杜亞杰 張煜泓 李世訪 朱英波 張志想

摘要 蘋果銹果類病毒apple scar skin viroid（ASSVd）引起蘋果銹果病，是限制我國蘋果生產(chǎn)的重要因素之一。然而，目前對ASSVd全球種群的組成及遺傳變異仍缺乏足夠的了解。為此，本研究對GenBank中登錄的212條基因組序列進(jìn)行了比較、變異分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析。確認(rèn)ASSVd的種群符合準(zhǔn)種模式，由165種序列相似但不相同的變體組成。以來自我國蘋果的MW315909和MW302328為代表的兩種變體的數(shù)量最多，是主流變體。依據(jù)參考序列（NC001340）分析堿基變異，發(fā)現(xiàn)堿基變異偏好于某種堿基，并且偏好于基因組上的一些特定位點(diǎn)。變異不僅發(fā)生在基因組二級結(jié)構(gòu)的左末端區(qū)、致病區(qū)、中央?yún)^(qū)，也發(fā)生在可變區(qū)和右末端區(qū)。值得指出的是，基因組上有4個(gè)區(qū)域極少發(fā)生變異，為保守區(qū)。其中的兩個(gè)保守區(qū)（末端保守區(qū)和中央保守區(qū)）是已知的，而在可變區(qū)與右末端區(qū)交界處的兩個(gè)保守區(qū)是新發(fā)現(xiàn)的，它們對ASSVd的復(fù)制和移動可能具有重要作用。這些結(jié)果不僅有助于掌握ASSVd的發(fā)生及流行，而且為研發(fā)RT-PCR/qPCR檢測技術(shù)提供了參考，為研究ASSVd與寄主的相互作用提供了線索。

關(guān)鍵詞 蘋果;?類病毒;?種群;?遺傳變異;?變異

中圖分類號： S 436.611.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021656

Abstract Apple scar skin viroid （ASSVd） is the causal agent of apple scar skin disease and is a major pathogen limiting apple production in China. However， the composition and genetic variation of the global population of ASSVd remain unclear. Here， we aligned 212 genome sequences of ASSVd retrieved from GenBank and analyzed their genetic variation and phylogenetic relationships. The global population of ASSVd fitted the model of quasispecies. It consisted of 165 highly related but nonidentical variants with two master variants represented by MW315909 and MW302328 from apple in China. In addition， genetic variation analysis based on the reference sequence （NC001340） showed obvious bias towards certain bases for mutation types and towards several certain positions for the distribution of mutations on the genome. Mutations occurred not only in terminal left （TL）， pathogenicity （P）， and central （C） regions in the secondary structure of ASSVd， but also in variant （V） and terminal right （TR） regions. It should be noted that there were four conserved regions in the secondary structure of ASSVd， two of which， terminal conserved region （TCR） and central conserved region （CCR）， are known and the other two located in the junction of V and TR regions are new. The two new conserved regions may play important roles in ASSVd replication and movement. Together， these results are helpful for understanding the occurrence and epidemic of ASSVd， and provides a reference for developing detection technology of RT-PCR/qPCR and new clues for studying the interactions between ASSVd and its hosts.

Key words apple;?viroid;?population;?genetic variation;?variation

蘋果銹果類病毒（apple scar skin viroid， ASSVd）是蘋果銹果病的病原［1］。侵染蘋果后可在果實(shí)上引起銹果和花臉等癥狀，使果實(shí)產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣。除蘋果外，還可侵染梨［2］、杏［3］、桃［4］和櫻桃［5］等果樹。ASSVd是限制我國蘋果主產(chǎn)區(qū)，尤其是北方產(chǎn)區(qū)蘋果生產(chǎn)的主要因素之一［1，6］。近年來，其發(fā)生面積不斷擴(kuò)大，危害也日趨嚴(yán)重［7］。山東［8-10］、陜西［11］和河北［7］等地常有發(fā)生及危害的報(bào)道。在陜西咸陽，‘富士蘋果上ASSVd的檢出率高達(dá)65.2%［6］。在山東煙臺，2007年－2008年約有11%的果園發(fā)生ASSVd［12］;2018年的檢測發(fā)現(xiàn)，病株率為27.7%［10］。ASSVd引起的銹果病已成為煙臺蘋果種植區(qū)的主要病害［10，12-13］。因此，需要重視對ASSVd的防控。

