張永健,郭學(xué)海*,高秀鳳,王 斌,趙宏陽(yáng)

(1.開(kāi)灤總醫(yī)院林西醫(yī)院 普外科,河北 開(kāi)灤063103;2.開(kāi)灤總醫(yī)院林西醫(yī)院 消化內(nèi)科,河北 開(kāi)灤063103)

原發(fā)性胃癌是起源于胃黏膜的癌癥,是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤,盡管其發(fā)病率逐漸下降,胃癌仍然是全世界癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因之一[1]。幽門(mén)螺桿菌感染是胃癌的主要危險(xiǎn)因素,新分子有助于胃癌的診斷和降低死亡率,大多數(shù)被充分研究的分子是由胃上皮表達(dá)的組織蛋白生物標(biāo)記物,與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)[2-3]。S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase associated protein 2,SKP2)是細(xì)胞周期蛋白A-CDK2 S期激酶的基本成分[4],它主要在S期特異性識(shí)別磷酸化細(xì)胞周期素依賴的蛋白激酶抑制物(Cyclin dependent protein kinase inhibitor,p27kip1)[5],并參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞凋亡調(diào)控,是腫瘤治療的新靶點(diǎn)[6-7]。研究表明Skp2和Slug在侵襲性前列腺癌中共表達(dá),并受到去甲酰化阻滯的抑制,在前列腺癌細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮調(diào)控作用[8],Skp2蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)率高于癌旁組織,其表達(dá)與臨床分期、惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)和間質(zhì)浸潤(rùn)呈正相關(guān)[9],也有研究通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)SKP2和p27Kip1可以通過(guò)靶向MEK/ERK途徑增強(qiáng)CDK4/6抑制劑的細(xì)胞抑制作用[10],但Skp2和p27Kip1在原發(fā)性胃癌中的表達(dá)和對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的作用尚不清晰,因此本研究入組臨床原發(fā)性胃癌患者,分析癌組織和癌旁組織中Skp2和p27Kip1的表達(dá)水平,并通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探究Skp2和p27Kip1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、存活、早期凋亡和晚期凋亡的作用,為Skp2和p27Kip1在原發(fā)性胃癌中發(fā)揮的作用提供分子機(jī)制和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2018年12月至2021年12月開(kāi)灤總醫(yī)院林西醫(yī)院資料完整并經(jīng)臨床、病理證實(shí)的原發(fā)性胃癌患者63例,獲取患者癌組織和癌旁組織。本實(shí)驗(yàn)中所有患者均簽署知情同意書(shū)并通過(guò)開(kāi)灤總醫(yī)院林西醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基,胎牛血清FBS和青鏈霉素購(gòu)于購(gòu)于美國(guó)Gibico公司;T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管等實(shí)驗(yàn)耗材購(gòu)于美國(guó)Corning公司;NC質(zhì)粒和si-Skp2質(zhì)粒購(gòu)于廣州Ribobio公司;Skp2和p27Kip1引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。lipofectamine3000(貨號(hào): L3000015)購(gòu)于美國(guó)invitrigen 公司,Cell Counting Kit-8(CCK8,貨號(hào)Cat.No.:HY-K0301)細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)MCE公司;細(xì)胞凋亡試劑盒7-ADD/Annexin V(貨號(hào):KGA)購(gòu)于南京凱基生物公司,qPCR儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司,FACSVia流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司,PTC-3500全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)于北京普天新橋技術(shù)有限,Western blot電泳儀購(gòu)于美國(guó)bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1qPCR檢測(cè)胃癌組織和胃癌旁組織中Skp2和p27Kip1mRNA表達(dá)

對(duì)癌組織和癌旁組織在液氮中進(jìn)行研磨,采用Trizol、Titan One Tube RT-PCR和SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR試劑盒進(jìn)行總mRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行Skp2和p27Kip1的表達(dá)水平的qPCR,所有操作避免RNA酶污染。使用ABI 7500系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,預(yù)變性95 ℃ 10 min,變性95 ℃ 10 s,退火60 ℃25 s,延伸72 ℃ 205 s,38個(gè)循環(huán), Skp2、p27Kip1和GAPDH引物序列見(jiàn)表1,使用GAPDH作為內(nèi)參,以2-△△Ct計(jì)算Skp2和p27Kip1相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR檢測(cè)中不同基因的引物序列

