新生兒基因篩查在遺傳性疾病中的應(yīng)用進(jìn)展

孫淑妮 莊丹燕 李海波

[摘要]?近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，高通量測(cè)序（next?generation?sequencing，NGS）等基因檢測(cè)技術(shù)在遺傳性疾病篩查診斷領(lǐng)域有極高的應(yīng)用價(jià)值，特別是在新生兒疾病防治方面。新生兒基因篩查旨在早期發(fā)現(xiàn)新生兒患遺傳性疾病風(fēng)險(xiǎn)，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。本文綜述新生兒基因篩查作為一級(jí)篩查在基因表型明確的單基因遺傳性疾?。ㄟz傳性耳聾、脊髓性肌萎縮癥、地中海貧血、原發(fā)性免疫缺陷及進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良等）中的應(yīng)用、作為二級(jí)篩查聯(lián)合生化篩查在遺傳代謝性疾病中的應(yīng)用及其在重癥監(jiān)護(hù)病房危重癥新生兒疾病診斷中的應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞]?基因篩查；遺傳性疾??；新生兒；高通量測(cè)序

[中圖分類(lèi)號(hào)]?R722??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.09.023

遺傳性疾病是由于人體遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能改變而引起的疾病，此類(lèi)疾病通常由基因變異所致，在兒科臨床診療工作中十分常見(jiàn)，尤其是新生兒，新生兒期被診斷為遺傳性疾病的病死率非常高。隨著基因測(cè)序的發(fā)展，基因篩查在新生兒期確診遺傳性疾病方面發(fā)揮重要作用，在新生兒疾病篩查（酶學(xué)、免疫熒光法、串聯(lián)質(zhì)譜法等）及聽(tīng)力篩查（耳聲發(fā)射、腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位）、或新生兒所患疾病表型為非特異性且懷疑為遺傳性疾病、或因病情嚴(yán)重而致診斷更為緊迫時(shí)，可應(yīng)用二代測(cè)序等基因檢測(cè)技術(shù)。此類(lèi)技術(shù)是通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)的分析及比對(duì)，檢測(cè)出發(fā)生變異的染色體片段、基因或位點(diǎn)，研究疾病的發(fā)病機(jī)制。該技術(shù)一次性可檢測(cè)多個(gè)基因組區(qū)域，成本效益更高。目前，臨床上應(yīng)用的基因檢測(cè)技術(shù)包括實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time?quantitative?polymerase?chain?reaction，qPCR）、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex?ligation-dependent?probe?amplification，MLPA）、第一代測(cè)序技術(shù)（sanger測(cè)序）、第二代測(cè)序技術(shù)[Panel測(cè)序、全外顯子組測(cè)序（whole?exome?sequencing，WES）和全基因組測(cè)序]及第三代測(cè)序技術(shù)等。早期對(duì)新生兒進(jìn)行基因篩查指導(dǎo)治療及判斷預(yù)后，可避免或減少患兒機(jī)體出現(xiàn)不可逆性損傷，醫(yī)療機(jī)構(gòu)可及時(shí)向家庭提供預(yù)后咨詢(xún)，從而改善預(yù)后。本文就新生兒基因篩查在遺傳性疾病中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1??新生兒基因篩查在單基因遺傳性疾病中的應(yīng)用

截至目前，據(jù)在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)，共發(fā)現(xiàn)8000多種單基因遺傳性疾病，其中已明確致病基因的約4000多種[1]。國(guó)內(nèi)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)越來(lái)越關(guān)注無(wú)明顯生化指標(biāo)異常的嚴(yán)重單基因遺傳性疾病篩查。新生兒人群篩查的主要目標(biāo)是早期識(shí)別患嚴(yán)重疾病的無(wú)癥狀嬰兒，對(duì)這些疾病行有效治療，早期診斷和干預(yù)可預(yù)防嚴(yán)重的后遺癥。目前，qPCR及MLPA廣泛應(yīng)用于基因型-表型聯(lián)系明確的單基因遺傳性疾病，包括遺傳性耳聾、脊髓性肌萎縮、地中海貧血及原發(fā)性免疫缺陷病等。

