姚玉榮 霍建飛 貴海燕 郝永娟 楊秀榮 孫淑琴 王萬立
關(guān)鍵詞:水稻穗腐病:分離鑒定:稻黑孢霉:毒力測定
中圖分類號(hào):S435.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2023)03-0148-05
近些年,天津市大力發(fā)展小站稻的種植,天津市農(nóng)委編制出臺(tái)了《天津小站稻振興規(guī)劃方案》,提出到2020年天津市小站稻種植面積穩(wěn)定在5.33萬公頃,2022年達(dá)到6.67萬公頃。隨著水稻種植面積的增大,病害發(fā)生種類和危害程度日益嚴(yán)重,水稻穗腐病對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)有較大影響,主要癥狀為在水稻潁殼上形成褐色斑點(diǎn)。該病在我國主要稻區(qū)均有發(fā)生。黃世文等報(bào)道的引起杭州水稻穗腐病病原菌主要為細(xì)交鏈格孢菌(Alternaria tenuis)、層出鐮刀菌(Fusarium, prolif-eratum,)、新月彎孢菌(Curvularia lunata)及澳大利亞平臍孺孢菌(Bipolaris australiensis)。費(fèi)丹等報(bào)道安徽省水稻穗腐病的病原菌主要有層出鐮刀菌(F.proliferatum)、細(xì)交鏈格孢菌(A.tenuis)、新月彎孢菌(C.lunata)、稻黑孢霉(Nigrosporaoryzae)。胡頌平等研究發(fā)現(xiàn)引起江西地區(qū)水稻穗腐病的主要病原菌為厚垣鐮刀菌(F.chlamydosporum)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima),香茅彎孢菌(C.cymbopogonis)和稻黑孢霉(N.oryzae)兩種病原菌也有發(fā)生,且病原菌種類分布具有明顯的區(qū)域性。馬盾等報(bào)道了新疆水稻穗腐病病原菌主要為層出鐮刀菌(F.prolifera-tum),其次為新月彎孢菌(C.lunata)和細(xì)交鏈格孢菌(A.tenuis);在水稻抽穗前5~7天采用50%咪鮮·稻瘟靈可濕性粉劑稀釋1500倍液、25%咪酰胺乳油稀釋1600倍進(jìn)行噴霧,能夠有效預(yù)防該病害的發(fā)生。2016—2018年陳利軍等明確了河南信陽水稻穗腐病的病原菌種類主要為鐮孢菌(Fusarium, spp.)、細(xì)極鏈格孢(A.tenuissi-ma)、球黑孢菌(N.sphaerica)、稻黑孢霉(N.oryzae)、棒彎孢(C.clavata)、新月彎孢(C.luna-ta)、稻平臍蠕孢(Bipolaris oryzae)和草酸青霉(Penicillium, oxalicum)。由于不同地區(qū)水稻穗腐病病原菌不同,使得該病害防治十分困難。
本研究對(duì)天津水稻主產(chǎn)區(qū)穗腐病病原菌進(jìn)行分離,采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定,并對(duì)病原菌的藥劑敏感性進(jìn)行測定,以期為研究該病原菌的致病機(jī)理、病害流行規(guī)律奠定基礎(chǔ),并為該病害的科學(xué)防治提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
2020、2021年連續(xù)兩年對(duì)天津市寶坻區(qū)八門城村水稻種植田水稻穗腐病病樣進(jìn)行采集,田間癥狀表現(xiàn)為水稻潁殼出現(xiàn)褐色斑點(diǎn),發(fā)病嚴(yán)重時(shí)谷粒干癟、結(jié)實(shí)率降低、稻米畸形。
1.2病原菌的分離與純化
采用常規(guī)組織分離法:將新鮮、發(fā)病的水稻穗沖洗干凈,剪取穗潁殼上病健交界處5 mm節(jié)段,用75%乙醇消毒30 s,無菌水清洗3次,無菌濾紙吸干水分后用鑷子置于含有0.1 g/L氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)平板上,放人28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~4d,待長出菌絲后進(jìn)行單孢純化,保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3病原菌分子鑒定