ASSVd的防控需要明確其種群組成及遺傳變異。同馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科Pospiviroidae的其他成員類似［14］，ASSVd在復(fù)制過程中易產(chǎn)生變異。這意味著ASSVd種群由多種基因組序列互不相同的個(gè)體，即變體組成。這些變體在種群中的數(shù)量不同。數(shù)量多，在種群中比例高的變體通常被稱為主流變體，是防控的重點(diǎn)。明確了主流變體后，需要進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測。最常用的技術(shù)是RT-PCR/qPCR［15-17］，其關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)。引物要盡可能匹配種群的不同變體，尤其是主流變體，這就需要了解變體的遺傳變異。

雖然已有許多ASSVd種群和遺傳變異分析的報(bào)道，但是仍無針對全球種群的分析。早期的一些研究［18-22］受測序技術(shù)和成本的限制，樣本數(shù)量少，獲得的基因組序列也較少。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，雖然獲得的基因組序列數(shù)量有所增加［5，23-24］，多的達(dá)210條［25］，但序列大多來自一個(gè)國家或地區(qū)的一個(gè)寄主，難以從全球?qū)用媪私釧SSVd的種群組成和遺傳變異。本研究基于GenBank中來自不同國家和地區(qū)、不同寄主的ASSVd的基因組序列，進(jìn)行了序列比對、變異分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了全球ASSVd的種群組成、主流變體、遺傳變異的特征及規(guī)律，為ASSVd的防控和基礎(chǔ)研究提供了重要參考。

1?材料與方法

1.1?材料

GenBank中登錄的ASSVd全基因組序列共215條（截至2021年6月22日）。其中，MG546298未說明來源，只表明實(shí)驗(yàn)室寄主為動物細(xì)胞;KP772687和KP772685與其余序列的序列相似性低于70%，不符合類病毒種劃分的標(biāo)準(zhǔn)［26］，不是ASSVd的序列。去除這3條序列，剩余212條序列，其中參考序列為NC001340。

1.2?方法

1.2.1?序列比對及相似性分析

使用軟件SDT 1.2比較兩兩序列之間的相似性［27］。雖然該軟件不計(jì)算堿基的插入缺失對相似性的影響，但是使用DANMAN驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，ASSVd基因組中插入缺失的堿基數(shù)量少，不影響計(jì)算結(jié)果。

1.2.2?種群組成分析

為找出相同的序列，根據(jù)大小將212條序列分類，然后使用SDT 1.2計(jì)算各類序列相互之間的相似性。相同的序列記為同一種變體，主流變體用M1和M2表示，由此可得出212條序列的變體種類及每種變體包含的序列數(shù)量，即種群組成。

1.2.3?堿基變異分析

以參考序列NC001340為依據(jù)，使用軟件Cluxtal X2比對這212條序列。利用軟件BioEdit［28］分析堿基變異。為保證變異的真實(shí)性，只選擇至少在兩條序列中重復(fù)出現(xiàn)的變異。堿基的位置以參考序列為準(zhǔn)。變異分析包括：1） 變異的種類及其數(shù)量。種類包括堿基替換（包括轉(zhuǎn)換和顛換）和插入缺失，數(shù)量指在所有序列中出現(xiàn)的次數(shù)，或包含該變異的序列的數(shù)量;2）變異的頻率，指包括該變異的序列的數(shù)量與所有序列數(shù)量的百分比;3）變異的選擇，主要是ASSVd二級結(jié)構(gòu)（見1.2.4）對變異的選擇作用。將變異逐一標(biāo)注在ASSVd的二級結(jié)構(gòu)上，看其分布情況。

1.2.4?二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)最小自由能（ΔG）原理，使用RNAfold（http：∥www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php）預(yù)測ASSVd參考基因組（NC001340）的二級結(jié)構(gòu)。使用軟件Rnaviz 2.0.3，并參考Giguere等通過SHAPE（selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension）技術(shù)測定的ASSVd（來源于日本的M36646）的二級結(jié)構(gòu)［29］，對預(yù)測的結(jié)構(gòu)進(jìn)行編輯。

1.2.5?系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用鄰接法，使用軟件MEGA X［30］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用自展法（重復(fù)1 000次）評估構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。使用最大似然法計(jì)算遺傳距離。將與ASSVd同屬的蘋果凹果類病毒（apple dimple fruit viroid， ADFVd）的參考序列（NC003463）作為外類群。