2000年，Green等[2]首次提出新生兒耳聾基因篩查，新生兒基因篩查是聽(tīng)力篩查的有效補(bǔ)充和提高，通過(guò)提早干預(yù)、定期監(jiān)測(cè)，減緩遲發(fā)性耳聾，避免藥物性耳聾。近幾年，為了聽(tīng)力障礙的早期診斷、干預(yù)和遺傳咨詢(xún)，研究分析聽(tīng)力篩查結(jié)合耳聾基因篩查的數(shù)據(jù)，顯示耳聾相關(guān)基因的攜帶頻率和變異譜。2012年，北京市啟動(dòng)新生兒群體的聽(tīng)力和耳聾基因篩查項(xiàng)目，對(duì)180?469名新生兒進(jìn)行聽(tīng)力篩查和DNA微陣列聯(lián)合篩查，篩查結(jié)果顯示，8136名新生兒（4.508%）耳聾基因篩查呈陽(yáng)性（雜合子、純合子或復(fù)合雜合子與mtDNA同源或異源），其中7896名新生兒（4.375%）通過(guò)聽(tīng)力篩查發(fā)現(xiàn)40名（0.022%）攜帶兩個(gè)GJB2基因或SLC26A4基因（純合子或復(fù)合雜合子），10名通過(guò)新生兒聽(tīng)力篩查；共409名（0.227%）新生兒攜帶mtDNA?12S?rRNA基因（m.1555A>G或m.1494C>T），其中405名通過(guò)新生兒聽(tīng)力篩查。Zou?等[3]應(yīng)用懸浮陣列分析法（篩查GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因中的20個(gè)熱點(diǎn)變異位點(diǎn)）對(duì)53?033名來(lái)自中國(guó)不同省份的新生兒進(jìn)行篩查，研究中國(guó)新生兒人群中常見(jiàn)耳聾基因變異情況，結(jié)果顯示，14?185名新生兒（26.75%）至少存在1個(gè)變異基因，872名（1.64%）為純合變異，包括112名（0.21%）為線(xiàn)粒體DNA純合變異；11?985名（22.59%）為雜合變異，包括11名（0.02%）線(xiàn)粒體DNA雜合變異[4-6]。

脊髓性肌萎縮（spinal?muscular?atrophy，SMA）導(dǎo)致進(jìn)行性近端肌無(wú)力和癱瘓，活產(chǎn)兒中發(fā)病率約為1/10?000～1/6000，攜帶頻率為1/60～1/40，是嬰幼兒期常見(jiàn)的致死性神經(jīng)遺傳性疾病之一[4-5]。SMA出現(xiàn)的最早癥狀是肌張力低下，嚴(yán)重時(shí)表現(xiàn)為呼吸肌無(wú)力，呼吸衰竭，需呼吸機(jī)治療。早期無(wú)法通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)該疾病，基因篩查可作為診斷SMA的金標(biāo)準(zhǔn)。

地中海貧血屬遺傳性溶血性貧血疾病，中重型地中海貧血將嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[6]。國(guó)外數(shù)據(jù)顯示，每年有近12?000例重型地中海貧血患兒（純合子狀態(tài)）出生，這些患兒在新生兒期常伴有嚴(yán)重貧血和肝脾腫大，需早期診斷并進(jìn)行反復(fù)輸血和螯合治療[7]。目前，我國(guó)臨床上主要使用熒光探針?lè)╗8]對(duì)新生兒地中海貧血進(jìn)行篩查，僅能檢測(cè)常見(jiàn)與特定的幾種地中海貧血類(lèi)型。當(dāng)反復(fù)出現(xiàn)血常規(guī)等指標(biāo)異常時(shí)，新生兒期基因篩查不僅能夠快速檢出地中海貧血的基因類(lèi)型，還能發(fā)現(xiàn)新的基因變異。

