趙玉雪 朱佳敏 楊霞 吳柳燕 趙奕

(貴州省核桃研究所,貴陽,550055) (廣東省林業(yè)科學(xué)研究院)

核桃長足象(AlcidodesjuglansChao)屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae),是核桃樹主要害蟲之一,在我國的核桃產(chǎn)地多有分布,蟲害情況十分嚴(yán)重,主要發(fā)生蛀果危害[1]。核桃長足象1年發(fā)生1代,成蟲在果實(shí)里產(chǎn)卵,卵孵化后形成幼蟲,其幼蟲在果內(nèi)蛀害時(shí)間長且隱蔽,防治困難,早期幼蟲會(huì)蛀食種仁,導(dǎo)致落果,而后期幼蟲會(huì)導(dǎo)致核桃青皮腐爛而污染果殼,損害其商品價(jià)值[2-5]。

根據(jù)核桃長足象的生物學(xué)特性,現(xiàn)有的主要防治方法有撿拾落果、打孔施藥、噴施施藥法等,但這些方法難以減輕蟲口密度,且農(nóng)殘過重,抗藥性也過強(qiáng),無法長期使用。目前已發(fā)現(xiàn)的蟲生真菌約有1 000余種[6],球孢白僵菌(Beauveriabassiana)作為其中之一,具有致病力強(qiáng)、殺蟲譜廣、容易培養(yǎng)及易飛揚(yáng)擴(kuò)散等特點(diǎn),還具有防治植物病害和蟲害的雙重作用[7],其普遍應(yīng)用在森林害蟲和農(nóng)業(yè)害蟲的防治上[8]。在核桃上,楊世璋等[9]就不同昆蟲上分離出的球孢白僵菌對(duì)核桃長足象成蟲的致病性與防治效果做了初步的研究,研究表明,球孢白僵菌對(duì)核桃長足象具有較強(qiáng)的致病力。本文也通過收集核桃長足象的僵蟲進(jìn)行研究。首先,從收集到的僵蟲上進(jìn)行病原菌的分離純化并獲得菌株,通過形態(tài)鑒定及基因序列分析鑒定菌種,再以核桃長足象為供試蟲源,測定菌株對(duì)核桃長足象的致病性,以確定其殺蟲活性較強(qiáng)的孢子懸浮液濃度。

1 材料與方法

供試?yán)ハx:核桃長足象僵蟲采集于貴州省清鎮(zhèn)市犁倭鎮(zhèn)右八村。

供試核桃長足象成蟲為采集受幼蟲危害的落果,帶回實(shí)驗(yàn)室,放入飼養(yǎng)盒中,以紗網(wǎng)封住頂部,待幼蟲羽化成蟲后收集成蟲,以新鮮核桃果實(shí)和核桃枝條飼養(yǎng)備用。

分離純化與保存:將采集回的核桃長足象僵蟲浸泡在體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中消毒,30 s后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞中再消毒1.5 min,用滅菌水漂洗3次,用滅菌的濾紙將核桃長足象成蟲蟲體上的水分吸干,放置在配制好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中27 ℃培養(yǎng)2～3 d,待PDA中的核桃長足象周圍長出新菌絲后,把新長的菌絲挑取到新的PDA培養(yǎng)基上,此操作重復(fù)3次,然后用稀釋純化法對(duì)病菌進(jìn)行單菌落分離,得到復(fù)壯的、致病力強(qiáng)的菌株。將高毒力菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上,放置在4 ℃條件下進(jìn)行保存。

菌株形態(tài)特征:把保存的菌株重新轉(zhuǎn)接到明膠培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上,并在恒溫培養(yǎng)箱中27 ℃培養(yǎng),按時(shí)觀察菌落生長,記錄顏色、形態(tài)。挑取PDA培養(yǎng)基上的菌株,配制分生孢子懸液,吸取10 μL懸液至玻片上,在尼康DS-Ri1生物數(shù)碼顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)大小。采用庫賽姆(COXEM)EM-30臺(tái)式掃描電鏡觀察菌株分生孢子顯微結(jié)構(gòu)。

