賀元川 游華建 陳仕江

摘要 ［目的］研究小金蝠蛾幼蟲血細(xì)胞對不同病原菌侵染的細(xì)胞免疫響應(yīng)差異，揭示擬棒束孢病害發(fā)生和冬蟲夏草菌形成機(jī)理的細(xì)胞免疫差異。［方法］利用光學(xué)顯微鏡觀察小金蝠蛾幼蟲感染病原菌后血細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)變化、細(xì)胞免疫反應(yīng)和黑化反應(yīng)，以L-多巴為底物，采用分光光度法測定感染不同時間后的血淋巴中酚氧化酶活性。［結(jié)果］小金蝠蛾幼蟲感染冬蟲夏草菌的生存曲線無顯著差異，血細(xì)胞對冬蟲夏草菌無明顯的集結(jié)、包囊、黑化等免疫作用，酚氧化酶活性侵染初期出現(xiàn)降低，然后逐漸恢復(fù)至健康幼蟲水平；小金蝠蛾幼蟲感染粉棒束孢的生存曲線具有顯著差異，對感染早期血細(xì)胞具有明顯的集結(jié)、包囊、黑化等免疫響應(yīng)，酚氧化酶活性初期降低后逐漸升高。［結(jié)論］小金蝠蛾幼蟲血細(xì)胞對病原真菌冬蟲夏草菌和粉棒束孢免疫防御響應(yīng)策略具有顯著差異，血細(xì)胞對冬蟲夏草菌無明顯的免疫反應(yīng)，對粉棒束孢雖然有強烈的免疫反應(yīng)，但是不能阻止粉棒束孢的快速萌發(fā)而導(dǎo)致幼蟲短期內(nèi)死亡。

關(guān)鍵詞 小金蝠蛾；血細(xì)胞；細(xì)胞免疫；粉棒束孢；冬蟲夏草菌

中圖分類號 Q962 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2023）09-0164-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.040

Abstract ［Objective］ To study the differences in cellular immune responses of the blood cells of the larvae of Thitarodes xiaojinensis to infection by different pathogens，and to reveal the differences in cellular immune responses to the occurrence of Isaria farinosa disease and the formation mechanism of Ophiocordyceps sinensis.［Method］Optical microscopy was used to observe the number，morphological changes，cellular immune responses and melanization reactions of blood cells in the larva of Thitarodes xiaojinensis after infection with pathogenic bacteria were observed，using Ldopa as the substrate，the activity of phenol oxidase in hemolymph after different times of infection was measured by spectrophotometry.［Result］There was no significant difference in the survival curve of the larvae infected with Ophiocordyceps sinensis，and there was no significant immune effect of blood cells on Ophiocordyceps sinensis，such as aggregation，encapsulation and melanization.The activity of phenol oxidase decreased at the initial stage of infection，and then gradually recovered to the level of healthy larvae.There was significant difference in the survival curve of the larvae infected with Isaria farinosa，the blood cells had significant immune responses such as aggregation，encapsulation and melanization in the early stage of infection，the phenol oxidase activity decreased initially and then gradually increased.［Conclusion］The immune defense response strategies of the blood cells of the larvae of Thitarodes xiaojinensis to the pathogenic fungi Ophiocordyceps sinensis and Isaria farinosa had significant differences.The blood cells had no significant immune response to Ophiocordyceps sinensis，and although they had a strong immune response to Isaria farinosa，they cannot prevent the rapid germination of Isaria farinosa，leading to the shortterm death of the larvae.

Key words Thitarodes xiaojinensis;Hemocytes;Cellular immunity;Isaria farinosa;Ophiocordyceps sinensis

基金項目 重慶市自然科學(xué)基金項目（cstc2019jcyj-msxmX0679）;重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項面上項目（CSTB2022TIAD-GPX0067）；重慶市科技局技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項項目（cstc2020jscx-msxmX0102）。

作者簡介 賀元川（1985—），女，四川隆昌人，副研究員，碩士，從事冬蟲夏草的人工培殖與野生撫育研究。*通信作者，研究員，從事冬蟲夏草的培殖、野生撫育及開發(fā)利用研究。