原發(fā)性免疫缺陷?。╬rimary?immunodeficiency?diseases，PID）是一組先天性免疫缺陷異質(zhì)性疾病，最常見(jiàn)的是重度聯(lián)合免疫缺陷病（severe?combined?immunodeficiency，SCID）和X連鎖無(wú)丙種球蛋白血癥（x-linked?agammaglobulinemia，XLA）。SCID是PID嚴(yán)重類(lèi)型之一，表現(xiàn)為嚴(yán)重缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞。SCID若不及時(shí)診斷和治療均是致命的。近期研究表明，如果新生兒在3.5月齡前和未發(fā)生嚴(yán)重感染和其他并發(fā)癥之前進(jìn)行造血干細(xì)胞移植，可顯著改善患兒預(yù)后[9]。

2??新生兒基因篩查聯(lián)合生化篩查在遺傳性疾病中的應(yīng)用

國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的生化篩查主要包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、熒光免疫法、串聯(lián)質(zhì)譜法（tandem?mass?spectrometry，TMS）等。生化篩查存在漏篩、假陰性風(fēng)險(xiǎn)；TMS指標(biāo)特異性弱，存在多種亞型，同一指標(biāo)可指向多種疾病，且波動(dòng)性較大；新生兒基因篩查可彌補(bǔ)新生兒疾病篩查的不足，明確遺傳性疾病的基因分型，指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定治療策略[10-11]。

目前，在生化篩查基礎(chǔ)上，MLPA、Sanger測(cè)序及高通量測(cè)序（next?generation?sequencing，NGS）技術(shù)在遺傳代謝性疾病篩查中具有診斷價(jià)值。Spenger等[12]報(bào)道1例新生兒期TMS未見(jiàn)異常、無(wú)相關(guān)臨床癥狀，隨后因急性腦病危象住院行WES篩查，結(jié)果患兒被確診為戊二酸尿癥Ⅰ型。于愛(ài)真等[13]對(duì)289名疑似遺傳代謝性疾病新生兒進(jìn)行NGS篩查，結(jié)果顯示陽(yáng)性率（13.8%）高于TMS陽(yáng)性率（11.8%），表明NGS可發(fā)現(xiàn)TMS未能發(fā)現(xiàn)的遺傳代謝病，TMS聯(lián)合NGS更具有診斷價(jià)值。Qin等[14]的研究涉及1例以低血糖為主要癥狀的5日齡女?huà)?，WES結(jié)果顯示，患兒存在TRMU基因新型復(fù)合雜合致病性變異和可能致病性變異。Mendell等[15]應(yīng)用熒光測(cè)定法測(cè)定肌酸激酶（creatine?kinase，CK）活性，聯(lián)合MLPA及WES技術(shù)，篩查37?649例新生兒男性假肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良（duchenne?muscular?dystrophy，DMD）患病情況，結(jié)果顯示6例患兒DMD基因變異（全部為外顯子缺失），且CK水平均>2000U/L；但在3例CK>2000U/L且未發(fā)現(xiàn)DMD基因變異的新生兒中，確定其存在肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)DYSF、SGCB和FKRP基因變異，上述篩查方案不僅可明確疾病，且可發(fā)現(xiàn)不同的基因變異。

隨著基因數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷更新和完善，各區(qū)域應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)開(kāi)展更大規(guī)模改善新生兒疾病防治及區(qū)域高發(fā)病率疾病變異攜帶率分析工作。近期有文獻(xiàn)回顧性分析區(qū)域TMS結(jié)合基因篩查的大樣本數(shù)據(jù)，揭示單病種的區(qū)域性發(fā)病率及高頻基因變異位點(diǎn)。Yang等[16]應(yīng)用TMS對(duì)寧波地區(qū)265?524名新生兒進(jìn)行基因檢測(cè)，檢測(cè)出53例游離肉堿水平異常新生兒，通過(guò)NGS，確診26例新生兒為原發(fā)性肉堿缺乏癥（primary?carnitine?defificiency，PCD）病例，提示寧波地區(qū)PCD出生患病率為1/16?595。Zhuang等[17]應(yīng)用TMS聯(lián)合NGS測(cè)序，對(duì)寧波地區(qū)302?993名新生兒進(jìn)行基因檢測(cè)，確診10例異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥陽(yáng)性病例，其中c.286G>A及c.1000C>T位點(diǎn)的攜帶率位居前2，患病率達(dá)1/30?300。