菌株分子生物學(xué)鑒定:用北京擎科生物科技有限公司的植物DNA提取試劑盒(通用型)提取菌株的基因組DNA,采用不同的引物分別擴(kuò)增菌株的ITS和β-tubulin基因片段(表1)。PCR反應(yīng)體系為50 μL,其中上下游引物各2 μL,1×TSE101金牌mix4為5 μL,DNA模板為1 μL。以上擴(kuò)增體系按以下擴(kuò)增程序擴(kuò)增:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s,53 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,39個(gè)循環(huán);72 ℃,延伸5 min。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(2 μL樣品+6 μL溴酚藍(lán)),300 V電壓下12 min,獲取鑒定膠圖。分子測序與菌種鑒定回收后的PCR產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行。用ContigExpress軟件拼接測序結(jié)果,將拼接好的序列在國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì),以相似性99%及以上為標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行菌種的分子鑒定。

選取序列,與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì),并下載相關(guān)序列,用Mega 7軟件分析,并采用鄰接法(NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

菌株的致病性測定:將分離純化的菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上,于27 ℃恒溫條件下培養(yǎng)10 d后,刮取其分生孢子,用血球計(jì)數(shù)板確定孢子懸浮液的菌濃度,再以無菌水稀釋成菌濃度分別為108、107、106、105、104個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。

采用浸泡法進(jìn)行毒力測定試驗(yàn)。每個(gè)菌濃度分別挑取核桃長足象健壯成蟲約30頭(每次重復(fù)約10頭,共3次重復(fù)),將健壯的核桃長足象浸泡在對(duì)應(yīng)菌濃度的孢子懸浮液中8 s后,置于剪取的新鮮核桃枝條葉片及核桃果上培養(yǎng),枝條及核桃果放置在玻璃瓶中,以紗網(wǎng)封頂面,培養(yǎng)溫度為27 ℃,相對(duì)濕度80%,光照周期為12 h黑暗、12 h光照,并以體積分?jǐn)?shù)0.1%的吐溫-80作為對(duì)照。每天定時(shí)檢查成蟲的侵染情況,及時(shí)更換新鮮核桃枝條,以蟲體長出白色菌絲,最后被菌絲包圍,產(chǎn)生分生孢子層為死亡標(biāo)準(zhǔn),記錄死亡數(shù)量。

累計(jì)死亡率=(死亡數(shù)/處理總數(shù)量)×100%;

校正死亡率=[(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)]×100%[10]。

數(shù)據(jù)處理:用EXCEL軟件計(jì)算各處理的累計(jì)死亡率、校正死亡率;用SPSS軟件計(jì)算各處理的半致死時(shí)間(LT50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征

將分離純化培養(yǎng)的菌株命名為編號(hào)QZCZX-1,并對(duì)其進(jìn)行鑒定。在PDA培養(yǎng)基上,培養(yǎng)初期菌落呈白色長絨狀,背面無色,在光學(xué)顯微鏡下觀察,菌絲透明光滑,至培養(yǎng)后期,菌落呈淡黃色粉末狀,背面呈現(xiàn)黃色(圖1A、B)。在明膠培養(yǎng)基上,菌株為白色(圖1C、D)。在數(shù)碼顯微鏡下測量出孢子大小為1.1 μm×2.1 μm～1.7 μm×2.5 μm(圖1E),且觀察到大量孢子在泡囊表面聚集成圓球狀。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn),分生孢子為單孢,透明、光滑,多呈卵圓形(圖1F)。

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

分別擴(kuò)增菌株的ITS和β-tubulin基因片段,將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì),菌株QZCZX-1與球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的同源性均為99%以上。

菌株選取的PCR引物不同,擴(kuò)增片段不同,因此以鄰接法進(jìn)行不同序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。以ITS序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的菌株QZCZX-1與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹中,以長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)為外群,結(jié)果表明,菌株QZCZX-1與球孢白僵菌多株菌株及蠕孢白僵菌(Beauveriavermiconia)有親緣關(guān)系,與球孢白僵菌是在同一分支,且菌株QZCZX-1與球孢白僵菌CCTU229菌株處于進(jìn)化樹最小分支,親緣關(guān)系最近,同源性最高(圖2)。以β-tubulin序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的菌株QZCZX-1與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹中,以刀孢輪枝菌(Lecanicilliumpsalliotae)為外群,結(jié)果表明,菌株QZCZX-1與球孢白僵菌多株菌株及蘇格蘭白僵菌(Beauveriacaledonica)有親緣關(guān)系,且菌株QZCZX-1與球孢白僵菌ARSEF2860菌株處于進(jìn)化樹最小分支,親緣關(guān)系最近,同源性最高(圖3)。結(jié)合菌株的形態(tài)特征,可將菌株QZCZX-1確定為球孢白僵菌。

