趙曉佳 王道涵 談家金 葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué),南京,210037)

松材線蟲病發(fā)病速度快,致死率高,傳播途經(jīng)多,感病松樹種類多,適生區(qū)域廣,治理難度大,已成為我國最具危險(xiǎn)性和毀滅性的植物檢疫性病害。中國是在1982年首次分離出松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)[1],短短40 a,該病已經(jīng)擴(kuò)散蔓延至我國的19個(gè)省731個(gè)縣(區(qū)),造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失[2]。雖然國內(nèi)外學(xué)者已對松材線蟲病致病機(jī)理和病害防治進(jìn)行了大量試驗(yàn)研究[3-4],但由于該病害系統(tǒng)非常復(fù)雜,導(dǎo)致松樹萎蔫的因素很多[5],目前并沒有形成一套高效、經(jīng)濟(jì)的防控對策。在松材線蟲病防治的研究中,病害的早期診斷一直是個(gè)研究熱點(diǎn)。

松樹在感染松材線蟲后,癥狀未表現(xiàn)之前,樹體內(nèi)的組織可能因受線蟲脅迫,在組織病理學(xué)[6-7]、生理生化[8-9]以及防御蛋白[10-11]等方面發(fā)生了一系列的反應(yīng)。因此,從寄主松樹中尋找特異且穩(wěn)定的感病生理生化指標(biāo)是一個(gè)重要的研究方向。

本研究通過測定接種松材線蟲后早期2年生馬尾松(Pinusmassoniana)苗莖干營養(yǎng)物質(zhì)(可溶性蛋白、可溶性糖和總糖)、次級代謝產(chǎn)物(總酚和黃酮)和有機(jī)酸(苯甲酸和水楊酸)質(zhì)量分?jǐn)?shù),找尋侵染早期馬尾松體內(nèi)某些物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化規(guī)律,為該病的早期診斷提供參考。

1 材料與方法

材料來源:2年生馬尾松苗由江蘇沂北園林苗木有限公司提供。植物可溶性蛋白、可溶性糖和總糖試劑盒均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。松材線蟲蟲株AMA3分離自安徽省感病黑松,由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室提供。

松材線蟲的培養(yǎng)和接種:將松材線蟲接種在灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上,25 ℃培養(yǎng)5～7 d,收集線蟲懸液于15 mL離心管中,3 500 r/min離心3 min,棄上清液,離心管底部線蟲用無菌水洗3次,調(diào)整濃度至10 000條/mL。采用皮接法[12]接種于2年生馬尾松苗莖干中部偏下的位置。每株馬尾松苗接種線蟲水懸液500 μL,對照組注入等量無菌水。

接種后取樣及處理:接種0、0.5、1.0、2.0、4.0、7.0和10.0 d后,將馬尾松接種點(diǎn)附近上下5 cm的莖干切成小段,平均分成兩部分,一部分液氮速凍后放入超低溫冰箱-80 ℃保存,之后用于測定莖干可溶性蛋白、可溶性糖、總糖、苯甲酸和水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。另一部分于烘箱中65 ℃烘干48 h,使莖干達(dá)到完全干燥的狀態(tài),將干燥的莖干用微型粉碎機(jī)粉碎成粉末狀,用于測定馬尾松莖干黃酮和總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。每個(gè)處理取3株馬尾松作為重復(fù),每株馬尾松測3次。

馬尾松生化物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定:馬尾松莖干可溶性蛋白、可溶性糖和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定均根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。馬尾松黃酮和總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定參考鄒美佳等[13]的方法。馬尾松苯甲酸和水楊酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)由南京維百瑞生物科技有限公司采用高效液相色譜法(HPLC)測定。具體方法是:取1 g樣品,加入5 mL濃度為1 mol/L的NaOH,4 ℃下在搖床上提取16 h,離心(10 000 r/min,5 min),取上清,沉淀用5 mL濃度為1 mol/L的NaOH超聲30 min,再次離心,合并兩次上清;以濃鹽酸將上清液pH調(diào)至2,加入5 mL乙酸乙酯,震蕩萃取1 min,萃取3次,收集上層乙酸乙酯相;在乙酸乙酯相中加入1 g無水MgSO4除水,離心(10 000 r/min,2 min),取上清,氮?dú)獯蹈蓾饪s,然后用0.4 mL色譜純甲醇溶解,經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾,濾液用安捷倫1260高效液相色譜儀串聯(lián)6420A質(zhì)譜儀測定馬尾松莖干苯甲酸和水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。液相條件:色譜柱為C18,柱溫為30 ℃;流動相A液為甲醇,B液為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸,流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～3 min,20% A液;3～9 min,50% A液;9～10.6 min,80% A液;10.6～13.5 min,20% A液。進(jìn)樣體積為1 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法為取質(zhì)量濃度為500 mg/L的苯甲酸和水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各20 μL加入1.5 mL的離心管,再加入色譜純甲醇960 μL,此時(shí),混合標(biāo)樣母液質(zhì)量濃度為10 mg/L。將母液稀釋成10、50、100、500、1 000、5 000 μg/L的混標(biāo)質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