3??新生兒基因篩查在新生兒重癥監(jiān)護(hù)室中的應(yīng)用

新生兒期死亡的主要原因之一是遺傳性疾病，特別是新生兒重癥監(jiān)護(hù)室（neonatal?intensive?care?unit，NICU）中的危重新生兒。目前，診斷NICU患兒疑似遺傳性疾病的檢測(cè)方法包括核型、染色體微陣列及NGS技術(shù)。如在診斷過(guò)程中更早地使用NGS技術(shù)，可提供更及時(shí)、明確的診斷，提高治療準(zhǔn)確性。此外，由于危重早產(chǎn)兒的器官系統(tǒng)發(fā)育不成熟、功能不全，長(zhǎng)期腸外營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致代謝紊亂等，因此，該技術(shù)有助于解釋危重癥新生兒常見(jiàn)的假陽(yáng)性疾病篩查結(jié)果。

4??新生兒遺傳性疾病基因篩查相關(guān)倫理問(wèn)題

目前，基因檢測(cè)技術(shù)為新生兒遺傳性疾病提供一種快速、可行的診斷方式，也可作為金標(biāo)準(zhǔn)。然而，在該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于兒科實(shí)踐前，或在國(guó)家確認(rèn)該技術(shù)前，倫理因素要優(yōu)先于科學(xué)因素[18]。醫(yī)務(wù)工作者在開(kāi)展基因篩查前要考慮倫理問(wèn)題。首先，臨床醫(yī)生結(jié)合臨床癥狀和基因篩查結(jié)果，告知患兒家長(zhǎng)患兒被確診為遺傳性疾病，特別是嚴(yán)重的遺傳性疾病，家長(zhǎng)可能會(huì)出現(xiàn)擔(dān)憂(yōu)、壓力大、內(nèi)疚等負(fù)面情緒。其次，在醫(yī)學(xué)和社會(huì)背景下，基因篩查技術(shù)的臨床應(yīng)用可能會(huì)造成他人對(duì)患兒的歧視，暴露其隱私。臨床醫(yī)生和生物倫理學(xué)家應(yīng)考慮到，新生兒時(shí)期臨床使用基因篩查對(duì)患兒及其家長(zhǎng)的潛在危害至關(guān)重要。第三，征得患兒家長(zhǎng)的知情同意，與臨床醫(yī)生告知的內(nèi)容有很大關(guān)系，如基因篩查的主要目的、優(yōu)缺點(diǎn)、方法、存在的風(fēng)險(xiǎn)、干預(yù)及診治情況、對(duì)隱私的保護(hù)等[19]。提高臨床醫(yī)生的告知能力、臨床與遺傳相關(guān)業(yè)務(wù)能力，有助于基因檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，以幫助新生兒及其家庭獲得最大的健康利益。

綜上，隨著基因篩查技術(shù)的不斷進(jìn)步，新生兒遺傳性疾病的診斷快速發(fā)展，更多的遺傳性疾病被識(shí)別，疾病的早期診斷和治療取得進(jìn)展，患兒的預(yù)后也得到改善。因此，基因篩查方案的選擇應(yīng)根據(jù)遺傳性疾病的具體發(fā)病情況而定。相信在基因篩查的輔助下，新生兒遺傳性疾病的診治能夠更加高效，臨床兒科醫(yī)生能夠得到有效指導(dǎo)。

[參考文獻(xiàn)]

• CURRIER?R?J.?Single-gene?sequencing?in?newborn?screening：?Success，?challenge，?hope[J].?The?Hastings?Center Report，?2018，?48?Suppl?2（Suppl?2）：?S37-S38.?

（收稿日期：2022–09–11）

（修回日期：2023–01–31）