冬蟲夏草是藏區(qū)農(nóng)牧民的主要經(jīng)濟(jì)來源，在經(jīng)濟(jì)和藥用價值上具有重要的地位。冬蟲夏草菌和粉棒束孢是蝙蝠蛾科幼蟲的兩大主要病原真菌，但是致死效率明顯不同。在冬蟲夏草的室內(nèi)培殖中發(fā)現(xiàn)，小金蝠蛾幼蟲若被粉棒束孢病害侵染，則在短期內(nèi)死亡，并快速生長產(chǎn)生孢子繼代傳染，導(dǎo)致病害的暴發(fā)，造成嚴(yán)重的損失［1-2］。冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲后則在其體內(nèi)長期共存，當(dāng)體內(nèi)蟲菌體達(dá)到一定濃度時導(dǎo)致幼蟲僵死，并形成珍稀名貴中藥材冬蟲夏草［3］。昆蟲在長期的自然進(jìn)化中慢慢形成了一套獨特的先天免疫系統(tǒng)，主要通過細(xì)胞免疫和體液免疫共同抵御真菌、細(xì)菌、病毒等外源病原物的入侵。細(xì)胞免疫是昆蟲免疫的首道屏障，血細(xì)胞通過對病原物進(jìn)行吞噬、結(jié)節(jié)及包囊等作用，再通過信號傳遞，激活體液免疫的抗菌肽、溶菌酶、凝集素等細(xì)胞因子的表達(dá)，并配合血細(xì)胞免疫建立一個完整且開放的防御系統(tǒng)［4］。吞噬作用是由單個血細(xì)胞清除入侵病原物和細(xì)胞凋亡殘體的過程，但是不同種類病原物血細(xì)胞的吞噬速度不同［5-8］；結(jié)節(jié)和包囊作用是由血淋巴細(xì)胞在促進(jìn)細(xì)胞黏附的細(xì)胞因子參與下在入侵病原物的表面層聚集形成“鞘”狀結(jié)構(gòu)，使病原物在包囊中窒息而死，或被昆蟲自身產(chǎn)生的免疫相關(guān)因子消滅［9-10］。昆蟲的血細(xì)胞從形態(tài)上區(qū)分，主要包括原血細(xì)胞、漿細(xì)胞、粒細(xì)胞、類絳色細(xì)胞和珠血細(xì)胞。原血細(xì)胞是分化其他幾種血細(xì)胞的干細(xì)胞［10］。漿細(xì)胞和粒細(xì)胞在鱗翅目昆蟲中所占比例最高，是昆蟲細(xì)胞免疫的主力，主要黏附外源刺激物［11］。珠血細(xì)胞主要參與表皮的物質(zhì)運輸，類絳色細(xì)胞中富含酚氧化酶前體，主要參與黑化作用［10，12］。以家蠶為模式生物研究結(jié)果表明，鱗翅目幼蟲感染早期反應(yīng)是血細(xì)胞黏附的激活，導(dǎo)致吞噬作用、結(jié)節(jié)形成，粒細(xì)胞和漿細(xì)胞是參與這些反應(yīng)的血細(xì)胞主要類型［13］。

小金蝠蛾（Thitarodes xiaojinensis）屬于鱗翅目（Lepidoptera）蝙蝠蛾科（Hepialidae）昆蟲，是冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）的優(yōu)勢寄主昆蟲之一［14］，主要分布在四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣，其幼蟲被冬蟲夏草菌成功侵染后將形成名貴中藥材冬蟲夏草，具有抗腫瘤、抗過敏、雙向免疫調(diào)節(jié)等功能［15］，若被粉棒束孢侵染，則會短期內(nèi)死亡，并逐漸感染周圍幼蟲，致使幼蟲的大量死亡。小金蝠蛾幼蟲的血細(xì)胞種類與鱗翅目昆蟲血細(xì)胞的分類基本一致，其中粒細(xì)胞的占比最高。小金蝠蛾幼蟲的血細(xì)胞免疫功能完善，對釀酒酵母的刺激可發(fā)生正常的吞噬和結(jié)節(jié)，對大型的外源物可正常發(fā)生包囊反應(yīng)［16］。針對小金蝠蛾幼蟲的2種常見病原真菌感染短期內(nèi)出現(xiàn)截然不同的后果，目前鮮有文獻(xiàn)報道，關(guān)于小金蝠蛾幼蟲對不同病原真菌的免疫防御的研究仍為空白，為了探索小金蝠蛾幼蟲對不同病原菌感染初期的細(xì)胞免疫差異，該研究主要以6齡小金蝠蛾幼蟲為試驗對象，觀察小金蝠蛾幼蟲對病原真菌感染的細(xì)胞免疫，測定幼蟲血淋巴中參與黑化的酚氧化酶的活性變化，闡述小金蝠蛾幼蟲對不同病原菌感染的免疫防御策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試?yán)ハx。