數(shù)據(jù)處理:用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并進(jìn)行顯著性差異分析(t檢驗(yàn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種松材線蟲后馬尾松苗發(fā)病情況

接種后0、0.5、1.0、2.0和4.0 d,處理馬尾松苗均保持健康,苗木針葉為綠色,莖干無褐變,流脂較多。接種后7.0 d,處理馬尾松苗莖干木質(zhì)部流脂停止,髓心褐化,但針葉表現(xiàn)正常。接種后10.0 d,馬尾松苗開始表現(xiàn)外部癥狀,少部分針葉失綠、褪色,莖干木質(zhì)部褐化,髓部褐化嚴(yán)重。接種期間,所有對照馬尾松苗均健康,針葉保持綠色,木質(zhì)部和髓部顏色正常。

2.2 松材線蟲侵染后馬尾松營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

由表1可知,接種松材線蟲后,馬尾松莖干可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢。接種松材線蟲后1.0 d,處理組馬尾松莖干可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對照組(P<0.05),高出25.18%;4.0～10.0 d,可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于對照組,其中7.0和10.0 d處理組與對照組差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

由表1可知,接種松材線蟲后,馬尾松莖干可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體上呈現(xiàn)較低水平。接種后0.5 d,處理組馬尾松莖干可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,比對照組高8.28%,達(dá)到極顯著水平(P<0.01),之后呈先下降后上升再下降的趨勢。接種后1.0～10.0 d,處理組馬尾松莖干可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于對照組,除接種后4.0 d外,其他時(shí)間處理組與對照組均達(dá)到顯著性差異水平(P<0.05)。

由表1可知,接種松材線蟲后,馬尾松莖干總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。接種后0.5和1.0 d,處理組馬尾松莖干總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對照組(P<0.05),且在0.5 d達(dá)到峰值96.831 0 mg/g,比對照組高13.86%。7.0和10.0 d,總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于對照組,但只有10.0 d時(shí),兩者差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

2.3 松材線蟲侵染后馬尾松次級代謝產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

由表2可知,接種松材線蟲后,馬尾松莖干總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。接種松材線蟲后2.0和4.0 d,處理組馬尾松總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著高于對照組(P<0.01),其中4.0 d升高明顯,達(dá)到峰值12.189 0 mg/g,比對照組高19.93%。接種后7.0和10.0 d,莖干總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別比對照組低16.18%和37.84%,均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。

由表2可知,接種松材線蟲后,馬尾松莖干黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體上呈現(xiàn)較高水平。接種后2.0～10.0 d,處理組馬尾松黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對照組,且在7.0 d質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高最為明顯,達(dá)到峰值18.103 3 mg/g,比對照組高53.56%,達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。

表1 松材線蟲侵染后馬尾松營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表2 松材線蟲侵染后馬尾松次級代謝產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.4 松材線蟲侵染后馬尾松有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

由表3可知,接種松材線蟲后,馬尾松莖干苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終呈現(xiàn)較高水平。接種后1.0～4.0 d,處理組馬尾松莖干苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化比較平穩(wěn),7.0 d時(shí)達(dá)到峰值515.076 8 ng/g,比對照高88.69%,達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。而對照組馬尾松苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)波動不大,一直維持在較低水平。

由表3可知,接種松材線蟲后,馬尾松莖干水楊酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體上呈現(xiàn)較高水平。接種后7 d,處理組馬尾松水楊酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高,為164.484 0 ng/g,比對照組高313.21%,達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。對照組馬尾松水楊酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)波動不大,一直維持在較低水平。