A為PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后期菌落正面;B為PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后期菌落背面;C為明膠培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落正面;D為明膠培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落背面;E為分生孢子數(shù)碼顯微鏡下照片;F為分生孢子及分生孢子梗電鏡掃描照片。

圖1 菌株QZCZX-1的形態(tài)特征

2.3 菌株的致病性

通過進(jìn)行菌株QZCZX-1對(duì)核桃長足象的致病力測定,發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)核桃長足象有較強(qiáng)的致病性。接種25 d后的試驗(yàn)結(jié)果表明,分生孢子懸浮液菌濃度越高,對(duì)核桃長足象的致死率越高,LT50值越小。在菌濃度為104個(gè)/mL時(shí),核桃長足象的校正死亡率僅有51.85%,LT50卻長達(dá)22.591 d;隨著菌液濃度的升高,菌株QZCZX-1對(duì)核桃長足象的校正死亡率升高,LT50縮短,在菌濃度為108個(gè)/mL時(shí),核桃長足象的校正死亡率達(dá)到最高,為92.59%,對(duì)其LT50也縮短至13.993 d(表2)。

3 結(jié)論與討論

球孢白僵菌作為蟲生真菌能侵染多種昆蟲,且致病性強(qiáng),不易產(chǎn)生抗性。本研究從林間采回核桃長足象僵蟲,分離純化得到菌株QZCZX-1,培養(yǎng)后,通過形態(tài)學(xué)特征觀察及序列比對(duì),鑒定其為球孢白僵菌。測定QZCZX-1對(duì)核桃長足象的致病性,由數(shù)據(jù)可知,菌液濃度為108個(gè)/mL時(shí),核桃長足象的校正死亡率最高,為92.59%,LT50最短,僅為13.993 d。由此可見,本研究中獲得的球孢白僵菌菌株對(duì)核桃長足象具有強(qiáng)致病性,能夠?yàn)楹罄m(xù)核桃長足象的生物防治提供菌源。

圖2 以ITS序列為基礎(chǔ)構(gòu)建目的菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)

圖3 以β-tubulin序列為基礎(chǔ)構(gòu)建目的菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)

表2 菌株QZCZX-1對(duì)核桃長足象成蟲的毒力測定結(jié)果

致病力的高低是篩選病原真菌高效菌株的重要指標(biāo),球孢白僵菌作為昆蟲病原真菌,具有寄主專一的特點(diǎn),在不同寄主上其毒力也不相同,田佳等[11]通過對(duì)桃蚜的致病性測定,篩選出的菌株具有高致病性;宋曉兵等[12]從柑橘木虱蟲體分離得到一株對(duì)柑橘木虱的校正死亡率高達(dá)95.7%的球孢白僵菌;陶淑霞等[13]從大豆食心蟲老熟幼蟲上分離出8個(gè)球孢白僵菌菌株,篩選得到對(duì)大豆食心蟲侵染率達(dá)90%的高毒力菌株;在草地貪夜蛾上分離出來的球孢白僵菌,均表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力[14]。本研究在確定了菌株QZCZX-1為球孢白僵菌后,進(jìn)行了對(duì)核桃長足象致病力的測定,通過得到的校正死亡率、LT50等數(shù)據(jù)表明,該菌株在高濃度下對(duì)核桃長足象的致死率較高。由此發(fā)現(xiàn),菌株QZCZX-1對(duì)核桃長足象具有較好的生防潛力。

菌株QZCZX-1對(duì)室內(nèi)核桃長足象的毒力較強(qiáng),但在林間的應(yīng)用效果卻未知,耿顯勝等[15]在分離竹卵圓蝽致病球孢白僵菌后,對(duì)其林間的致病效果有所測定,發(fā)現(xiàn)林間測定的累計(jì)死亡率明顯低于室內(nèi)毒力測定結(jié)果。因此,菌株QZCZX-1對(duì)核桃長足象的林間應(yīng)用也亟需探明。篩選對(duì)昆蟲具有強(qiáng)毒力的優(yōu)良菌株是成功進(jìn)行生產(chǎn)防治的前提[16],在完全探明菌株QZCZX-1的特性后,可將其開發(fā)成生防菌制劑,這也能促進(jìn)新型生物農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程,以減少在核桃長足象防治過程中所產(chǎn)生的抗藥性、農(nóng)藥超標(biāo)和環(huán)境污染等問題。