盧伊娜 劉玉晨 張文環(huán) 熊玥

[摘要]目的：通過(guò)研究刺山柑果提取物（Capparis spinosa fruit extract，CS）對(duì)干燥皮膚的改善作用，來(lái)探討CS在皮膚護(hù)理中的作用，同時(shí)闡述其對(duì)于皮膚絲聚蛋白通路的調(diào)控機(jī)理。方法：于干燥皮膚上，通過(guò)多功能皮膚探頭、皮膚膠帶取樣，檢測(cè)不同濃度CS即時(shí)使用和持續(xù)使用下，皮膚含水量、經(jīng)表皮失水率（Trans-epidermal water loss，TEWL）、鱗屑占比的變化。同時(shí)于低濕度環(huán)境培養(yǎng)下的重組表皮模型上，采用免疫熒光染色、CCK-8染色、高效液相法，分析CS對(duì)于絲聚蛋白降解相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果：5% CS在使用后4 h可顯著提升皮膚含水量，改善皮膚鱗屑占比。使用后7 d，1%、5% CS也可顯著提升皮膚含水量，降低TEWL，改善皮膚鱗屑占比。3% CS涂抹于低濕度處理下的重組表皮模型上，4 h時(shí)可提升半胱天冬酶14、博來(lái)霉素水解酶表達(dá)量，促進(jìn)吡咯烷酮羧酸（Pyrrolidone carboxylic acid，PCA）形成。24 h時(shí)改善細(xì)胞活力和皮膚結(jié)構(gòu)，恢復(fù)皮膚含水量。結(jié)論：CS可通過(guò)調(diào)控絲聚蛋白通路來(lái)改善皮膚干燥狀態(tài)，短時(shí)促進(jìn)絲聚蛋白降解形成PCA，長(zhǎng)效改善皮膚結(jié)構(gòu)完整性和屏障功能。

[關(guān)鍵詞]刺山柑果提取物；絲聚蛋白；皮膚含水量；經(jīng)表皮失水率；吡咯烷酮羧酸；皮膚屏障

[中圖分類號(hào)]R322.99? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）03-0066-04

Abstract： Objective? By studying the improvement effect of Capparis spinosa fruit extract （CS） on dry skin， the role of CS in skin care was discussed， and its mechanism on the filaggrin pathway was described. Methods? On dry skin， multi-probe and skin tape were used to detect the changes of skin hydration， trans-epidermal water loss （TEWL） and scale ratio under immediate and continuous use the different concentrations of CS. On the recombinant epidermis model cultured under a low humidity environment， immunofluorescence staining， CCK-8 staining and high performance liquid phase methods were used to analyze the effect of CS on the degradation of filaggrin. Results? 5% CS could significantly increase skin hydration and improve the proportion of skin scales 4 hours after use. 7 days after use， 1% and 5% CS can also significantly increase skin hgdration， reduce TEWL， and improve the proportion of skin scales. Applying 3% CS to the recombinant epidermis model under low humidity can increase the expression of caspase 14 and bleomycin hydrolase and promote the formation of pyrrolidone carboxylic acid （PCA） at 4 h. CS improves cell viability and skin structure and restores skin hgdration within 24 hours. Conclusion? CS can improve skin dryness by regulating the filaggrin pathway， to promote the degradation of filaggrin into PCA in a short time， and improve skin structural integrity and barrier function in a long-term.

Key words： capparis spinosa fruit; filaggrin; skin hydration; TEWL; PCA; skin barrier function

皮膚屏障功能可使體內(nèi)各種組織和器官免受機(jī)械性、物理性、化學(xué)性及生物性等損害侵襲和防止機(jī)體內(nèi)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水分、電解質(zhì)的喪失，正常的皮膚含水量為20%～35%。皮膚含水量較低時(shí)，角質(zhì)層呈現(xiàn)干燥狀態(tài)，鱗屑增多，而皮膚缺水可能會(huì)導(dǎo)致皮膚屏障功能紊亂[1]。絲聚蛋白（Filaggrin，F(xiàn)LG）作為角化包膜的重要組成蛋白，具有智能調(diào)控的功能。絲聚蛋白原（pro-FLG）在顆粒層合成，經(jīng)過(guò)一系列水解后可形成FLG單體，與兜甲蛋白、角蛋白等共同形成角化包膜，維持角質(zhì)層完整性[2-4]。角質(zhì)層內(nèi)的FLG又可在半胱天冬酶14、博來(lái)霉素水解酶和鈣蛋白酶等的作用下被分解成游離的氨基酸形成天然保濕因子（Natural moisturizing factor， NMFs），如吡咯烷酮羧酸（PCA）、尿刊酸等，來(lái)調(diào)節(jié)皮膚水合功能[5-6]。在低濕度環(huán)境下，F(xiàn)LG降解相關(guān)酶活性在一定時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)，以形成更多的NMFs來(lái)抵抗干燥對(duì)皮膚的影響。