表3 松材線蟲侵染后馬尾松有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討論和結(jié)論

總糖包括單糖、多糖和寡糖。糖是植物的碳源、能源、信號分子和結(jié)構(gòu)物質(zhì),參與植物生長發(fā)育的多個(gè)環(huán)節(jié)[14]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)和可溶性糖不僅是植物重要的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源,還作為植物體重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在應(yīng)對逆境脅迫中發(fā)揮作用[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn),受松材線蟲侵染后的馬尾松莖干可溶性蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢,接種松材線蟲后1.0 d,處理組高于對照組,4.0～10.0 d,處理組均低于對照組。總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,接種后0.5和1.0 d,處理組高于對照組,7.0和10.0 d,處理組均低于對照組?？扇苄缘鞍缀涂偺乔捌谫|(zhì)量分?jǐn)?shù)較高是由于馬尾松受松材線蟲脅迫后,為了維護(hù)異常的生理代謝,需要合成更多的可溶性蛋白和總糖以抵御松材線蟲的侵害。接種后期,馬尾松莖干可溶性蛋白和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低,是由于馬尾松針葉光合作用減弱,進(jìn)而影響了馬尾松樹體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的合成和代謝。松材線蟲侵染早期4年生樟子松(PinussylvestrisL. var.mongolica),針葉可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,侵染4～5年生馬尾松、黑松(Pinusthunbergii),莖干樹皮總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較高[18-19];而侵染3～4年生黑松會導(dǎo)致莖部可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降,侵染30年生馬尾松會導(dǎo)致樹干總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降[20]。接種線蟲后,馬尾松莖干可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低與馬尾松應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。有研究表明,可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低,其抗蟲性也越強(qiáng)[21]。這與松材線蟲侵染早期4～5年生黑松,莖干樹皮可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的結(jié)果相一致[19],但與1年生濕地松針葉的測定結(jié)果不一致[22]。由此可見,松樹體內(nèi)這3種營養(yǎng)物質(zhì)均參與適應(yīng)松材線蟲的侵害,不同的松樹、不同樹齡或器官對松材線蟲脅迫的生理適應(yīng)性存在著差異。目前,松材線蟲侵染早期,馬尾松莖干這3種營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化規(guī)律的研究相對較少,因此,馬尾松莖干這3種指標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定能否用于預(yù)測馬尾松病害程度還有待于進(jìn)一步研究。

植物體內(nèi)活性氧的清除不僅依賴于植物抗氧化酶的活性,還依賴于一些非氧化酶類化合物,而黃酮和總酚等酚類化合物作為非氧化酶類在活性氧的清除中發(fā)揮作用[23-24]。酚類物質(zhì)不僅參與植物的褐變過程[8],而且較高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也能影響線蟲活性[25]。本研究發(fā)現(xiàn),接種線蟲前期,馬尾松莖干總酚和黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體上處于較高水平,表明馬尾松總酚和黃酮均參與了前期活性氧清除的抗病反應(yīng)和后期的組織褐變。病重后,隨著樹勢的減弱,總酚和黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所降低。這與陳玉惠等[8]研究結(jié)果相似,但其研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲侵染后,1.5年生馬尾松莖干酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)病時(shí)達(dá)到高峰,而本研究中,2年生馬尾松莖干總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在病重前6 d就達(dá)到了峰值,這是由于馬尾松莖干總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化時(shí)間和速度與寄主年齡和抗性水平有關(guān)。因此,馬尾松莖干總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化與植株感病癥狀是否表現(xiàn)出一致的特征,還需進(jìn)一步研究。截至目前,松材線蟲侵染后馬尾松莖干黃酮物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究相對較少。因此,馬尾松莖干黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定能否用于馬尾松松材線蟲病早期診斷還有待研究。

酚酸是合成植物毒素的重要次生物質(zhì),對昆蟲具有抗性作用,酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加是植物直接防御反應(yīng)最明顯的特征之一[26]。苯甲酸和水楊酸都屬于酚酸類化合物。苯甲酸也被認(rèn)為是植物毒素,當(dāng)植物遭受松材線蟲侵染后苯甲酸積累以毒害植物組織細(xì)胞,使寄主枯萎死亡[27]。水楊酸作為植物體內(nèi)重要的信號分子,在植物遭受逆境時(shí),通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn),松材線蟲侵染后的馬尾松莖干苯甲酸和水楊酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)較高水平,病重時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始下降。由此推測松樹體內(nèi)苯甲酸和水楊酸參與了植物的防御反應(yīng),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定能夠在一定程度上反應(yīng)松材線蟲病的發(fā)病情況,具有應(yīng)用于松材線蟲病早期診斷的潛力[29-30]。

前人研究可知,松樹的生化物質(zhì)變化有可能被用來進(jìn)行松材線蟲病的早期診斷[20],這其中最為關(guān)鍵的因素是生化指標(biāo)的特異性和穩(wěn)定性是否良好。在本次對馬尾松7個(gè)生化指標(biāo)的研究中發(fā)現(xiàn),馬尾松受松材線蟲侵染后,苯甲酸和水楊酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)較高水平。結(jié)合前人的研究結(jié)果,這2個(gè)指標(biāo)有可能被用于病害的早期診斷。但本研究所采取的研究方法是對室內(nèi)馬尾松幼苗進(jìn)行人工接種,這與野外自然感病的松樹病變規(guī)律可能存有一定的差異,今后可考慮在林間大樹上對這2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行深入研究。