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染條件

SGC-7901培養(yǎng)條件:RPIM1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 μg/ml、鏈霉素100 μg/ml),置CO2培養(yǎng)箱內(nèi),5%CO2,37℃靜置培養(yǎng);細(xì)胞轉(zhuǎn)染:用胰酶消化細(xì)胞后重選,嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipo3000說(shuō)明將NC和Skp2質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染6～8 h后更換成完全培養(yǎng)基重新加入完全培養(yǎng)基,置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng),48 h后用于各組實(shí)驗(yàn)。

1.3.3CCK8法檢測(cè)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞活力

以CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力,嚴(yán)格按照CCK8試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,將細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后以2×103的密度接種到96孔板中,分別在37℃下培養(yǎng)24 h、48 h和72 h,向每孔加入10 μl CCK-8 溶液(此過(guò)程避免孔中生成氣泡以避免影響OD值的讀數(shù)),將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度。

1.3.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的SGC-7901細(xì)胞胰酶消化后收集全部細(xì)胞,PBS緩沖液重懸細(xì)胞,嚴(yán)格按照細(xì)胞凋亡7-ADD/annexin V試劑盒進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn),避光孵育20 min,PBS清洗1遍,200 μl PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析,所有操作均在冰上避光完成,各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

將各組狀態(tài)良好的SGC-7901細(xì)胞1 ml RIPA蛋白裂解液冰上提取細(xì)胞總蛋白,使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后備用。將樣品分別加入不同的泳道進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,濃縮膠電壓和分離膠電壓分別為80V 10 min,120V 1.5 h,后轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%BSA封閉。加入特異性一抗Anti-SKP2 antibody(1∶200,ab183039,abcam,英國(guó)),Anti-p27 KIP 1 antibody(1∶5 000,ab32034,abcam,英國(guó))和GAPDH(1∶10 000,ab8245,abcam,英國(guó))于4℃冰箱過(guò)夜。TBST洗膜3次,每次10 min,加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2 000),孵育1 h。TBST洗膜3次,每次10 min,采用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯影,使用Photoshop圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

本研究共入組胃癌患者63例,平均年齡57.45±6.31歲,患者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),臨床一般資料詳見(jiàn)表2。

表2 63例患者一般臨床資料的比較

2.2 Skp2和p27Kip1在癌組織和癌旁組織中mRNA的表達(dá)比較

通過(guò)qPCR法檢測(cè)癌組織和癌旁組織Skp2和p27Kip1mRNA表達(dá)水平,結(jié)果如圖1所示,與癌旁組織相比,癌組織中Skp2mRNA表達(dá)水平顯著升高,p27Kip1mRNA表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 Skp2和p27Kip1在胃癌組織和癌旁組織中mRNA的表達(dá)比較

2.3 si-Skp2對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞活力的影響

通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)分析si-Skp2對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901活力的影響,結(jié)果表明與對(duì)照組相比,si-Skp2組胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降,具體表現(xiàn)為24 h、48 h、72 h的吸光度分別顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表3。

表3 Skp2和p27Kip1對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞活力的影響

2.4 si-Skp2對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響

通過(guò)流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析si-Skp2對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響,如圖2,結(jié)果表明與對(duì)照組相比,si-Skp2組細(xì)胞存活顯著降低、細(xì)胞晚期凋亡顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而細(xì)胞早期凋亡沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Skp2和p27Kip1對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響

2.5 si-Skp2對(duì)p27Kip1蛋白表達(dá)的影響

如圖3通過(guò)Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞Skp2和p27Kip1蛋白變化,結(jié)果表明與對(duì)照組相比,si-Skp2組Skp2蛋白表達(dá)水平顯著降低,p27Kip1蛋白表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 si-Skp2對(duì)p27Kip1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

