宋心怡，厲安洋，李艷梅，徐淑慧，夏乾峰，

（1.海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與全健康國(guó)際學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)院，海南 海口 571199）

類鼻疽伯克霍爾德菌（burkholderia pseudomallei，B.pseudomallei）是一種兼性的細(xì)胞內(nèi)革蘭氏陰性桿菌，是類鼻疽（Melioidosis）的病原體［1］。B.pseudomallei多流行于熱帶，亞熱帶地區(qū)，特別是東南亞和北澳大利亞多見(jiàn)，我國(guó)的疫源地為海南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地，以海南省的發(fā)病率最高［2］。主要通過(guò)受污染的水源和土壤以及破損的皮膚入侵人體，病例以肺部感染和敗血癥為主，是本地居民或外來(lái)旅游人群感染的主要風(fēng)險(xiǎn)，未經(jīng)治療的類鼻疽患者致死率可高達(dá)40%［3，4］。目前類鼻疽伯克霍爾德菌致病機(jī)理和宿主的免疫保護(hù)機(jī)制尚不完全清楚，且無(wú)有效疫苗［5］。

細(xì)菌小RNA（sRNA）是一類具有重要調(diào)控功能的非編碼RNA，一般長(zhǎng)度在50～500 nt 之間，不編碼蛋白，通過(guò)與靶標(biāo)基因 mRNA 堿基互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄水平影響對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，與細(xì)菌的生長(zhǎng)、代謝、應(yīng)激反應(yīng)和致病性等密切相關(guān)［6］。在前期工作中，課題組表達(dá)出促進(jìn)sRNA 表達(dá)的分子伴侶蛋白Hfq，通過(guò)Hfq 蛋白為基礎(chǔ)的免疫共沉淀技術(shù)和RNA-seq 測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)并鑒定了9 種新的類鼻疽伯克霍爾德菌sRNA［7］。本研究選定了其中一種sRNA，位于HNBP001 的2 號(hào)染色體上sRNA 基因片段（Sequence ID：CP038806.1，556 924 bp～557 397 bp），暫將其命名為sRNA9，通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)該sRNA 在B.pseudomallei致病過(guò)程中的重要生物學(xué)功能和作用機(jī)制進(jìn)行初步探索，為抗B.pseudomallei感染提供新的分子靶標(biāo)，同時(shí)也對(duì)類鼻疽的防治和診斷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞 類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 來(lái)源于課題組分離保存菌株［8］、質(zhì)粒TPR-pK18mobSacB 由課題組改造增加甲氧芐啶抗性片段，本實(shí)驗(yàn)室保存［9］、大腸桿菌S17-λpair 感受態(tài)細(xì)胞、DH5ɑ 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒，天根；限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、XbalⅠ、HindⅢ）和T4DNA 連接酶（Biolabs 公司）；甲氧芐啶、慶大霉素、卡那霉素，Biosharp；普通PCR 儀，Biorad；多功能酶標(biāo)儀，Bioteck；凝膠成像分析系統(tǒng)，君意。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10 g、酵母5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉16 g；15%蔗糖固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10 g、酵母5 g、蔗糖150 g、瓊脂粉16 g。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室上傳至NCBI 中類鼻疽伯克霍爾德菌HNBP001 的基因序列，針對(duì)編碼sRNA9 的上下游同源臂序列設(shè)計(jì)引物：9sF/9sR、9xF/9xR（圖A），用于擴(kuò)增目的sRNA 的同源臂，R1/F1 引物用來(lái)驗(yàn)證基因敲除株。所有引物均由生工生物工程公司合成，引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列Tab 1 PCR primer sequence

1.2.2 載體構(gòu)建 提取HNBP001 的基因組，使用引物9sF/9sR、9xF/9xR 分別進(jìn)行上、下游同源臂PCR 擴(kuò)增，酶切后連接。以質(zhì)粒TPR-pK18mob-SacB 為模板，使用HindⅢ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，純化，酶切體系見(jiàn)表2。使用T4 連接酶對(duì)上、下游同源臂與質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物于16 ℃連接數(shù)小時(shí)。將連接后產(chǎn)物加入DH5ɑ 感受態(tài)細(xì)胞，按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化，涂布含抗生素的平板。培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落于含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜后使用Plasmid min kit 試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，隨后將質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