小金蝠蛾幼蟲為甘孜州康定貢嘎中華蟲草產(chǎn)業(yè)有限公司康定基地室內(nèi)人工繁育的第3代幼蟲，取蛻皮后10 d的6齡小金蝠蛾幼蟲，飼養(yǎng)溫度12～15 ℃，相對濕度60%～80%，以珠芽蓼、鵝絨委陵菜飼喂。

1.1.2 試驗用菌株。

冬蟲夏草菌（Ophiocordyceps sinensis，OS）和粉棒束孢（Isaria farinosa，IF）均由重慶市中藥研究院冬蟲夏草研究所實驗室提供。

1.1.3 主要試劑及器材。

Ringer’s生理鹽水（RS）配制：NaCl 8.05 g、KCl 0.42 g、CaCl2 0.18 g，超純水定容至1 L，pH調(diào)至7.4。過飽和PTU-Ringer’s生理鹽水配制：將過量的苯基硫脲（PTU）加入至Ringer’s生理鹽水（pH 7.4）中，振蕩、溶解后，0.22 μm濾膜過濾后備用。德國徠卡 DM2500P偏光顯微鏡；G0146W酚氧化酶試劑盒，購于江蘇格銳思生物科技有限公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購于NEST公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生存率曲線繪制。

分別將2 μL的Ringer’s生理鹽水（RS）、冬蟲夏草菌（OS）、粉棒束孢（IF）孢子液體注射至健康的6齡小金蝠蛾幼蟲體內(nèi)，并以生理鹽水組的小金蝠蛾幼蟲為對照，將感染組和對照組飼養(yǎng)7 d，每12 h記錄幼蟲的死亡頭數(shù)，計算存活數(shù)，匯總記錄結(jié)果輸入DPS 9.50軟件中，根據(jù)DPS 9.50軟件中專業(yè)統(tǒng)計-生存分析項下的kaplan-Meier模型繪制生存曲線，并使用LogRank檢驗不同處理與生理鹽水對照組之間差異顯著性。

1.2.2 小金蝠蛾幼蟲血常規(guī)涂片制作與觀察。

各取健康的6齡小金蝠蛾幼蟲6頭，剪斷腹足取血淋巴并收集至EP管后，將血淋巴與過飽和PTU-Ringer’s生理鹽水等比混勻后2 μL于載玻片上，并用蓋玻片覆蓋，吸走多余液體，置于光學(xué)相差顯微鏡下觀察各類血細(xì)胞形態(tài)并鑒別，記錄同一視野中各類細(xì)胞的數(shù)量，計算各類細(xì)胞所占百分比。

1.2.3 小金蝠蛾幼蟲血細(xì)胞對病原菌免疫防御觀察。

分別將2 μL的Ringer’s生理鹽水（RS）、1×105 CFU/mL的冬蟲夏草菌（OS）、1×105 CFU/mL的粉棒束孢（IF）注射至健康的6齡小金蝠蛾幼蟲體內(nèi)，觀察感染1 h血細(xì)胞與病原真菌的相互作用，并在1、12、24、48 h后取血淋巴計數(shù)。

1.2.4 小金蝠蛾幼蟲血淋巴中酚氧化酶活力的測定。

分別將2 μL的Ringer’s生理鹽水（RS）、1×105CFU/mL的冬蟲夏草菌（OS）、1×105CFU/mL的粉棒束孢（IF）注射至健康的6齡小金蝠蛾幼蟲體內(nèi)，每次定時（1、4、8、12、24、48、72 h）抽取3頭小金蝠蛾幼蟲，剪斷腹足取血淋巴收集預(yù)先加入苯基硫脲的1.5 mL EP管中防止黑化，4 ℃、4 000 r/min 離心20 min后，取上清作為待測液體，按照酚氧化酶試劑盒的說明書測定血淋巴上清液中酚氧化酶的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小金蝠蛾6齡幼蟲血細(xì)胞種類

小金蝠蛾幼蟲的血細(xì)胞與其他齡翅目昆蟲一致，從形態(tài)上區(qū)分，主要包括粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、類絳色細(xì)胞和珠血細(xì)胞，在6齡幼蟲中未觀察到明顯的原血細(xì)胞（圖1A），與倪若堯等［16］的研究結(jié)果基本一致。粒細(xì)胞被認(rèn)為是主要的免疫細(xì)胞，可對外源入侵的異物進(jìn)行吞噬，而漿細(xì)胞主要對異物進(jìn)行包圍，形成包被組織。