刺山柑（Capparis Spinosa），主要分布在中國(guó)新疆和甘肅西部的戈壁沙地。其果實(shí)中含有黃酮、多酚、生物堿、皂苷、多糖和蛋白質(zhì)等成分，具有抗氧化、降血糖、抗肝炎、抗菌及抗炎抗過(guò)敏等多種功效[7-9]，但其作用于皮膚，特別是對(duì)于干燥皮膚的改善作用并未見(jiàn)報(bào)道。本研究將復(fù)合酶提取和固相萃取除雜技術(shù)應(yīng)用于刺山柑果活性成分的分離、純化，最終獲得了富含生物堿的刺山柑果提取物（CS），通過(guò)干燥皮膚、重組表皮模型來(lái)研究其效果及作用機(jī)理。

1? 材料和方法

1.1 CS制備：將刺山柑果粉碎后，按1：5加入水中提取2 h，復(fù)合酶酶解后濾袋過(guò)濾。再依次使用硅藻土、聚酰胺樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂進(jìn)行固相萃取除雜，膜過(guò)濾后將所得濾液用溶劑再次溶解，即得。CS總生物堿含量大于1.0%。

1.2 試劑：①PCA標(biāo)準(zhǔn)品（上海彩水實(shí)業(yè)有限公司）；②重組表皮模型Skinovo-Epi、表皮檢測(cè)試劑盒（杭州捷諾飛生物科技股份有限公司）；③半胱天冬酶14抗體（Abcam公司）；④CCK-8溶液、博來(lái)霉素水解酶試劑盒（博士德生物）。

1.3 儀器：①CM-825皮膚水分測(cè)試探頭﹑TM-300皮膚水分散失測(cè)試探頭、Visioscan VC98、皮膚脫屑膠帶及MPA 6主機(jī)（德國(guó)CK公司）；②Hydration水分測(cè)試探頭（丹麥Cortex公司）；③多功能酶標(biāo)儀FC、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司）；高效液相儀（HPLC，安捷倫公司）；④熒光顯微鏡（萊卡公司）。

1.4 干燥皮膚試驗(yàn)：于干燥皮膚上分別進(jìn)行即時(shí)使用和持續(xù)使用測(cè)試。選擇小腿部位有一定皮屑的干燥皮膚受試者18名，男女不限。測(cè)試期間溫度為（20±2）℃，相對(duì)濕度為30%～60%。用Hydration水分測(cè)試探頭檢測(cè)皮膚含水量，分別重復(fù)3次，得出其平均值[10-11]。

1.4.1 即時(shí)使用測(cè)試：于小腿一側(cè)標(biāo)記3個(gè)區(qū)域，面積為3 cm×3 cm，分別為未處理組（空白組）﹑1%和5%的CS組 （樣品組），按（2.0±0.1）mg/cm2的用量涂抹一次后，應(yīng)用Hydration水分測(cè)試探頭檢測(cè)使用后4 h各個(gè)區(qū)域的皮膚含水量，同時(shí)采用皮膚脫屑膠帶于同一部位剝離4次，采用Visioscan VC98拍攝分析皮膚鱗屑占比[12]。

1.4.2 持續(xù)使用測(cè)試：于小腿另一側(cè)進(jìn)行。按每次2～3泵的用量每天早晚使用2次后，應(yīng)用Hydration、TM-300測(cè)試探頭分別檢測(cè)使用后7 d各個(gè)區(qū)域的皮膚含水量、TEWL，采集皮膚膠帶分析鱗屑占比。各指標(biāo)變化率通過(guò)以下公式計(jì)算：

變化率=測(cè)試指標(biāo)樣品組/測(cè)試指標(biāo)空白組×100%－100%

1.5 重組表皮模型試驗(yàn)[5，13]：將重組表皮模型轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每空700μl，于培養(yǎng)箱中孵育24 h。將CS配制成1%、3%濃度，取25 μl滴加于表皮模型表面，均勻涂抹，分別置于高濕度環(huán)境（100%＞濕度＞80%，含水盤(pán)）、低濕度環(huán)境（20%＜濕度＜40%，不含水盤(pán)），于37℃、5% CO2下繼續(xù)培養(yǎng)4 h、24 h，每組6復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)液采用博來(lái)霉素水解酶試劑盒進(jìn)行含量檢測(cè)。