將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基中,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集菌絲用CTAB法提取總DNA。用真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4(ITSl:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:2×Es Taq Master Mix( Dye)25μL,上下游引物各2μL,DNA模板2μL,ddH2O19μL。擴(kuò)增程序:94℃4 min;94℃ 30 s,58℃30s,72℃ 50 s,共30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送天津金唯智生物科技有限公司測序。測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析。
1.4病原菌室內(nèi)毒力測定
供試藥劑:95.2%苯醚甲環(huán)唑,寧波三江益農(nóng)化學(xué)有限公司:97%戊唑醇,江蘇劍牌農(nóng)藥化工有限公司:95.3%丙環(huán)唑,天津市華宇農(nóng)藥有限公司;95.1%嘧菌酯,利民化工股份有限公司;98%吡唑醚菌酯,陜西美邦農(nóng)藥有限公司;95%咯菌腈,北京燕化永樂農(nóng)藥有限公司:93.4%噻呋酰胺,吉林省八達(dá)農(nóng)藥有限公司;80%代森錳鋅可濕性粉劑,先正達(dá)(蘇州)作物保護(hù)有限公司;75%三環(huán)唑可濕性粉劑,江蘇耘農(nóng)化工有限公司。
病原菌室內(nèi)毒力測定采用菌絲生長速率法。配制系列梯度濃度(100、10、1、0.1μg/mL)的含藥PDA平板,以等體積無菌水為對(duì)照。將直徑5mm的病原菌菌餅接種到上述平板上,每處理3個(gè)重復(fù),恒溫25℃培養(yǎng)4d。采用十字交叉法測定菌落直徑,并計(jì)算抑菌率。
抑菌率(%)=(空白對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/(空白對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100。
1.5數(shù)據(jù)處理
利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)算不同藥劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)、抑制中濃度(EC50值)等。采用MEGA 5.0軟件對(duì)真菌ITS序列進(jìn)行遺傳分析。
2結(jié)果與分析
2.1水稻穗腐病病原菌形態(tài)特征
連續(xù)兩年病原菌分離結(jié)果一致。如圖1所示,分離病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落疏松呈白色,放射狀擴(kuò)展,后期呈墨綠、灰黑色,最后為黑色。菌絲分隔明顯;分生孢子頂生在一個(gè)透明的瓶狀細(xì)胞上,近球形,后期呈黑色,大小為(22.7~30.28)μm×(18.2~25.3)μm。
2.2水稻穗腐病病原菌分子鑒定結(jié)果
通過對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),分離菌株SDSF與稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)的同源性達(dá)100%(圖2),結(jié)合菌株形態(tài)特征,將菌株鑒定為N.oryzae。
2.3水稻穗腐病的抗性