粒細(xì)胞和漿細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)富含黑色的顆粒物，可能參與黑化免疫反應(yīng)［10］。從圖1B可以看出，小金蝠蛾6齡幼蟲粒細(xì)胞所占比例最高，占比為81.59%，其次是漿細(xì)胞（13.47%）和珠血細(xì)胞（3.18%），占比最低的是類絳色細(xì)胞（1.76%），粒細(xì)胞和漿細(xì)胞所占比例高達(dá)95.06%，根據(jù)齡翅目昆蟲血細(xì)胞的分類與功能，推測這2類血細(xì)胞可能也在小金蝠蛾幼蟲血淋巴的細(xì)胞免疫功能中發(fā)揮重要作用［13］。

2.2 小金蝠蛾幼蟲血細(xì)胞對病原真菌的免疫作用

分別統(tǒng)計了小金蝠蛾幼蟲感染病原菌后血細(xì)胞的總數(shù)變化和小金蝠蛾幼蟲體內(nèi)注射病原菌后血細(xì)胞的免疫反應(yīng)。圖2顯示小金蝠蛾幼蟲注射生理鹽水（RS）和冬蟲夏草菌（OS）以后，血細(xì)胞數(shù)量有一個先降低后回升，血細(xì)胞總數(shù)48 h內(nèi)略比健康幼蟲多；但是感染粉棒束孢（IF）后，血細(xì)胞是先快速降低，然后略有回升，但是低于健康幼蟲的血細(xì)胞數(shù)量，最后持續(xù)下降的過程。因該研究采用的注射感染有微小創(chuàng)傷，在1 h略引起了血細(xì)胞的下降，可能與血細(xì)胞參與傷口的修復(fù)有關(guān)。從圖3可以看出，粉棒束孢感染刺激1 h后，可觀察到粉棒束孢被多層血細(xì)胞包被，形成結(jié)節(jié)，并發(fā)生黑化反應(yīng)；冬蟲夏草菌侵染后，血細(xì)胞對冬蟲夏草菌未發(fā)生明顯的吞噬、結(jié)節(jié)等免疫反應(yīng)，可能是因為血細(xì)胞的表面執(zhí)行吞噬反應(yīng)的偽足明顯減少或是模式識別蛋白無法識別［17-18］，但冬蟲夏草菌感染后存活的幼蟲，長時間觀察血細(xì)胞數(shù)量逐漸緩慢減少［3］。對于粉棒束孢，則可觀察明顯的結(jié)節(jié)和黑化現(xiàn)象，這可能是引起早期血細(xì)胞數(shù)量極速減少的原因之一［19］。粉棒束孢侵染的幼蟲的血淋巴體積略有變大，隨著體積的變化，可能導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的滲漏，免疫功能被破壞，導(dǎo)致幼蟲行動變化，隨著時間延長，粉棒束孢在體內(nèi)增殖，血細(xì)胞破裂、減少，粉棒束孢子萌發(fā)菌絲，蟲體死亡。

2.3 小金蝠蛾幼蟲感染不同病原菌的生存曲線比較

為了觀察小金蝠蛾幼蟲對不同病原真菌感染的反應(yīng)，每12 h記錄感染幼蟲的死亡數(shù)量，并繪制了各自的生存曲線，如圖4所示。因采用注射方式快速感染，微小的創(chuàng)傷可能引起少量幼蟲的死亡，但是在肉眼觀察中發(fā)現(xiàn)存活的冬蟲夏草菌感染的幼蟲，體表無任何病征表現(xiàn)，取食正常，與生理鹽水對照無顯著差異。粉棒束孢感染2～3 d后逐漸有病征表現(xiàn)，行動變緩，取食減少，有的幼蟲體表出現(xiàn)黑點或者黑斑，死亡逐漸增加，感染粉棒束孢7 d后小金蝠蛾幼蟲的生存率下降至41.28%，感染粉棒束孢幼蟲的體表特征與呂延華等［20］報道的一致。觀察粉棒束孢感染的死亡幼蟲的血淋巴發(fā)現(xiàn)，粉擬青霉致死的幼蟲體內(nèi)血淋巴有萌發(fā)的粉棒束孢的菌絲。Log-Rank檢驗生理鹽水組幼蟲死亡頭數(shù)的觀察值為2，而粉棒束孢感染組的理論值為9.54，P值<0.01，表明粉棒束孢的死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生理鹽水組；而冬蟲夏草菌感染組幼蟲死亡頭數(shù)的理論值為1.86，P值>0.05，表明冬蟲夏草菌感染組的死亡率與生理鹽水組無顯著差異。