采用CM-825皮膚探頭對(duì)重組表皮模型的皮膚含水量進(jìn)行檢測(cè)，再每孔加入200μl含CCK-8的染液，37℃孵育40 min，取出染液于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度，檢測(cè)細(xì)胞活力變化。皮膚切片進(jìn)行HE染色。

1.6 免疫熒光染色試驗(yàn)[14]：采用免疫熒光染色法對(duì)重組表皮模型冰凍切片的半胱天冬酶14含量進(jìn)行檢測(cè)。冰凍切片于室溫晾干15～30 min，PBS輕洗2次，每次5 min。加入含0.5% Triton X-100的PBS溶液通透作用15 min后，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h。每張切片加入50μl半胱天冬酶14一抗溶液，4℃孵育過(guò)夜。再加入50μl熒光二抗溶液室溫孵育1 h。每張切片加入50μl含有細(xì)胞核染料4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）的封片劑，避光風(fēng)干后，于正置熒光顯微鏡上拍照。采用Image軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

1.7 PCA含量檢測(cè)試驗(yàn)[15]：采用HPLC分析法對(duì)PCA含量進(jìn)行檢測(cè)。于重組表皮模型中加入200μl 0.5%的Triton X-100溶液，裂解后備用。采用HPLC進(jìn)樣20μl進(jìn)行PCA檢測(cè)，其中色譜柱為ZORBAX SB-C18，流動(dòng)相為甲醇︰0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液＝2：98，檢測(cè)時(shí)間10 min，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PCA含量，變化率計(jì)算如前所述。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Prism軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。以P＜0.05為差異顯著，以P＜0.01、P＜0.001為差異極其顯著。

2? 結(jié)果

2.1 即時(shí)使用下CS對(duì)干燥皮膚的改善作用：使用4 h后，相比于空白組，5% CS處理組皮膚含水量呈現(xiàn)上升，變化率達(dá)到29.9%（P＜0.01）。1%、5% CS處理下，3～5級(jí)的鱗屑總占比從14.2%分別下降至12.4%、8.1%，變化率分別為-12.6%、-42.8%（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 持續(xù)使用下CS對(duì)干燥皮膚的改善作用：在持續(xù)使用7 d后，相比于空白組，1%、5% CS處理組皮膚含水量均上升，變化率分別達(dá)到17.8%（P＜0.001）、38.3%（P＜0.001）；TEWL顯著下降，變化率分別達(dá)到-18.2%（P＜0.01）、-30.5%（P＜0.01）；鱗屑總占比也下降，3～5級(jí)鱗屑總占比分別從14.8%下降至13.6%、12.2%，降低了8.1%、17.6%（P＜0.05）。皮膚鱗屑拍照?qǐng)D顯示，1%、5% CS處理下，大鱗屑（淺綠色代表3級(jí)、黃色代表4級(jí)、紅色代表5級(jí)）數(shù)量明顯下降，與分析結(jié)果一致。見(jiàn)圖2～3。

2.3 CS對(duì)低濕度處理下重組表皮模型的作用：采用低濕度培養(yǎng)重組表皮模型模擬干燥環(huán)境，研究CS改善皮膚干燥的作用機(jī)理。首先檢測(cè)低濕度培養(yǎng)4 h下CS對(duì)重組表皮模型結(jié)構(gòu)和組織活力的影響。低濕度培養(yǎng)4 h時(shí)，與高濕度組相比，皮膚結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化。培養(yǎng)24 h時(shí)，角質(zhì)層明顯增厚，表皮層變薄，CCK-8染色結(jié)果顯示細(xì)胞活力下降，皮膚含水量也顯著降低。說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)干燥環(huán)境下可影響皮膚組織結(jié)構(gòu)，降低皮膚含水量。而1%、3% CS同步處理24 h時(shí)，CCK-8染色液吸光度值從0.3上升至0.5（P＜0.05）、0.6（P＜0.001），分別增長(zhǎng)了68.3%、105.8%，皮膚含水量從11.7 AU上升至53.6 AU（P＜0.001）、52.7 AU（P＜0.001），且角質(zhì)層厚度也降低，接近于高濕度培養(yǎng)下的表皮模型對(duì)照。見(jiàn)圖4～5。

