力。同時(shí)，熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合也存在一些不足，如探針專屬性不強(qiáng)、OBPs與探針結(jié)合后，目的蛋白空間結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生改變等。但處于種種考慮，該方法仍普遍應(yīng)用于研究OBPs生理功能。

5.2.4 RNA干擾 RNA干擾（RNAi），即雙鏈RNA（dsDNA）誘發(fā)生物體內(nèi)同源mRNA高效降解，可導(dǎo)致昆蟲(chóng)特異性O(shè)BPs（靶基因）轉(zhuǎn)錄后沉默，廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)抗藥性防御機(jī)制研究[77]。目前，人們常常聯(lián)合行為學(xué)試驗(yàn)，如嗅覺(jué)行為檢測(cè)和觸角電位技術(shù)（EAG）等，驗(yàn)證RNA干擾對(duì)OBPs與宿主揮發(fā)物（信息素）互作效果，進(jìn)一步推測(cè)其生理功能[78]。

5.2.5 蛋白點(diǎn)突變 蛋白點(diǎn)突變即利用PCR等手段改變目的基因DNA片段，如堿基缺失、添加、突變等，包括定點(diǎn)突變和非定點(diǎn)突變，主要應(yīng)用于研究蛋白3D結(jié)構(gòu)、預(yù)測(cè)大分子與小分子相互作用結(jié)構(gòu)位點(diǎn)、提高蛋白穩(wěn)定性和活性及研發(fā)藥物等方面。

一般基因突變具有隨機(jī)性、不定向性、突變頻率低等特點(diǎn)。然而，相對(duì)于隨機(jī)突變，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)可按既定計(jì)劃改造目的基因，獲得相應(yīng)的氨基酸序列或特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高選擇性和可控性。因此，定點(diǎn)突變技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要方法。

定點(diǎn)突變技術(shù)主要包括寡核苷酸介導(dǎo)定點(diǎn)突變、盒式定點(diǎn)突變、PCR介導(dǎo)定點(diǎn)突變[79]。其中，PCR定點(diǎn)突變技術(shù)最為常用，包括重疊延伸PCR、大引物PCR等[80]。通過(guò)設(shè)計(jì)并引入非特異性（錯(cuò)配）堿基引物，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。PCR定點(diǎn)突變技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：操作快捷、簡(jiǎn)便，突變體回收率高，任何位點(diǎn)均可引入突變。

5.2.6 應(yīng)用 綜上所述，同源建模、分子對(duì)接、RNA干擾和熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合更廣泛應(yīng)用于研究鞘翅目昆蟲(chóng)OBPs與目標(biāo)分子結(jié)合機(jī)制。Li等[81]通過(guò)同源建模、分子對(duì)接和熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)研究花絨堅(jiān)甲蟲(chóng)Dastarcus helophoroides DhelOBP21與配體結(jié)合機(jī)制，發(fā)現(xiàn)疏水作用和氫鍵作用在OBPs與配體結(jié)合中發(fā)揮著重要作用。其中，疏水相互作用比氫鍵相互作用更重要。Binu Antony等[82]發(fā)現(xiàn)，棕櫚象鼻蟲(chóng)Rhynchophorus phoenicis RferOBP1768主要負(fù)責(zé)結(jié)合信息素（4-甲基-5-壬醇），并轉(zhuǎn)運(yùn)至氣味受體。當(dāng)采用RNA干擾RferOBP1768后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其沉默顯著影響了信息素通信作用。Zhou等[69]亦基于同源建模、分子對(duì)接和熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TrufOBP4與宿主植物揮發(fā)物質(zhì)對(duì)甲氧基肉桂酸辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、肉豆蔻酸和棕櫚酸具有較高的結(jié)合能力。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

6.1 目前存在問(wèn)題

研究表明，各類技術(shù)在OBPs研究中建樹(shù)顯著，尤其是分析其潛在功能。其中，同源建模、分子對(duì)接和熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合聯(lián)用極為廣泛。因此，人們應(yīng)該充分利用各類技術(shù)優(yōu)勢(shì)，如李秋玲[83]研究班氏跳小蜂Aenasius bambawalei氣味結(jié)合蛋白OBPs結(jié)合特性，利用同源建模、分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)OBPs三維結(jié)構(gòu)；利用熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合篩選高結(jié)合性化合物；利用熒光淬滅探究OBPs與配體互作方式、RNA干擾（RNAi）探究OBPs功能；利用圓二色譜分析OBPs與配體互作構(gòu)象變化。根據(jù)上述結(jié)論，推測(cè)OBPs與氣味分子作用機(jī)制并初步篩選活性物質(zhì)。目前，新技術(shù)仍是解析OBPs三維結(jié)構(gòu)和推測(cè)OBPs生理功能的主要手段。由于種種原因，點(diǎn)飽和突變技術(shù)、CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)、多光譜技術(shù)等新型技術(shù)仍未全面應(yīng)用于闡釋OBPs結(jié)構(gòu)和功能。因此，新興技術(shù)應(yīng)用定將成為研究OBPs重要方向。相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，新技術(shù)還會(huì)有更大的改進(jìn)和發(fā)展，相互取長(zhǎng)補(bǔ)短，為更多人熟悉應(yīng)用。