2?結(jié)果與分析

2.1?ASSVd的基因組序列

本研究使用的212條ASSVd基因組序列來自8個(gè)國家（表1）。中國的最多，為112條，隨后依次為印度35條；希臘30條；韓國18條；伊朗13條;日本2條;美國與加拿大各1條。寄主主要是蘋果（113條），隨后依次為櫻桃（18條）、海棠（17條）和梨（15條）。另外，寄主未知的有10條序列。

序列長度為315～340 nt，主要是330 nt和331 nt，數(shù)量分別為74條和66條，占總數(shù)的66.0%。329 nt和334 nt的序列數(shù)量較少，分別有23條和12條。其余大小的數(shù)目均不足10條。說明ASSVd的基因組大小較穩(wěn)定。

2.2?ASSVd序列的相似性

這212條序列兩兩之間的相似性絕大部分大于80%。進(jìn)一步分析可知，這212條序列中，有些序列相同。如以MW315909為代表的11條序列，記為變體M1;以MW302328為代表的9條序列，記為變體M2（表2）。此外，分別比較不同國家的序列，發(fā)現(xiàn)同一國家的序列之間的相似性與不同國家的序列之間的相似性沒有明顯的差異。

2.3?全球ASSVd的種群結(jié)構(gòu)

根據(jù)序列相似性分析結(jié)果，將相同序列歸入同一種變體，共得到165種變體。由它們的頻率（每種變體包含的序列數(shù)量占序列總數(shù)量的百分率）分布可知，全球ASSVd的種群結(jié)構(gòu)符合準(zhǔn)種模式。絕大部分變體（149種）的頻率較低（0.47%），即只有1條序列;僅有16種變體的頻率高于0.47%，即至少含有2條序列。頻率最高的2種變體分別含有11條和9條序列，來自于中國、希臘、印度和韓國的蘋果或梨（表2），是全球范圍內(nèi)流行的主流變體。

2.4?中國ASSVd的種群結(jié)構(gòu)

這212條ASSVd序列有一多半（112條，占52.8%）來自中國。來自中國的序列包含93種變體，種群結(jié)構(gòu)與全球ASSVd的種群結(jié)構(gòu)類似。絕大多數(shù)變體（86種）的頻率很低（0.89%），即只有1條序列;僅有7種變體的頻率高于0.89%，即至少含有2條序列。頻率最高的2種變體分別包含8條和6條序列，均來自蘋果（表2），但來自不同地區(qū)，包括山東、遼寧、新疆和河南，是中國流行的主流變體。值得指出的是，這兩種變體與全球流行的兩種主流變體相同。

2.5?ASSVd種群中的變異

與164種變體相比，參考序列中有多半的位點(diǎn)發(fā)生了變異，包括堿基插入（13個(gè)位點(diǎn)），堿基缺失（35個(gè)位點(diǎn)）以及堿基替換（178個(gè)位點(diǎn)）（表3）。堿基轉(zhuǎn)換的4種類型發(fā)生的位點(diǎn)數(shù)量無明顯差異，為18～21。而堿基顛換的不同類型發(fā)生的位點(diǎn)數(shù)量差異較大，為7～18。CA顛換發(fā)生最多，TG顛換發(fā)生最少。表明ASSVd種群中的變異具有明顯的偏好性。

計(jì)算ASSVd種群（212條序列）中不同變異發(fā)生的次數(shù)發(fā)現(xiàn)，堿基轉(zhuǎn)換中的嘧啶間轉(zhuǎn)換的次數(shù)（374次）稍多于嘌呤間轉(zhuǎn)換的次數(shù)（339次）。堿基顛換中的GT顛換和AT顛換的次數(shù)較多，分別為236次和176次;而TG顛換和CG顛換的次數(shù)較少，分別只有29次和38次。進(jìn)一步說明ASSVd種群中的變異具有堿基偏好性。

2.6?變異在ASSVd基因組上的分布及其頻率

從圖1可知，變異在ASSVd基因組上的分布不均勻。有的連續(xù)10多個(gè)位點(diǎn)均產(chǎn)生了變異，如40－55 nt和250－270 nt;也有連續(xù)多個(gè)位點(diǎn)嚴(yán)格保守，如180－193 nt。這應(yīng)該是選擇的結(jié)果。選擇壓力可能來自與寄主的相互作用或者來自基因組的二級結(jié)構(gòu)（見2.7）。此外，不同變異的頻率（種群中含有該變異的序列的數(shù)量所占的百分比）差異較大。多數(shù)變異的頻率低于25%，即含有該變異的序列少于50條;而個(gè)別變異的頻率較高，頻率最高的兩個(gè)變異（第125位和126位之間插入G，219位和220位之間插入U(xiǎn)）的頻率分別為97.2%和57.5%，即含有這兩個(gè)變異的序列分別有206條和122條（圖1）。