表2 酶切體系Tab 2 System of enzyme digestion

1.2.3 ΔsRNA9 敲除株的構(gòu)建與鑒定 取適量酶切驗(yàn)證后的質(zhì)粒稀釋，轉(zhuǎn)化S17-1 感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，涂布抗生素LB 固體平板，培養(yǎng)12 h。挑取平板上的單菌落于含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，同時(shí)挑取HNBP001 的單菌落于無(wú)抗LB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化后S17-1 和HNBP001 菌液各取1 mL，離心取上清，取500 μL 培養(yǎng)基重懸沉淀物，取重懸后的菌液混勻滴加于濾膜上，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。吸取適量LB 液體培養(yǎng)基清洗菌體，稀釋不同濃度梯度（10-1、10-2）后涂布含抗生素的平板，培養(yǎng)36～48 h。挑取抗生素LB 固體平板上單菌落于含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜。提取菌液基因組，PCR 驗(yàn)證，獲得結(jié)合成功的菌液。將結(jié)合成功的菌液取50 μL 加入無(wú)抗LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液稀釋涂布于LB 固體篩選培養(yǎng)基。挑取平板上單菌落，以引物R1/F1 驗(yàn)證HNBP001 是否敲除成功，HNBP001 作為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增純化后送測(cè)序，比對(duì)測(cè)序序列，將敲除成功的菌株暫命名為sRNA9。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 提前一晚挑取野生株HNBP001 和敲除株sRNA9 的單菌落加入新鮮LB 培養(yǎng)基中，將細(xì)菌培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌液稀釋至OD600=0.1，按照200 μL/孔的液體量加入96 孔板，每個(gè)樣本設(shè)置5 個(gè)重復(fù)，使用多功能酶標(biāo)儀程序設(shè)置為37°C、雙軌道震蕩、間隔時(shí)間2 h，連續(xù)檢測(cè)72 h 在OD600的吸光度，保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，使用GraphPad 8.0.2 軟件繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 細(xì)菌的泳動(dòng)性實(shí)驗(yàn) 配置3%的LB 軟瓊脂培養(yǎng)基，提前一晚準(zhǔn)備好新鮮野生株HNBP001 和敲除株sRNA9 單菌落平板，挑取單菌落在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。將菌液稀釋至OD600=0.1，吸取2.5 μL 稀釋后菌液懸空滴至3%LB 軟瓊脂培養(yǎng)基，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，晾干10～15 min，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測(cè)量細(xì)菌抑菌圈的直徑。

1.2.6 生物被膜實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌培養(yǎng)方法同前，將野生株HNBP001、敲除株sRNA9 的菌液濃度調(diào)整至OD600=0.1，取5 mL 玻璃試管分別加入3 mL 稀釋后的HNBP001、sRNA9 菌液，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，將玻璃試管放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察到明顯區(qū)別。移液器吸出玻璃管中菌液，1 × PBS 清洗殘余雜質(zhì)，加入4 mL 1%的結(jié)晶紫染色30 min。吸出結(jié)晶紫溶液，1 × PBS 再次清洗試管，加入3 mL 30% 乙酸反應(yīng)20 min，測(cè)OD595吸光度值。

1.2.7 藥敏實(shí)驗(yàn) 使用珠海迪爾非發(fā)酵菌/氧化酶陽(yáng)性革蘭氏陰性桿菌鑒定藥敏試劑板，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。提前準(zhǔn)備好新鮮單菌落平板，挑取適宜大小單菌落加入稀釋液瓶?jī)?nèi)研磨混勻制備成細(xì)菌懸液，吸取細(xì)菌懸液50 μL，加入M-H 肉湯培養(yǎng)基，混勻后加入抗菌藥物孔中，100 μL/孔，18 h 后判讀抗菌藥物MIC 測(cè)定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad 8.0.2 軟件進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)對(duì)配對(duì)樣本進(jìn)行差異性分析，運(yùn)用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對(duì)非配對(duì)樣本進(jìn)行差異性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除株ΔsRNA9 的構(gòu)建及驗(yàn)證

2.1.1 目的基因上下臂PCR 擴(kuò)增結(jié)果 以HNBP001 的DNA 為模板，使用引物9sF/R、9xF/R 分別PCR 擴(kuò)增上下臂片段，得到682 bp，793 bp 長(zhǎng)度條帶，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 目的基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig 1 PCR amplification results of the up and down stream sequences of the target gene