鞘翅目昆蟲(chóng)OBPs研究起步較晚。以赤擬谷盜Tribolium castaneum為例，赤擬谷盜為鞘翅目擬步甲科擬步甲屬昆蟲(chóng)，廣泛分布于我國(guó)熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)[84]。作為鞘翅目中一類經(jīng)典模式昆蟲(chóng)，主要用于研究害蟲(chóng)防治和人類疾病治療[85-86]。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)聽(tīng)覺(jué)和視覺(jué)相對(duì)退化、嗅覺(jué)系統(tǒng)高度發(fā)達(dá)[87]。但至今為止，相對(duì)于其他模式昆蟲(chóng)，如果蠅、家蠶、蜜蜂等，赤擬谷盜OBPs三維結(jié)構(gòu)未有解析、OBPs組織分布特異性、不同年齡、性別表達(dá)差異，以及非感性功能等方面尚未明確。因此，相比于哺乳動(dòng)物和以鱗翅目為代表的其他類昆蟲(chóng)OBPs研究成果，鞘翅目昆蟲(chóng)OBPs種類、結(jié)構(gòu)特征及表達(dá)分布特異性等方面研究有待進(jìn)一步發(fā)展壯大，這或許可為揭示昆蟲(chóng)進(jìn)化規(guī)律提供一定的幫助。另外，其他研究發(fā)現(xiàn)，OBPs具有多種多樣生理功能。如在昆蟲(chóng)綱中，SiOBP6參與雙翅目舌蠅Glossina spp.發(fā)育過(guò)程中造血系統(tǒng)調(diào)制[88]，AfasOBP11參與半翅目三點(diǎn)盲蝽Adelphocoris fasciaticollis味覺(jué)感知活動(dòng)[89]，AccOBP10參與膜翅目中華蜜蜂Apis cerana脅迫條件反應(yīng)[90]。拓展到哺乳動(dòng)物，OBPs可能表現(xiàn)為先天免疫體液成分，對(duì)致病細(xì)菌和真菌具有一定的活性，甚至有望成為抗生素治療替代劑或輔助劑[91]。借鑒上述結(jié)論與技術(shù)，在未來(lái)工作中，鞘翅目昆蟲(chóng)OBPs 3D結(jié)構(gòu)解析和生理功能等方面研究值得學(xué)界全面探索。與此同時(shí)，OBPs之間相互拮抗或協(xié)同作用關(guān)系以及是否以多聚體形式參與氣味分子結(jié)合亦值得進(jìn)一步研究。

6.2 未來(lái)研究方向

6.2.1 植物源殺蟲(chóng)劑研發(fā) 目前，對(duì)于害蟲(chóng)防治方法主要采用化學(xué)防治。此種方法存在較大弊端，不僅極易使昆蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性，而且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞，難以取得良好的防治效果[92]，甚至危害人體健康。因此，開(kāi)辟一類新型高效環(huán)保的防治措施迫在眉睫。許多研究發(fā)現(xiàn)，天然植物提取物（如揮發(fā)油）等可通過(guò)昆蟲(chóng)外周嗅覺(jué)系統(tǒng)，對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育、覓食、防御、交配、繁殖、信息交流等行為反應(yīng)產(chǎn)生影響，進(jìn)而形成驅(qū)避[93]、觸殺[94]及熏蒸[95]等作用。我國(guó)植物資源豐富，許多種類植物具有良好的驅(qū)蟲(chóng)、殺蟲(chóng)活性，如楝科、菊科、茄科等。此外，植物精油作為一類新型植物源殺蟲(chóng)劑，具有選擇性高、毒性低、揮發(fā)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中前景廣闊。但近幾年研究發(fā)現(xiàn)，鞘翅目昆蟲(chóng)OBPs可能參與防御及解毒代謝行為調(diào)制，從而抵御外界有害因素脅迫，產(chǎn)生抗藥性，使昆蟲(chóng)存活率上升，但具體作用機(jī)制尚不明確。因此，昆蟲(chóng)OBPs與配體結(jié)合特性及作用機(jī)制仍具有較大研究?jī)r(jià)值，更好地揭示昆蟲(chóng)與外界環(huán)境中氣味分子間化學(xué)通訊機(jī)理，進(jìn)而為篩選修飾并改造植物揮發(fā)油高活性成分、改進(jìn)單體化合物配伍殺蟲(chóng)方式、增強(qiáng)植物源殺蟲(chóng)劑殺蟲(chóng)活性等方面提供理論基礎(chǔ)。

6.2.2 揮發(fā)性物質(zhì)監(jiān)測(cè) 此外，OBPs作為載體蛋白，識(shí)別并運(yùn)輸脂溶性氣味分子，且熱穩(wěn)定性較高，或許可用于揮發(fā)性物質(zhì)接收和檢測(cè)工作。若實(shí)現(xiàn)此功效，其可在醫(yī)藥、環(huán)境、食品等生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮巨大價(jià)值。

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資金項(xiàng)目：2021年遼寧省普通高等教育本科教學(xué)改革研究?jī)?yōu)質(zhì)教學(xué)資源建設(shè)與共享項(xiàng)目；2021年教育部產(chǎn)學(xué)合作項(xiàng)目（202102653013）；遼寧大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目（202210140003）

作者簡(jiǎn)介：范廣文（2002—），男，遼寧蓋州人，主要從事天然藥物化學(xué)研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：桑育黎（1973—），女，山東萊州人，教授，博士，主要從事中藥質(zhì)量控制及植物源殺蟲(chóng)劑開(kāi)發(fā)與利用研究；

郝延軍（1973—），男，遼寧海城人，主任藥師，博士，主要從事天然產(chǎn)物分離與活性研究。