含有上述頻率最高的兩個(gè)變異的序列，除來自蘋果外，還有桃、杏、海棠和櫻桃等。說明這兩個(gè)變異具有廣泛的寄主適應(yīng)性。此外，有些變異表現(xiàn)出寄主特異性。如第2位點(diǎn)的G變?yōu)閁和第173位點(diǎn)的A變?yōu)镚的變異只出現(xiàn)在梨樹的序列中，第55位點(diǎn)的A變?yōu)镚、第145及146位點(diǎn)間插入C以及第196位點(diǎn)的C變?yōu)閁的突變僅出現(xiàn)在櫻桃的序列中。

2.7?二級結(jié)構(gòu)對變異的選擇

ASSVd基因組（參考序列NC001340）的二級結(jié)構(gòu)整體上呈棒狀（圖2），左末端的上、下兩側(cè)各有一個(gè)凸出的小發(fā)夾。由雙鏈結(jié)構(gòu)（連續(xù)的堿基對）和環(huán)狀（上下兩側(cè)均有未配對堿基）或凸起（僅上側(cè)或下側(cè)有未配對堿基）結(jié)構(gòu)相互間隔構(gòu)成?；蚪M中的一多半堿基（共220個(gè)，占66.9%）互補(bǔ)配對。對變異在二級結(jié)構(gòu)上的分布進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)雙鏈結(jié)構(gòu)對變異具有明顯的選擇作用。首先，雙鏈結(jié)構(gòu)中變異發(fā)生的頻率明顯低于環(huán)狀結(jié)構(gòu)?；パa(bǔ)配對的堿基發(fā)生變異的次數(shù)為1 326次，未配對堿基發(fā)生變異的次數(shù)為1 156次，各自除以相應(yīng)的堿基數(shù)目（分別為220個(gè)和109個(gè)）可知，互補(bǔ)配對堿基發(fā)生變異的頻率為6.02次/堿基，明顯低于未配對堿基（10.61次/堿基）。其次，保持堿基互補(bǔ)配對的變異更易于被保留下來。例如第167位堿基A，雖然可變?yōu)镚、U或C中的任意一個(gè)，但只有變?yōu)镚才不改變與第156位U的配對。實(shí)際上，A變?yōu)镚的頻率最高，為14.7%（31/211），A變?yōu)閁和A變?yōu)镃的頻率分別只有3.3%（7/211）和1.4%（3/211）。類似的變異也發(fā)生在第43、48、61、74、244、264、277等位置。此外，存在共突變。如第32位的C變?yōu)閁，與此同時(shí)，與其配對的第293位的G變?yōu)榱薃。這一共突變存在于9條序列中（HQ326087， HQ326088， HQ326090－HQ326092， HQ326094， HQ326095， HQ326098， KM213397）。第159位（G變?yōu)閁）和第163位（C變?yōu)锳）的共突變出現(xiàn)于另外4條序列（FJ974100， FJ974073， FJ974091， FJ974092）中。

除堿基互補(bǔ)配對的雙鏈結(jié)構(gòu)外，二級結(jié)構(gòu)中的一些結(jié)構(gòu)功能區(qū)對變異也有選擇作用。從圖2可知，二級結(jié)構(gòu)上存在4個(gè)變異較少的區(qū)域，即保守區(qū)。其中，兩個(gè)是已知的，分別為末端保守區(qū)（terminal conserved region， TCR）和中央保守區(qū)（central conserved region， CCR），它們在類病毒復(fù)制過程中具有重要功能;另外兩個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的，在106－119位點(diǎn)處和179－198位點(diǎn)處，分別命名為可變保守區(qū)（variable conserved region， VCR）和右端保守區(qū)（right conserved region， RCR）。