2.1.2 重組載體TPR-pK18mobSacB-sRNA9 的酶切驗(yàn)證 將sRNA9 上、下臂片段連接到質(zhì)粒TPR-pK18mobSacB 上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5ɑ，涂布至含甲氧芐啶的平板，挑取單菌落提取質(zhì)粒后用HindⅢ、BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 重組載體TPR-pK18mobSacB-sRNA9 的雙酶切驗(yàn)證Fig 2 Verification of recombinant plasmid TPR-pK18mobSacB-sRNA9 by double enzyme digestion

2.1.3 類鼻疽伯克霍爾德菌sRNA9 敲除株的驗(yàn)證 將 構(gòu) 建 好 的 重 組 質(zhì) 粒TPR-pK18mobSacB-sRNA9 轉(zhuǎn)化S17-1 感受態(tài)細(xì)胞，與HNBP001 進(jìn)行雙交換，通過(guò)甲氧芐啶和慶大霉素雙抗板和15%蔗糖板進(jìn)行篩選，若雙抗板不生長(zhǎng)，15%蔗糖板生長(zhǎng)，則挑取單菌落PCR 驗(yàn)證，得到類鼻疽伯克霍爾德菌sRNA9 敲除株，并提取基因組送往測(cè)序公司進(jìn)一步驗(yàn)證。野生株HNBP001 和敲除株△sRNA9 使用驗(yàn)證引物R1/F1 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，HNBP001 包含sRNA9敲除目的片段，擴(kuò)增大小為2 227 bp，△sRNA9不含sRNA9敲除目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 753 bp，凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，敲除株構(gòu)建成功。

圖3 sRNA9 敲除株驗(yàn)證Fig 3 Validation of gene sRNA9 knock-out mutant

2.2 生長(zhǎng)曲線

提前準(zhǔn)備好單菌落平板，挑取單菌落過(guò)夜培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，將菌液稀釋至OD600=0.1，多功能酶標(biāo)儀的程序設(shè)置為每間隔4 h 測(cè)定OD600吸光度。生長(zhǎng)曲線在不同時(shí)間段重復(fù)3 次，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)樣本。以HNBP001 菌株作為對(duì)照，繪制生長(zhǎng)曲線圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。野生株HNBP001 和敲除株△sRNA9 均在8 h 進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后敲除株△sRNA9 生長(zhǎng)速率顯著低于野生株HNBP001。結(jié)果表明，敲除sRNA9 片段會(huì)影響B(tài).pseudomallei在LB 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。

圖4 類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 生長(zhǎng)曲線Fig 4 Growth curve of B.pseudomallei HNBP001 WT and△sRNA9

2.3 細(xì)菌的泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)

在類鼻疽伯克霍爾德菌獲取營(yíng)養(yǎng)和侵襲宿主細(xì)胞時(shí)，其泳動(dòng)能力起重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察細(xì)菌在3%的軟瓊脂培養(yǎng)基的泳動(dòng)環(huán)直徑大小來(lái)判斷敲除sRNA9 基因后的泳動(dòng)能力。以野生株HNBP001 作為參照對(duì)象，發(fā)現(xiàn)△sRNA9 泳動(dòng)環(huán)直徑減小，表明sRNA9 基因敲除后泳動(dòng)能力減弱，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 泳動(dòng)性Fig 5 Mobility of B.pseudomallei HNBP001 WT and △sRNA9

2.4 生物被膜形成實(shí)驗(yàn)

生物被膜的形成對(duì)細(xì)菌起著重要的自我防護(hù)作用，保護(hù)細(xì)菌抵御極端的外界環(huán)境。將類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 菌液加入試管中培養(yǎng)48 h，觀察其生物被膜厚度，經(jīng)過(guò)PBS 洗滌、結(jié)晶紫染色、乙酸溶解等步驟，吸取200 μL 液體加入96 孔板進(jìn)行OD595 吸光度檢測(cè)，得到生物被膜結(jié)果。肉眼觀察，敲除株△sRNA9 相較于野生株HNBP001 生物被膜更為稀疏。染色后檢測(cè)OD595吸光度，敲除株△sRNA9 顯著低于野生株HNBP001，結(jié)果見(jiàn)圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除sRNA9 影響其生物被膜的形成。

圖6 類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 生物被膜形成實(shí)驗(yàn)Fig 6 Biofilm of B.pseudomallei HNBP001 WT and △sRNA9

