金黃色葡萄球菌感染下骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化形成的影響研究

儀洋洋,劉飛飛,阮玉山,李紹波,張磊,李穎,任莉榮

(大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱外科,云南 大理 671000)

骨髓炎是骨組織以金黃色葡萄球菌為主要病原菌的一種感染性疾病,以嚴(yán)重的炎性反應(yīng)及進(jìn)行性的骨破壞為特征[1],常導(dǎo)致感染性骨缺損、骨不連,是骨科的一大治療難題。目前,關(guān)于炎性骨破壞的具體發(fā)生機(jī)制尚不清楚。骨細(xì)胞作為骨組織內(nèi)數(shù)目最多的細(xì)胞,其由成骨細(xì)胞進(jìn)一步分化而來(lái)。研究發(fā)現(xiàn),骨細(xì)胞可合成分泌許多細(xì)胞因子及信號(hào)分子,來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的活性,在骨重建及骨組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持方面發(fā)揮著極其重要的作用[2]。但骨細(xì)胞在炎性骨破壞發(fā)生機(jī)制中的作用如何,相關(guān)研究甚少。本研究通過(guò)金黃色葡萄球菌感染骨細(xì)胞獲取骨細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM),并使用該條件培養(yǎng)基對(duì)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),觀察破骨細(xì)胞分化形成的情況,并檢測(cè)破骨細(xì)胞分化形成標(biāo)志性基因的表達(dá)情況,探討金黃色葡萄球菌感染下骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化形成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 MLO-Y4細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞系(均購(gòu)于昆明動(dòng)物所),金黃色葡萄球菌(ATCC 4330),磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)及H-DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司),溶菌酶(Solarbio公司),核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)(R&D Systems公司),抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色試劑盒(Sigma公司),RNA抽提試劑盒(Thermo Fisher公司),A PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNase H Plus) 購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司,酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司),CFX96 Real-time System(BIO-RAD公司)。

1.2 金黃色葡萄球菌感染骨細(xì)胞后骨細(xì)胞源性CM的獲得 將MLO-Y4細(xì)胞接種到Ⅰ型膠原涂層板上培養(yǎng)35 d獲得骨細(xì)胞,期間2～3 d換液1次。隨后金黃色葡萄球菌活菌以40∶1的感染復(fù)數(shù)感染骨細(xì)胞4 h,4 h后用溶菌酶滅活細(xì)胞外金黃色葡萄球菌,更換新鮮培養(yǎng)基后,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h,隨后收集培養(yǎng)基獲得骨細(xì)胞源性CM。

1.3 CM對(duì)RAW264.7細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng) 陽(yáng)性對(duì)照組(RANKL組)使用100 ng/mL的RANKL進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組(30%CM組)使用體積分?jǐn)?shù)為30%的CM進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),空白對(duì)照組(PBS組)使用等體積的PBS誘導(dǎo)培養(yǎng)。按實(shí)驗(yàn)分組將RAW264.7細(xì)胞分別接種于96孔板及6孔板,待細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔底約60%更換新鮮培養(yǎng)基。對(duì)應(yīng)孔分別加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液,每2～3 d換液1次,換液后重新加入誘導(dǎo)液。共誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d,5 d后96孔板使用TRAP染色試劑盒染色,6孔板收集細(xì)胞后進(jìn)一步提取RNA行RT-qPCR檢測(cè)。