2.4 CS對(duì)重組表皮模型FLG降解的作用：再檢測(cè)CS對(duì)重組表皮模型促進(jìn)FLG降解成NMFs的關(guān)鍵酶及NMFs代表性成分PCA表達(dá)量的影響。低濕度培養(yǎng)4 h時(shí)，與高濕度組相比，半胱天冬酶14總熒光強(qiáng)度降低，但博來(lái)霉素水解酶表達(dá)量從82.3 pg/ml上升至100.8 pg/ml，PCA含量從38.1μg/ml上升至54.9μg/ml，說(shuō)明較短時(shí)的干燥環(huán)境可影響FLG降解相關(guān)酶的活性，促進(jìn)NMFs的形成。而3% CS同時(shí)處理下，半胱天冬酶14的熒光強(qiáng)度明顯上升，變化率達(dá)到56.6%（P＜0.01），博來(lái)霉素水解酶表達(dá)量上升至115.6 pg/ml（P＜0.05），PCA含量上升至53.4 μg/ml（P＜0.05），說(shuō)明CS在低濕度下處理4 h，可通過(guò)上調(diào)半胱天冬酶14、博來(lái)霉素水解酶的表達(dá)，促進(jìn)FLG降解，產(chǎn)生PCA。低濕度培養(yǎng)24 h時(shí)，半胱天冬酶14、博來(lái)霉素水解酶、PCA表達(dá)量與高濕度相比均升高，而3% CS處理組變化均不明顯，但其可改善細(xì)胞活性。見(jiàn)圖6～7。

3? 討論

刺山柑果提取物對(duì)于干燥皮膚的作用及其機(jī)理并無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究前期在對(duì)保濕相關(guān)成分進(jìn)行篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)水蘇堿為甜菜堿結(jié)構(gòu)類似物，具有即時(shí)提升皮膚含水量的效果。通過(guò)對(duì)不同來(lái)源富含水蘇堿的植物進(jìn)行保濕驗(yàn)證得知，采取復(fù)合酶提取和固相萃取除雜工藝的刺山柑果提取物生物堿提取率最高，且即時(shí)提升皮膚含水量的效果最強(qiáng)。因此，最終選用此特定工藝下的刺山柑果提取物進(jìn)行深入研究。

首先于人體干燥皮膚上驗(yàn)證使用CS不同時(shí)間后的改善作用。結(jié)果表明，5%的CS即時(shí)使用和持續(xù)使用，均可顯著提升皮膚含水量，降低皮膚鱗屑總占比。于重組皮膚模型上處理4 h時(shí)，未發(fā)現(xiàn)CS對(duì)角質(zhì)層具有剝脫作用。同時(shí)在持續(xù)使用7 d時(shí)發(fā)現(xiàn)，5% CS可顯著降低TEWL。通過(guò)以上結(jié)果，再結(jié)合文獻(xiàn)[16-18]，推測(cè)CS可作用于FLG合成與降解通路，調(diào)控皮膚狀態(tài)。

Cau L等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在相對(duì)濕度為30%～50%的培養(yǎng)條件下，重組表皮模型呈現(xiàn)出角質(zhì)層變厚、透明角質(zhì)顆粒增多的結(jié)構(gòu)變化，且經(jīng)表皮失水率和角質(zhì)層pH值降低，NMFs量增加。這些結(jié)果表明FLG水解程度在干燥處理下增加，參與FLG分解的活性酶如肽基-精氨酸脫亞胺酶活性增強(qiáng)。因此，本研究選擇將重組表皮模型進(jìn)行干燥培養(yǎng)來(lái)模擬皮膚干燥的過(guò)程，闡述CS對(duì)FLG降解的影響。研究結(jié)果表明，與低濕度組相比，3% CS處理下，4 h時(shí)促進(jìn)半胱天冬酶14、博來(lái)霉素水解酶的表達(dá)，提升皮膚組織中PCA的含量。在24 h時(shí)，低濕度處理組FLG的降解增多，但組織活力顯著下降，角質(zhì)層增厚，表皮層變薄。而CS處理組FLG降解未見(jiàn)明顯變化，但組織活力、角質(zhì)層厚度、表皮層厚度均有改善，皮膚含水量也顯著升高。

對(duì)受試者以皮膚含水量80 AU、肉眼可見(jiàn)明顯脫屑為界限分成干燥組和較干燥組，再次進(jìn)行分析可知，1%、5% CS對(duì)干燥組的改善效果整體強(qiáng)于較干燥組，推測(cè)CS不僅靶向FLG合成與降解的調(diào)控，還可對(duì)不同干燥人群分級(jí)調(diào)控，改善不同情況下的皮膚干燥問(wèn)題。

綜上，刺山柑果提取物可作用于FLG的調(diào)控通路，在4 h時(shí)主要促進(jìn)FLG降解，增加PCA含量，在24 h時(shí)主要改善皮膚組織活力和組織結(jié)構(gòu)，來(lái)提升皮膚含水量、降低TEWL，改善皮膚干燥狀態(tài)。

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[收稿日期]2022-04-20

本文引用格式：盧伊娜，劉玉晨，張文環(huán)，等.刺山柑果提取物改善皮膚干燥的機(jī)理研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2023，32（3）：66-70.