2020年和2021年兩年稻黑孢霉菌株藥劑敏感性測定結(jié)果(表1)顯示,9種殺菌劑中,95%咯菌腈、95.3%丙環(huán)唑?qū)?duì)稻黑孢霉抑菌效果最好,2020年ECso值分別為0.2776、1.3102μg/mL,2021年ECso值分別為0.5171、2.0188μg/mL;98%吡唑醚菌酯、93.4%噻呋酰胺對(duì)稻黑孢霉抑菌效果較好,且兩個(gè)藥劑抑菌效果相當(dāng);80%代森錳鋅可濕性粉劑抑菌效果差異較大,2020年EC50值為8.0151μg/mL,2021年EC50值為24.6704μg/mL;95.2%苯醚甲環(huán)唑、97%戊唑醇及95.1%嘧菌酯對(duì)稻黑孢霉的抑菌效果均較差;75%三環(huán)唑可濕性粉劑對(duì)稻黑孢霉無抑制作用。
3討論與結(jié)論
本研究首次確定引起天津水稻主產(chǎn)區(qū)穗腐病的病原菌為稻黑孢霉(N.oryzae),與臺(tái)蓮梅、胡頌平、費(fèi)丹等報(bào)道的稻黑孢霉是引起黑龍江、江西、安徽水稻穗腐病的主要病原菌之一結(jié)果相一致,今后在生產(chǎn)中應(yīng)加強(qiáng)稻黑孢霉的監(jiān)控和防治。除水稻穗腐病外,稻黑孢霉(N.oryzae)還會(huì)引起葉斑病、穗梗腐病、鞘枯病。
本試驗(yàn)中的苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、丙環(huán)唑、三環(huán)唑均為三唑類殺菌劑,能夠抑制孢子萌發(fā)和附著孢形成,阻止病菌侵入和減少孢子的產(chǎn)生。稻黑孢霉對(duì)丙環(huán)唑的敏感性較高,EC50值分別為1.3102μg/mL和2.0188μg/mL;其次為苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇,兩個(gè)藥劑的抑菌效果相當(dāng);由于生產(chǎn)中水稻稻瘟病的防治藥劑主要為三環(huán)唑,導(dǎo)致該病原菌抗性強(qiáng),不適宜作為稻黑孢霉引起的水稻穗腐病防治的候選藥劑。嘧菌酯和吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑,作用機(jī)理主要是通過阻止細(xì)胞色素間的電子傳遞,阻止三磷酸腺苷的形成,從而抑制線粒體的呼吸,達(dá)到殺菌的作用。本試驗(yàn)中吡唑醚菌酯對(duì)稻黑孢霉的抑菌效果好于嘧菌酯,這可能與生產(chǎn)中藥劑使用頻率相關(guān)??┚鏋楸交量╊悮⒕鷦饕ㄟ^抑制病原菌葡萄糖磷?;霓D(zhuǎn)移,抑制病原菌的正常生長和代謝,導(dǎo)致病菌死亡:同時(shí)還能阻礙蛋白質(zhì)與核酸的合成及細(xì)胞正常生物氧化過程,該藥劑對(duì)稻黑孢霉抑菌效果顯著,EC50值<1μg/mL,生產(chǎn)中推薦使用。噻呋酰胺是新型的噻唑酰胺類殺菌劑,通過抑制病原真菌三羥酸循環(huán)中的琥鉑酸脫氫酶,抑制病原菌的正常生長。代森錳鋅可濕性粉劑為一種廣譜保護(hù)性殺菌劑,作用機(jī)理為抑制病原菌細(xì)胞內(nèi)丙酮酸氧化。噻呋酰胺與代森錳鋅可濕性粉劑對(duì)稻黑孢霉抑菌效果相當(dāng)。馮愛卿等測定了10種殺菌劑對(duì)稻黑孢霉的敏感性,其中10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、25%吡唑醚菌酯乳油及50%咯菌腈可濕性粉劑對(duì)稻黑孢霉菌的抑制效果最好。李戌清等研究發(fā)現(xiàn)75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、325g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑、250g/L嘧菌酯懸浮劑對(duì)稻黑孢霉菌菌絲生長有較好的抑制作用。
綜上,咯菌腈和丙環(huán)唑?qū)Φ竞阪呙挂志Ч詈茫浯螢檫吝蛎丫ズ袜邕货0?,?種殺菌劑均可作為生產(chǎn)中防治稻黑孢霉的候選藥劑。80%代森錳鋅可濕性粉劑兩年的抑菌效果差異較大。苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇及嘧菌酯由于在生產(chǎn)中使用較為頻繁,效果略差;75%三環(huán)唑?qū)Φ竞阪呙篃o抑制作用。本試驗(yàn)為天津地區(qū)由稻黑孢霉引起的水稻穗腐病的防治提供了一定的科學(xué)依據(jù)。