原發(fā)性胃癌一般起源于胃黏膜細(xì)胞,由于飲食結(jié)構(gòu)的改變、工作壓力增大以及幽門(mén)螺桿菌的感染等原因,胃癌呈現(xiàn)年輕化傾向[11]。胃癌可發(fā)生于胃的任何部位,其中半數(shù)以上發(fā)生于胃竇部,胃大彎、胃小彎及前后壁均可受累。絕大多數(shù)胃癌屬于腺癌,早期無(wú)明顯癥狀,最主要的癥狀即為腹痛,其預(yù)后不良并伴有轉(zhuǎn)移,是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因[12]。不同患者的腫瘤特征不同,不同的患者存在不同的腫瘤微環(huán)境[13]。有研究證實(shí)原發(fā)性胃癌中伴隨著多種基因的調(diào)控,通過(guò)對(duì)臨床全基因組RNA-seq數(shù)據(jù)分析證實(shí)原發(fā)性胃癌患者腫瘤內(nèi)具有異質(zhì)性,多種細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡調(diào)控基因如Skp2、ERBB2、CLDN11和CDK12發(fā)揮重要作用[14]。有研究根據(jù)Kaplan-Meier生存分析和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析證實(shí)胃癌患者中細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換與患者的不良預(yù)后相關(guān)[15]。Skp2是一種能與S期激酶cyclinA-CDKI相互作用的蛋白,Skp2的表達(dá)水平在G0/G1 期降低,在S期表達(dá)增加[16]。Skp2的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平雙重調(diào)節(jié),與在不同類型的細(xì)胞中起主導(dǎo)作用的調(diào)節(jié)機(jī)制不同,Skp2能特異性識(shí)別磷酸化底物并介導(dǎo)其泛素化降解,調(diào)節(jié)p27Kip1等細(xì)胞周期調(diào)控因子[17]。本研究通過(guò)qPCR證實(shí)在不同病理分期、不同轉(zhuǎn)移程度、不同年齡的患者中,均出現(xiàn)了顯著的Skp2 高表達(dá),而p27Kip1顯著低表達(dá)的現(xiàn)象,這提示出Skp2 和 p27Kip1在胃癌進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用,并且在不同類型的胃癌患者中具有普遍性,有望成為的胃癌早期診斷分子標(biāo)志物。

細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡是生命的基本現(xiàn)象,可以維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡。在胚胎的發(fā)育、機(jī)體衰老和病變的細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用,保證了機(jī)體的健康。細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控[18-19],細(xì)胞的異常增殖和凋亡失控會(huì)引發(fā)癌癥等疾病,研究表明Skp2在許多人類癌癥中也過(guò)度表達(dá),Skp2可以靶向磷酸化p27進(jìn)行蛋白酶體降解,對(duì)多種細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡發(fā)揮直接調(diào)控作用,因此Skp2被認(rèn)為是癌基因和重要的藥物靶點(diǎn)[20]。本研究通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除Skp2后,胃癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低,細(xì)胞存活顯著降低,細(xì)胞晚期凋亡比例顯著增加,Western blot 結(jié)果證實(shí)敲除Skp2后,胃癌細(xì)胞的P27Kip表達(dá)顯著上升,由此可見(jiàn)skp2可通過(guò)p21Kip1對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上,本研究證實(shí)在原發(fā)性胃癌患者中Skp2高表達(dá)、p21Kip1低表達(dá),有望作為早期診斷的生物標(biāo)志物,并且Skp2可以通過(guò)p27Kip1抑制人胃癌細(xì)胞活性,降低細(xì)胞的增殖能力,誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞晚期凋亡。本研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本量,通過(guò)ROC曲線等分析,Skp2和p27Kip1可以作為早期診斷或者預(yù)測(cè)胃癌患者的生物學(xué)標(biāo)志物,為臨床診斷和治療提供新思路。