付鑫琳 朱杰 郭江 文利新 譚國華 劉楊 馬海明

摘? 要：為探討抗病力相關基因天然抗性相關巨噬蛋白1（natural resistance associated macrophage protein 1，Nramp1）在安慶六白豬上的遺傳多態(tài)性，本研究利用PCR-RFLP檢測該基因HinfⅠ位點的多態(tài)性；結果表明：安慶六白豬Nramp1基因A/B位點的A基因和B基因頻率分別為0.40和0.60，這表明安慶六白豬Nramp1基因的B等位基因為優(yōu)勢等位基因。本研究為安慶六白豬抗病力性狀的深入研究打下了基礎。

關鍵詞：豬；Nramp1基因；抗病力性狀；安慶六白豬

天然抗性相關巨噬蛋白1（natural resistance associated macrophage protein 1，Nramp1）對巨噬細胞的抗菌活性有調(diào)節(jié)作用，同時能抑制多種胞內(nèi)病原體，如牛結核分枝桿菌、沙門菌和利什曼原蟲等的侵染和易感[1]。動物的Nramp1基因主要在吞噬細胞，如巨噬細胞和多形核白細胞及外周血細胞中特異性表達[2]，可提高動物機體的固有免疫力，影響宿主對多種胞內(nèi)寄生病原微生物的早期免疫反應，而且對多種傳染性疾病和自身免疫性疾病的抗性具有非特異性[3]，在豬選種育種過程中是提高綜合抗病力性狀的分子遺傳標記位點之一[4]。安慶六白豬具有抗病力強的特性，屬于肉脂兼用型地方豬種。本研究利用PCR-RFLP對安慶六白豬Nramp1基因的HinfⅠ位點進行多態(tài)性分析，以期為安慶六白豬抗病力性狀的深入研究打下基礎。

1? 材料與方法

1.1 試驗樣本

應用隨機抽樣法，采集108個安慶六白豬耳組織樣本。

1.2 PCR-RFLP引物設計

根據(jù)發(fā)表在GenBank數(shù)據(jù)庫中的豬Nramp1基因全長序列，通過Primer premier 5.0軟件設計安慶六白豬通用引物，上游引物為5-TCT CCA CAT CCT CTG TGG CAA-3，下游引物為5-ATG GAG AGT GGT AAC TGC CGT-3，擴增目的片段的長度為504 bp，引物由北京三博生物工程有限公司合成。

1.3 PCR擴增

使用特異性引物對樣本DNA進行PCR擴增。25 μL PCR反應體系：ddH2O 17 μL，基因組DNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，dNTP（10 mmol/L） 2 μL，10×buffer 2.5 μL，Tap DNA聚合酶 1 μL，MgCl2 0.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.4 PCR產(chǎn)物酶切反應

20 μL酶切反應體系：PCR反應產(chǎn)物? ? ?5 μL，內(nèi)切酶HinfⅠ 0.7 μL，10×酶切緩沖液2.0 μL，加ddH2O補足。37 ℃水浴反應16 h，用核酸染料染色的2.0％瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行鑒定，凝膠成像系統(tǒng)觀察成像，根據(jù)限制性酶切圖譜中的特征條帶確定并記錄每份樣本的基因型。

2? 結果與分析

用2％瓊脂糖凝膠電泳對所獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，獲得的產(chǎn)物與目標片段大小一致，并且產(chǎn)物條帶穩(wěn)定性和特異性較高，清晰，無雜帶，可直接用于酶切分析。

當存在酶切位點時，內(nèi)切酶HinfⅠ可特異性地將504 bp片段切為332 bp和172 bp兩個片段。將酶切產(chǎn)物通過2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測分型，共檢測出AA基因型（504 bp），BB基因型（332 bp、172 bp）和AB基因型（504 bp、332 bp、172 bp）（圖1）。

安慶六白豬Nramp1基因的基因型頻率及等位基因頻率見表1。從表1可知，B等位基因為優(yōu)勢等位基因，有望作為遺傳標記。

3? 討論

畜禽抗病力性狀是一個既受數(shù)量基因調(diào)控，又受環(huán)境因素影響的復雜的閾性狀，由于其表型的遺傳規(guī)律不服從孟德爾遺傳定律，且呈非連續(xù)性變異，利用常規(guī)的表型選擇來獲得理想的改良進展比較困難。因此，利用分子遺傳標記輔助育種，可以有效促進畜禽抗病力性狀的固定[5]。本研究通過對安慶六白豬Nramp1基因多態(tài)性的分析，發(fā)現(xiàn)B基因為優(yōu)勢等位基因，有可能作為影響畜禽抗病力性狀的候選基因標記位點，為豬的抗病力性狀選育積累了有益的資料。

參考文獻

[1] CELLIER M， GOVONI G，VIDAL S，et al．Human natural resistance-associated macrophage protein： cDNA cloning， chromosomal mapping， genomic organization， and tissue-specific expression[J]．Journal of Experimental Medicine，1994，180（5）：1741-1752.

[2] 張斌，韓敏，相德才，等．滇陸豬Nramp1基因多態(tài)性對其在組織中表達的影響[J]．南方農(nóng)業(yè)學報，2020，51（1）：202-208.

[3] 相德才，張斌，劉邵娜，等．迪慶藏豬Nramp1基因第二內(nèi)含子和第二外顯子多態(tài)性位點遺傳分析[J]．養(yǎng)豬，2020（2）：60-62.

[4] SUN H S，WANG L，ROTHSCHILD M F，et al．Mapping of the natural resistance-associated macrophage protein 1 （NRAMP1） gene to pig chromosome 15[J]．Animal Genetics，1998，29（2）：138-140.

[5] 付保強，彭帥，顧亞榮，等．豬Nramp1基因內(nèi)含子6的SNP多態(tài)性分析[J]．現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2018（10）：21-24.