2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

通過(guò)抗菌藥物MIC 測(cè)定實(shí)驗(yàn)分析野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 對(duì)20 種抗生素的敏感程度，△sRNA9 對(duì)所有抗生素MIC 無(wú)變化，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲除sRNA9 對(duì)B.pseudomallei的耐藥性無(wú)明顯改變。

表3 野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 的MIC 值Tab 3 MIC of B.pseudomallei HNBP001 WT and △sRNA9

3 討論

細(xì)菌的基因表達(dá)由多種分子進(jìn)行調(diào)控，sRNA通過(guò)修飾核糖體和mRNA 的穩(wěn)定性起到抑制或促進(jìn)作用，從而介導(dǎo)調(diào)控功能的多樣性［10］。大量研究證明sRNA 與細(xì)菌毒力、宿主-病原體信息傳遞、抗菌能力和耐藥性等密切相關(guān)［11］。包括調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)組成［12］，生物膜形成［12］，含氮化合物的代謝［13］，糖代謝［14］，染色體外DNA 元件的調(diào)節(jié)［15］，轉(zhuǎn)錄和RNA 降解的控制［16］，以及在感染期間細(xì)菌毒力的調(diào)節(jié)和宿主生物的相互作用［17］，sRNA 過(guò)與靶基因的mRNA 結(jié)合，被證實(shí)參與轉(zhuǎn)錄后的細(xì)菌毒力水平和環(huán)境壓力適應(yīng)的調(diào)節(jié)

sRNA 已經(jīng)在多種細(xì)菌中鑒定出來(lái)，并發(fā)現(xiàn)在許多過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。法國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種名為SprD 的sRNA 在金黃色葡萄球菌中發(fā)揮著毒力調(diào)節(jié)作用，并找到其分子靶標(biāo)Sbi 蛋白，表明sRNA 對(duì)細(xì)菌的致病性起重要作用［18］。在大腸桿菌中，SgrS 通過(guò)下調(diào)PtsG 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與細(xì)菌磷酸葡萄糖代謝的應(yīng)激過(guò)程，抵抗細(xì)菌內(nèi)葡萄糖磷酸化的堆積［19］。目前關(guān)于類鼻疽伯克霍爾德菌中sRNA 的機(jī)制研究較少，泰國(guó)學(xué)者預(yù)測(cè)了1 306 個(gè)B.pseudomallei的sRNA 基因，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出8 個(gè)新型sRNA，未進(jìn)一步驗(yàn)證其功能［20］。馬來(lái)西亞學(xué)者通過(guò)模擬不同營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，預(yù)測(cè)了12 種差異表達(dá)的順式編碼sRNA 的表達(dá)譜，該12 種sRNA 可能與B.pseudomallei適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境有關(guān)［21］。

既往研究證實(shí)了sRNA 在其他細(xì)菌中的調(diào)控作用，如SmsR4 促進(jìn)含山梨糖醇培養(yǎng)基中的變形鏈球菌生長(zhǎng)［22］，ArcZ、CsrB 和OxyS 等sRNA 通過(guò)調(diào)控鞭毛調(diào)節(jié)因子的表達(dá)影響生物膜的形成［23］，DicF 通過(guò)調(diào)節(jié)腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)基因和志賀毒素表達(dá)調(diào)控大腸桿菌的毒力［24］。本研究以課題組前期表達(dá)純化的sRNA 伴侶蛋白Hfq 蛋白為基礎(chǔ)，通過(guò)免疫共沉淀的方法篩選出與Hfq 互作的9 種sRNA，運(yùn)用TPR-pK18mobSacB 自殺性質(zhì)粒載體系統(tǒng)構(gòu)建sRNA9 敲除株。敲除目的sRNA9 基因片段后，細(xì)菌平臺(tái)期的生長(zhǎng)速度低于野生株，但泳動(dòng)能力和生物被膜形成能力均下降，耐藥性與野生株相比較無(wú)差異，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明sRNA9可能在類鼻疽伯克霍爾德菌HNBP001的生長(zhǎng)和毒力中扮演了重要角色。

綜上所述，通過(guò)構(gòu)建類鼻疽伯克霍爾德菌sRNA 敲除株，對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，為后續(xù)研究sRNA 在B.pseudomallei致病過(guò)程中的分子機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。