1.4 TRAP染色 按TRAP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟配制染液并進(jìn)行染色。簡(jiǎn)單步驟為：去離子水清洗2遍,固定液固定細(xì)胞30 s,之后去離子水清洗3遍,加入TRAP染液,避光條件下染色1 h。隨后去離子水再次清洗3遍,加入蘇木素染色1 min,堿性自來(lái)水漂洗4遍后,在倒置相差顯微鏡下觀察,將圖像放大100倍,計(jì)數(shù)每個(gè)視野下破骨細(xì)胞的數(shù)目(破骨細(xì)胞的界定：TRAP染色陽(yáng)性,且細(xì)胞核≥3個(gè))。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集6孔板內(nèi)的RAW264.7細(xì)胞,按GeneJET RNA抽提試劑盒的操作手冊(cè)提取RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(按Takara公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser的操作步驟合成cDNA),并按Takara公司SYBR Premix Ex TaqTM的操作步驟進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。檢測(cè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)情況：TRAP、calcitonin receptor(Cal R)、cathepsin K(Cathe K)及MMP-9,目的基因的表達(dá)量均通過(guò)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,通過(guò)2-ΔΔCt的方法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)使用的引物序列,TRAP：正向(5′-3′)GCGACCATTGTTAGCCACATACG,反向(5′-3′)CGTTGATGTCGCACAGAGGGAT;calcitonin receptor(Cal R)：正向(5′-3′)TGGTGCGGCGGGATCCTATAAGT,反向(5′-3′)AGCGTAGGCGTTGCTCGTCG;cathepsin K(Cathe K)：正向(5′-3′)AGCAGAACGGAGGCATTGACTC,反向(5′-3′)TTTAGCTGCCTTTGCCGTGGC;MMP-9：正向(5′-3′)GCTGACTACGATAAGGACGGCA,反向(5′-3′)GCGGCCCTCAAAGATGAACGG;GAPDH：正向(5′-3′)CCCAGAAGACTGTGGATGG,反向(5′-3′)CAGATTGGGGGTAGGAACAC。

2 結(jié) 果

2.1 TRAP染色結(jié)果 RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后,PBS組基本無(wú)破骨細(xì)胞分化形成,30%CM組及RANKL組均見(jiàn)明顯的破骨細(xì)胞形成(見(jiàn)圖1),圖像放大100倍,每個(gè)視野下破骨細(xì)胞的數(shù)目分別為：PBS組(0.231±0.203)個(gè),30%CM組(19.154±2.115)個(gè),RANKL組(52.000±3.317)個(gè)。各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),30%CM組誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)目明顯多于PBS組,但少于RANKL組。

a 各組破骨細(xì)胞分化形成的情況(TRAP染色) b 各組破骨細(xì)胞分化形成數(shù)目分析

2.2 RT-qPCR結(jié)果 RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后,30%CM組及RANKL組均導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化形成的標(biāo)志性基因：TRAP、calcitonin receptor(Cal R)、cathepsin K(Cathe K)、MMP-9的表達(dá)增高,均高于PBS組(見(jiàn)圖2)。各組間比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

a TRAP的表達(dá)情況 b calcitonin receptor(Cal R)的表達(dá)情況 c cathepsin K(Cathe K)的表達(dá)情況 d MMP-9的表達(dá)情況

3 討 論

正常骨骼為一無(wú)菌的組織,其持續(xù)不斷地進(jìn)行著骨重建,而成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨細(xì)胞則緊密地調(diào)節(jié)著骨的重建過(guò)程。成骨細(xì)胞起源于間充質(zhì)干細(xì)胞,并進(jìn)一步分化成骨細(xì)胞,調(diào)節(jié)骨的形成;而破骨細(xì)胞起源于造血細(xì)胞的單核巨噬細(xì)胞系,調(diào)節(jié)骨的吸收。目前關(guān)于感染性骨缺損、骨不連發(fā)生機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),在骨形成方面,細(xì)菌生物膜及炎性細(xì)胞因子抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力[3],而金黃色葡萄球菌則抑制了成骨細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[4],金黃色葡萄球菌還能通過(guò)金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA)、殺白細(xì)胞素及凝固酶等抑制成骨細(xì)胞對(duì)Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白等的合成[4]。此外,在體內(nèi)及體外的實(shí)驗(yàn)研究中均發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌還可侵入成骨細(xì)胞,進(jìn)而引起成骨細(xì)胞的死亡,而侵入成骨細(xì)胞的金黃色葡萄球菌還可在其內(nèi)存活并增殖,并被認(rèn)為與慢性骨髓炎及復(fù)發(fā)性骨髓炎的發(fā)生有一定關(guān)系[5-6]。在骨吸收方面,金黃色葡萄球菌[7]及其菌壁蛋白(SPA[8]、脂磷壁酸[9-10]、肽聚糖[11-12])均具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化形成、增強(qiáng)骨吸收活性的作用,金黃色葡萄球菌同樣可侵入破骨細(xì)胞,并在破骨細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制[13]。由此可見(jiàn),金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的炎性骨破壞、骨缺損,是其抑制骨形成并促進(jìn)骨破壞增加的共同結(jié)果。