2.8?ASSVd的系統(tǒng)發(fā)育分析

構(gòu)建由165種ASSVd變體的序列以及外類群ADFVd組成的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中，包括兩種主流變體和參考序列（NC001340）在內(nèi)的77條序列聚在一起，且所在分支的自展值低于60%。為便于呈現(xiàn)結(jié)果，將這77條序列所在分支合并為一個(gè)分支，以黑色圓點(diǎn)表示（圖3）。其余的88種變體中，有些來自某一個(gè)國家或某一種寄主的變體聚在一起，表現(xiàn)出明顯的地理特異性和寄主特異性。例如從中國的桃和杏分離的變體。此外，也有來自不同國家或寄主的變體聚在一起，如從印度蘋果上分離的變體（AM993160）與中國杏樹上分離的變體聚在一起，從中國蘋果或海棠上分離的變體與從伊朗的梨或蘋果上的分離的變體也聚在一起。說明存在著地區(qū)間以及寄主間的傳播。

3?結(jié)論與討論

本研究通過分析GenBank中來自于8個(gè)國家的212條ASSVd基因組序列，明確了全球ASSVd種群的組成結(jié)構(gòu)以及遺傳變異的特點(diǎn)和規(guī)律。種群符合準(zhǔn)種模式［36］，由165種序列高度相似但不相同的變體組成，有兩個(gè)主流變體。種群中的變異明顯受到了選擇，因?yàn)闊o論是堿基變異的類型，還是變異在基因組及二級結(jié)構(gòu)上的分布，均具有明顯的偏好性。

以我國蘋果上的兩條序列MW315909和MW302328為代表的兩種變體，是我國種群以及全球種群的主流變體。其發(fā)生分布廣泛，遍布于不同國家，包括中國、韓國、印度和希臘，以及中國的不同產(chǎn)區(qū)。需要指出的是，這兩種變體并非是所有自然種群的主流變體。例如，李紫騰等［25］從7個(gè)不同品種的蘋果上獲得17種變體，除MH105034外，都不是這兩種主流變體。遺傳漂變、傳播過程中的瓶頸效應(yīng)以及寄主的選擇等均會影響自然種群的組成。盡管如此，嚴(yán)密監(jiān)測這兩個(gè)主流變體的發(fā)生和分布，可快速掌握ASSVd的流行和傳播。

這兩個(gè)主流變體與參考序列（NC001340）［19］并不相同。與參考序列相比，均在第125位和126位之間插入了G;此外，一種主流變體在第219位和220位之間插入了U，249位置的G變?yōu)榱薝。其中，G和U插入的頻率很高，出現(xiàn)在種群中的大多數(shù)變體中。需要指出的是，這兩個(gè)變異并非最近才出現(xiàn)，因?yàn)榕c參考序列同時(shí)期被測定的日本分離物的序列Y00435和M36646［37］以及加拿大分離物的序列X71599［18］，在第125位和126位之間也插入了G，而日本的兩條序列在第219位和220位之間也插入了U。盡管如此，早期測定的序列在近幾年出現(xiàn)的頻率很低，只分離到與加拿大分離物相同的3條序列MN598208［38］，MH105028和MH105020［25］，且均非主流變體。說明一些變異的頻率是動態(tài)變化的，而這種變化可能與ASSVd對環(huán)境或寄主的適應(yīng)性有關(guān)。

雖然朱慧［38］，查富蓉［39］，陳冉冉等［40］和李紫騰等［25］的研究已發(fā)現(xiàn)了很多變異，但大多位于基因組二級結(jié)構(gòu)的左末端區(qū)、致病區(qū)和中央?yún)^(qū)。除上述3個(gè)區(qū)，我們在可變區(qū)和右末端區(qū)也發(fā)現(xiàn)了很多變異。

一方面是因?yàn)槲覀兪褂昧烁嗟男蛄?，尤其是國外的序?再者是因?yàn)樗玫膮⒖夹蛄胁煌?，如查富蓉?9］和李紫騰等［25］以分離物中的主流序列或共有序列作為參考，我們則使用ASSVd的參考序列。

變異分析發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新保守區(qū)（VCR和RCR），分別位于可變區(qū)以及可變區(qū)與右末端區(qū)的交界處。如果不是RNA聚合酶的保真性在這兩個(gè)區(qū)域具有偏好性［41］，那么就意味著這兩個(gè)區(qū)域可能具有重要功能，比如與類病毒的重組［42-44］或移動［45］有關(guān)。這兩個(gè)新保守區(qū)的發(fā)現(xiàn)為研究ASSVd與寄主的相互作用提供了線索，也為設(shè)計(jì)能夠涵蓋更多變體的RT-PCR/qPCR檢測技術(shù)提供了參考。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）