2.4 小金蝠蛾幼蟲酚氧化酶的活性變化

酚氧化酶又稱酪氨酸酶，主要參與昆蟲的調(diào)控細(xì)胞吞噬及黑化等免疫防御過程。酚氧化酶的活性常作為評價昆蟲免疫能力的指標(biāo)。酚氧化酶在外源物的誘導(dǎo)下，通過酚氧化酶原級聯(lián)系統(tǒng)活化酚氧化酶。從圖5可以看出，在注射病原菌早期酚氧化酶的活性均上升，冬蟲夏草菌感染的幼蟲隨酚氧化酶活性下降，最后出現(xiàn)上下波動，波動幅度逐漸縮小至注射前的水平，12 h的快速上升可能與激活表達(dá)有關(guān)；粉棒束孢感染的幼蟲酚氧化酶活性緩慢波動下降后回升，一直處于較高的活力水平，推測幼蟲可能一直處于較強的免疫防御過程，病原真菌的感染是一個長時間的過程，早期酚氧化酶主要參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫防御，后期酚氧化酶調(diào)控體液免疫對菌絲的黑化作用［21］，因此推測粉棒束孢感染后，因無法被血細(xì)胞清理，而萌發(fā)出菌絲，可能激活了體液免疫的黑化作用。

3 討論

冬蟲夏草菌和粉棒束孢是蝙蝠蛾幼蟲的2種重要的病原真菌，但是二者感染蝙蝠蛾幼蟲后，發(fā)病的快慢存在顯著差異。在冬蟲夏草室內(nèi)培殖過程中，通常將快速致死幼蟲的粉棒束孢病原菌列為主要病害之一。該研究從幼蟲細(xì)胞免疫入手，采用注射式的急性感染的方式觀察小金蝠蛾幼蟲血細(xì)胞對2種病原真菌的免疫響應(yīng)差異和對小金蝠蛾幼蟲生存曲線的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞可能無法識別冬蟲夏草菌，而未表現(xiàn)明顯的吞噬和結(jié)節(jié)等免疫反應(yīng)，這可能與冬蟲夏草菌感染小金蝠蛾幼蟲后，會引起血細(xì)胞表面?zhèn)巫愕淖兓瑢?dǎo)致血細(xì)胞缺陷無法將冬蟲夏草菌識別為外源物［17］，冬蟲夏草菌的蟲菌體表面的光滑結(jié)構(gòu)可能缺少被血細(xì)胞模式識別蛋白等結(jié)合的識別受體［3］。粉棒束孢感染小金蝠蛾幼蟲后，雖然可觀察到游離于血淋巴中的結(jié)節(jié)，可見被黑化的粉棒束孢有明顯的結(jié)節(jié)、包被、黑化等免疫響應(yīng)，但是粉棒束孢感染與白僵菌感染家蠶相似，孢子仍可快速萌發(fā)為菌絲，充斥蟲體，甚至從氣孔等處長出菌絲，導(dǎo)致到期內(nèi)幼蟲的致死［19］。雖然該研究觀察到了血細(xì)胞對不同病原菌的免疫防御差異，但是關(guān)于冬蟲夏草菌逃避血細(xì)胞的識別和粉棒束孢子黏附血細(xì)胞的機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

小金蝠蛾幼蟲感染冬蟲夏草菌的生存曲線無顯著差異，而小金蝠蛾幼蟲感染粉棒束孢的生存曲線具有顯著差異。冬蟲夏草菌感染初期，尚未觀察到血細(xì)胞對冬蟲夏草菌有明顯的吞噬、結(jié)節(jié)等免疫防御，酚氧化酶活性侵染初期出現(xiàn)降低，然后逐漸恢復(fù)至健康幼蟲水平，但是未發(fā)現(xiàn)黑化現(xiàn)象，冬蟲夏草菌在幼蟲體內(nèi)以出芽形式繁殖。血細(xì)胞對粉棒束孢具有明顯的吞噬、結(jié)節(jié)和黑化等免疫響應(yīng)，酚氧化酶活性初期降低后逐漸升高，但是不能阻礙粉棒束孢孢子萌發(fā)為菌絲，導(dǎo)致幼蟲的快速死亡。小金蝠蛾幼蟲對不同病原菌的免疫防御為后續(xù)研究冬蟲夏草菌侵染小金蝠蛾幼蟲后逃避免疫的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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