骨細(xì)胞是由成骨細(xì)胞分化而來(lái),占骨骼內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的90%～95%,散落于骨基質(zhì)中。骨細(xì)胞被一個(gè)直徑為15～20 μm的腔隙包圍,骨細(xì)胞的樹(shù)突通過(guò)狹窄的小管穿過(guò)骨基質(zhì)。骨細(xì)胞的腔隙和小管被稱(chēng)為腔隙-小管系統(tǒng)(lacunar-canalicular system,LCS),液體可通過(guò)該系統(tǒng)為骨細(xì)胞提供養(yǎng)分,維持骨細(xì)胞的活性及功能,并通過(guò)該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)。骨細(xì)胞作為一種多功能的信號(hào)感知細(xì)胞,可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的活性,在骨組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持方面發(fā)揮著極其重要的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn),在金黃色葡萄球菌感染下,金黃色葡萄球菌同樣可以侵入骨細(xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存活,且并不引起骨細(xì)胞死亡增加[14]。課題組使用感染復(fù)數(shù)為40∶1對(duì)骨細(xì)胞感染4 h后撤出,細(xì)胞再繼續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程中,細(xì)胞并未發(fā)生凋亡壞死增多的情況,這一結(jié)果與上述結(jié)果一致。但金黃色葡萄球菌感染下,骨細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的影響如何,其是否調(diào)控骨形成及骨破壞,參與炎性骨破壞的病理過(guò)程未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究在金黃色葡萄球菌感染骨細(xì)胞后,骨細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基作用于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),其誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化形成的數(shù)目增多,并導(dǎo)致破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá)增高。提示在金黃色葡萄球菌的感染下骨細(xì)胞可合成分泌一些活性分子促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化形成,導(dǎo)致骨破壞增加,進(jìn)而參與炎性骨破壞的進(jìn)程。但具體的活性成分及其分子機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。并且,骨細(xì)胞源性活性分子的產(chǎn)生,是金黃色葡萄球菌菌壁蛋白、毒力因子或是金黃色葡萄球菌侵入骨細(xì)胞引起,具體機(jī)制如何,仍需進(jìn)一步研究。

破骨細(xì)胞由單核巨噬細(xì)胞系分化而來(lái),是目前已知的唯一具有骨吸收活性的細(xì)胞,在破骨細(xì)胞的分化形成過(guò)程中,巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor,M-CSF)及RANKL起到極其重要的作用,代表了破骨細(xì)胞分化形成的經(jīng)典信號(hào)通路。而其他一些細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-11、LIGHT等,則可替代M-CSF或RANKL來(lái)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化形成,進(jìn)而代表了破骨細(xì)胞分化形成的非經(jīng)典信號(hào)通路[15]。本研究在金黃色葡萄球菌感染骨細(xì)胞后,骨細(xì)胞源性條件培養(yǎng)能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化形成增多,但其培養(yǎng)基內(nèi)起作用的具體成分不得而知,是通過(guò)RANKL的合成增多,再通過(guò)經(jīng)典信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化形成;還是通過(guò)炎性細(xì)胞因子合成增多,如TNF-α、IL-1、IL-6等,再通過(guò)非經(jīng)典信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化形成;或是通過(guò)細(xì)胞外囊泡,攜帶細(xì)胞因子、RNA等來(lái)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化形成;亦或是上述機(jī)制的共同作用,導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化形成的增多,均有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究從骨細(xì)胞的角度出發(fā),探討了金黃色葡萄球菌感染下骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化形成的影響。研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌感染下骨細(xì)胞可合成分泌一些活性分子,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化形成增多。由此提示,在炎性骨破壞的發(fā)生過(guò)程中,除了金黃色葡萄球菌及其菌壁成分直接導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化形成增多外,骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞[16]均可通過(guò)信號(hào)分子促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化形成增多。因此,骨細(xì)胞作為骨組織內(nèi)數(shù)目最多、存活時(shí)間最長(zhǎng)的細(xì)胞,深入探討炎性環(huán)境下骨細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,便于揭示炎性骨破壞的發(fā)生機(jī)制,有望為骨髓炎的治療提供新的思路及靶點(diǎn)。